JP7460978B2 - β－グルコシダーゼを生産する微生物及び該β－グルコシダーゼを生産する微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法。 - Google Patents
β－グルコシダーゼを生産する微生物及び該β－グルコシダーゼを生産する微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法。 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7460978B2 JP7460978B2 JP2021074485A JP2021074485A JP7460978B2 JP 7460978 B2 JP7460978 B2 JP 7460978B2 JP 2021074485 A JP2021074485 A JP 2021074485A JP 2021074485 A JP2021074485 A JP 2021074485A JP 7460978 B2 JP7460978 B2 JP 7460978B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucosidase
- microorganism
- strain
- produces
- thermophilic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 title claims description 63
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 title claims description 59
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 45
- 241000520824 Thermobrachium celere Species 0.000 claims description 26
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 25
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 25
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 17
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 9
- IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 4-nitrophenyl beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 8
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 8
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 4
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000598346 Thermobrachium celere DSM 8682 Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007208 ytg medium Substances 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241001429558 Caldicellulosiruptor bescii Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241001626433 Thermobrachium Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QSUILVWOWLUOEU-GOVZDWNOSA-N 4-nitrophenyl beta-D-glucuronide Chemical compound O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 QSUILVWOWLUOEU-GOVZDWNOSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000193833 Bacillales Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 241000152015 Caldicellulosiruptor obsidiansis Species 0.000 description 1
- 241000178335 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 229920000324 Cellulosome Polymers 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206211 Fervidobacterium islandicum Species 0.000 description 1
- 241000185788 Fervidobacterium riparium Species 0.000 description 1
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000750436 Herbivorax saccincola Species 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012952 Resampling Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000589887 Spirochaeta thermophila Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241001147776 Thermoanaerobacter cellulolyticus Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 241000193445 [Clostridium] stercorarium Species 0.000 description 1
- 241001147802 [Clostridium] stercorarium subsp. thermolacticum Species 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLMQHZPGHAPYIO-UHFFFAOYSA-L azanium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;iron(2+) Chemical compound [NH4+].[Fe+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O GLMQHZPGHAPYIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 210000000166 cellulosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000004313 iron ammonium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000000011 iron ammonium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、セルロース系バイオマスを原料にする糖化技術に係り、特に、酸、アルカリ、酵素を用いることなく、微生物培養によりセルロース系バイオマスを糖化する方法に関する。また、本発明は、セルロース系バイオマスの糖化に用いることのできる好熱性微生物由来のβ-グルコシダーゼ及び、該β-グルコシダーゼをコードする遺伝子に関する。
稲わら、籾殻、キノコ廃床、堆肥、木材チップ等のセルロース系バイオマスを原料とするグルコース等の単糖を得るための糖化技術が、食糧生産を圧迫しないエネルギーの生産技術として注目されている。しかし、セルロース系バイオマスは、でん粉に比べて糖化技術の難易度が高い。これは、セルロース系バイオマスの構成主体であるセルロースが堅固な結晶構造を持つ難分解性の高分子多糖であることによる。
セルロース系バイオマスをセルロースへと分解する方法（以下、「セルロース分解」という）には、物理的分解、化学的分解及び酵素分解の３つの方法がよく知られている。
セルロース系バイオマスをセルロースへと分解する方法（以下、「セルロース分解」という）には、物理的分解、化学的分解及び酵素分解の３つの方法がよく知られている。
物理的分解処理法はボールミルや振動ミル又は蒸煮爆砕や加圧熱水処理など物理的に糖化を施す処理が存在するが、一般的に、化学的分解や酵素分解の前処理として併用されることが多い。
化学的分解法は、アルカリ、酸を利用するものが知られているが、古くより酸分解がよく用いられている。酸分解には濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがあるが、何れも硫酸を用いるため、廃棄物処理や環境負荷の低減を必要とし、低コスト化及びエネルギー変換効率に限界があるといわれている。
化学的分解法は、アルカリ、酸を利用するものが知られているが、古くより酸分解がよく用いられている。酸分解には濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがあるが、何れも硫酸を用いるため、廃棄物処理や環境負荷の低減を必要とし、低コスト化及びエネルギー変換効率に限界があるといわれている。
酵素分解法は、セルロース分解酵素（主にセルラーゼ）によりセルロース分解を行うものである。酵素による分解は、酸分解に比べ廃液回収や処理の負担が軽く、耐薬設備等の設備コストを低減できること、過分解が起こらずに糖の収率が高い等の利点があるため、澱粉質を多く含むバイオマスの酵素糖化で実用化されている。
ところが、セルロース系バイオマスは、前述したように、セルロースが結晶構造を有していること及び結晶性セルロースをヘミセルロースやリグニンが取り囲んだ複雑な構造を有しているため、でん粉系に比べ、酵素による分解がきわめて困難であり、かつ、セルロース分解酵素を大量に必要としていた。
ところが、セルロース系バイオマスは、前述したように、セルロースが結晶構造を有していること及び結晶性セルロースをヘミセルロースやリグニンが取り囲んだ複雑な構造を有しているため、でん粉系に比べ、酵素による分解がきわめて困難であり、かつ、セルロース分解酵素を大量に必要としていた。
また、好熱嫌気性細菌であるClostridium thermocellum又は由来の酵素を用いた、セルロース系バイオマスのセルロース分解が知られている。
このような方法により得られたセルロースは、β-グルコシダーゼにより更なる分解を経て、グルコース等の単糖へと変換されることになる。
本発明者らは先に、β-グルコシダーゼの存在下でClostridium thermocellumを培養して、セルロース系バイオマスをワンステップで糖化するBSES法を提案している（特許文献１参照）。
特許文献１は、好熱嫌気性微生物によるセルロース系バイオマスのセルロース分解と、得られたセルロースをβ-グルコシダーゼで単糖類に分解する反応とを好熱嫌気性微生物の培養条件下で同時に行う糖化方法を開示する。この方法では、好熱嫌気性微生物の培養条件が高温であるため、高温でも不活化しないβ-グルコシダーゼが求められており、これが実用化の障害となっていた。
本発明者らは、Clostridium thermocellumと共存して増殖可能な微生物を用いて糖化する方法を検討していたところ、高温の培養条件でも菌体外にβ－グルコシダーゼを分泌できる好熱性微生物を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、セルロース系バイオマスの存在下、セルロース分解能を有する好熱性微生物とβ－グルコシダーゼを生産する好熱性微生物とを培養することで、セルロース系バイオマスを糖化させる、セルロース系バイオマスの糖化方法である。
本発明の糖化方法では、特許文献１で用いられるβ－グルコシダーゼに代えて、本発明者らが新たに単離したβ－グルコシダーゼを生産するThermobrachium celere KM-A9株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）を用いる。
本発明の糖化方法では、特許文献１で用いられるβ－グルコシダーゼに代えて、本発明者らが新たに単離したβ－グルコシダーゼを生産するThermobrachium celere KM-A9株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）を用いる。
本発明の糖化方法を用いることにより、セルロース系バイオマスを微生物だけで糖化することが可能となる。
本発明は、セルロース系バイオマスの存在下、セルロース分解能を有する好熱性微生物とβ-グルコシダーゼを生産する好熱性微生物とを培養することで、セルロース系バイオマスを糖化する方法である。
ここで、セルロース分解能を有する好熱性微生物とは、セルロース系バイオマスを分解できる微生物（以下、セルロース系バイオマス分解微生物という）であって、たとえば、至適培養温度が５０℃以上の微生物が好ましく、糖質分解酵素を生産する好熱性微生物であればよく、望ましくは、酸素の存在下で生育できる好熱性の通性嫌気性微生物又は好熱嫌気性微生物である。
セルロース分解能を有する好熱通性嫌気性微生物には、例えば、Geobacillus、Thermus、ThermotogaやBacillales（バシラス目）に属するBacillus、Paenibacillusが挙げられる。
ここで、セルロース分解能を有する好熱性微生物とは、セルロース系バイオマスを分解できる微生物（以下、セルロース系バイオマス分解微生物という）であって、たとえば、至適培養温度が５０℃以上の微生物が好ましく、糖質分解酵素を生産する好熱性微生物であればよく、望ましくは、酸素の存在下で生育できる好熱性の通性嫌気性微生物又は好熱嫌気性微生物である。
セルロース分解能を有する好熱通性嫌気性微生物には、例えば、Geobacillus、Thermus、ThermotogaやBacillales（バシラス目）に属するBacillus、Paenibacillusが挙げられる。
セルロース分解能を有する好熱嫌気性微生物としては、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・ステコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム・サーモラクティカム（Clostridium thermolacticum）、カルディセルロシルプター・サッカロリティカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）、カルディセルロシルプター・ベシー（Caldicellulosiruptor bescii）、カルディセルロシルプター・オブシヂアンシス（Caldicellulosiruptor obsidiansis）、サーモアナエロバクター・セルロリティクス（Thermoanaerobacter cellulolyticus）、アナエロセーラム・サーモフィリム（Anaerocellum thermophilum）、スピロチャタ・サーモフィラ（Spirochaeta thermophila）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、フェルビドバクテリウム・リパリウム（Fervidobacterium riparium）、フェルビドバクテリウム・イスランディカム（Fervidobacterium islandicum）、ハービボラックス・サクシノコラ（Herbivorax saccincola）やカピリバクテリウム・サーモキチニコラ（Capillibacterium thermochitinicola）を挙げることができる。
セルロース分解能を有する好熱嫌気性微生物は、好ましくは、セルロソームを生産する微生物である。このような微生物として、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）を挙げることができる。
セルロース分解能を有する好熱嫌気性微生物は、好ましくは、セルロソームを生産する微生物である。このような微生物として、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）を挙げることができる。
セルロース分解能を有する好熱性微生物と共培養して糖化を行うためには、β-グルコシダーゼを生産し分泌する好熱性微生物が必要であるが、これまでセルロース分解能を有する好熱性微生物とマッチング可能なβ-グルコシダーゼを生産し分泌する好熱性微生物は知られていなかった。これは、公知のスクリーニング方法で用いるスクリーニング試薬が熱に弱いため、好熱性条件下の培養ではβ-グルコシダーゼを生産し分泌する好熱性微生物を探索することができなかったことが技術的な背景にある。
本発明では、スクリーニング試薬としてエスクリンを用いる。エスクリンはβ-グルコシダーゼにより分解されると、エスクリチンとなり、鉄の存在下で焦茶色を呈することが知られており、好熱性条件下の培養でもβ-グルコシダーゼを生産し分泌する好熱性微生物を効率的に探索することができる。
以下に、β－グルコシダーゼを生産し、分泌する好熱性微生物として、Thermobrachium属微生物を例に本発明の糖化方法を具体的に説明するが、本発明のエスクリンを用いたスクリーニングを適用して、さらに適切なβ－グルコシダーゼを生産し分泌する好熱性微生物を選択することが可能であることから、これに限定されないことは明らかである。
なお、β－グルコシダーゼを生産し、分泌する好熱性微生物は、至適培養温度が５０℃以上の微生物が好ましく、望ましくは、Thermobrachium celere KM-A9株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）である。なお、Thermobrachium属微生物は、水素生産菌として知られている。
なお、β－グルコシダーゼを生産し、分泌する好熱性微生物は、至適培養温度が５０℃以上の微生物が好ましく、望ましくは、Thermobrachium celere KM-A9株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）である。なお、Thermobrachium属微生物は、水素生産菌として知られている。
（実施例１）
（β-グルコシダーゼを生産する微生物の探索）
β-グルコシダーゼ生産菌を検索するために、土壌、農産廃棄物等からエスクリンを基質に利用する分離方法を試みた。エスクリンはβ-グルコシダーゼにより分解されると、エスクリチンとなり、鉄の存在下で焦茶色を呈することが知られている。
タイ国のキングモンクット工科大学トンブリ校のパイロットプラント開発訓練研究所から採取した土壌から得られた８００近くのサンプルを、エスクリチンを用いたスクリーニングで探索したところ、焦茶色を示す好熱嫌気性細菌（Thermobrachium celere KM-A9株（国際受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）と命名）を発見した。
具体的には、スクリーニングにあたり、p-ニトロフェノール-β-D-グルコシド(pNPG)と、収集した各サンプルの約１ｇとを、５ｇ／Ｌのセロビオースを含むBM7CO培地に直接接種した。BM7CO培地は、２．９ｇK2HPO4、１．５ｇKH2PO4、２．１ｇ尿素、６．０ｇ酵母エキス、４．０ｇ Na2CO3、０．０１ｇ CaCl2.2H2O、０．５ｇシステイン-HCl、０．０００５ｇレサズリン、及び２００μＬミネラル溶液から構成されている。なお、ミネラル溶液は、リットルあたり２５．０ｇのMgCl2.6H2O、３７．５ｇのCaCl2.2H2O、及び０．３１２ｇのFeSO4.7H2Oで構成されていた。
接種後、培養物を６０℃で２から３日間インキュベートした。そして、培養サンプルを５ｇ／Ｌセロビオースを含むBM7CO培地に２４時間培養した。なお、BM7CO培地は、沸騰水で脱気した後、高純度の二酸化炭素と窒素ガスをそれぞれバブリングしてから、嫌気的にハンゲートチューブに分配した。
次いで、８０００rpm、４℃、１０分間の遠心分離で得られたサンプルの培養上清を使用し、p-ニトロフェノール-β-D-グルコシド（pNPG）を基質としてβ-グルコシダーゼ活性を測定した。
高いβ-グルコシダーゼ活性を示す培養サンプルを選択し、同じ培養条件を使用して数回継代培養を繰り返した。その後、高いβ-グルコシダーゼ活性を示し続ける培養サンプルを、嫌気性ハンゲートロールチューブ技術による細胞外β-グルコシダーゼ生産嫌気性細菌の単離のために選択した。選択した培養物を段階希釈し、炭素源として５ｇ／Ｌセロビオースを使用し、１ｇ／Ｌエスクリンと２．５ｇ／Ｌクエン酸鉄アンモニウムを添加した溶融BM7CO寒天培地に注入した。
β-グルコシダーゼ活性を持つコロニーは、コロニーの周りに暗褐色のハローが形成される。エスクリンの分解により大きな暗褐色のハローを生成する個々のコロニーをロールチューブから収集し、セロビオースを含むBM7CO培地に接種し培養した。得られた培養物を、エスクリンとクエン酸鉄アンモニウムを添加したセロビオース培地での単一コロニー分離手順を１０回繰り返し、微生物を単離した。
（β-グルコシダーゼを生産する微生物の探索）
β-グルコシダーゼ生産菌を検索するために、土壌、農産廃棄物等からエスクリンを基質に利用する分離方法を試みた。エスクリンはβ-グルコシダーゼにより分解されると、エスクリチンとなり、鉄の存在下で焦茶色を呈することが知られている。
タイ国のキングモンクット工科大学トンブリ校のパイロットプラント開発訓練研究所から採取した土壌から得られた８００近くのサンプルを、エスクリチンを用いたスクリーニングで探索したところ、焦茶色を示す好熱嫌気性細菌（Thermobrachium celere KM-A9株（国際受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）と命名）を発見した。
具体的には、スクリーニングにあたり、p-ニトロフェノール-β-D-グルコシド(pNPG)と、収集した各サンプルの約１ｇとを、５ｇ／Ｌのセロビオースを含むBM7CO培地に直接接種した。BM7CO培地は、２．９ｇK2HPO4、１．５ｇKH2PO4、２．１ｇ尿素、６．０ｇ酵母エキス、４．０ｇ Na2CO3、０．０１ｇ CaCl2.2H2O、０．５ｇシステイン-HCl、０．０００５ｇレサズリン、及び２００μＬミネラル溶液から構成されている。なお、ミネラル溶液は、リットルあたり２５．０ｇのMgCl2.6H2O、３７．５ｇのCaCl2.2H2O、及び０．３１２ｇのFeSO4.7H2Oで構成されていた。
接種後、培養物を６０℃で２から３日間インキュベートした。そして、培養サンプルを５ｇ／Ｌセロビオースを含むBM7CO培地に２４時間培養した。なお、BM7CO培地は、沸騰水で脱気した後、高純度の二酸化炭素と窒素ガスをそれぞれバブリングしてから、嫌気的にハンゲートチューブに分配した。
次いで、８０００rpm、４℃、１０分間の遠心分離で得られたサンプルの培養上清を使用し、p-ニトロフェノール-β-D-グルコシド（pNPG）を基質としてβ-グルコシダーゼ活性を測定した。
高いβ-グルコシダーゼ活性を示す培養サンプルを選択し、同じ培養条件を使用して数回継代培養を繰り返した。その後、高いβ-グルコシダーゼ活性を示し続ける培養サンプルを、嫌気性ハンゲートロールチューブ技術による細胞外β-グルコシダーゼ生産嫌気性細菌の単離のために選択した。選択した培養物を段階希釈し、炭素源として５ｇ／Ｌセロビオースを使用し、１ｇ／Ｌエスクリンと２．５ｇ／Ｌクエン酸鉄アンモニウムを添加した溶融BM7CO寒天培地に注入した。
β-グルコシダーゼ活性を持つコロニーは、コロニーの周りに暗褐色のハローが形成される。エスクリンの分解により大きな暗褐色のハローを生成する個々のコロニーをロールチューブから収集し、セロビオースを含むBM7CO培地に接種し培養した。得られた培養物を、エスクリンとクエン酸鉄アンモニウムを添加したセロビオース培地での単一コロニー分離手順を１０回繰り返し、微生物を単離した。
（単離した微生物の同定）
以下に、単離した菌株の性質を示す。
桿菌
幅０．３から０．４μｍ、長さ２．０から１２μｍ
至適生育温度５０℃～６０℃、至適生育ｐＨ６．０～８．０、グラム陽性、
グルコース、セロビオース、マルトース、スクロース、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボースに良く生育する。特にフルクトース、グルコース、セロビオース、マルトースが炭素源に使用された際、β-グルコシダーゼの高活性が見られる。また、グルコースからは、ＣＯ２，Ｈ２, acetate, ethanolが産物として認められる。
以下に、単離した菌株の性質を示す。
桿菌
幅０．３から０．４μｍ、長さ２．０から１２μｍ
至適生育温度５０℃～６０℃、至適生育ｐＨ６．０～８．０、グラム陽性、
グルコース、セロビオース、マルトース、スクロース、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボースに良く生育する。特にフルクトース、グルコース、セロビオース、マルトースが炭素源に使用された際、β-グルコシダーゼの高活性が見られる。また、グルコースからは、ＣＯ２，Ｈ２, acetate, ethanolが産物として認められる。
さらに、単離菌株の特徴を16S rRNAシーケンスによる系統樹解析により調べた。
ＰＣＲテンプレートとして使用するゲノムDNAは、NucleoSpin（登録商標）MicrobialDNAキット（タカラバイオ）を使用して各微生物から調製した。16S rRNA遺伝子のＰＣＲ増幅は以下のＰＣＲ法により行った。
ＰＣＲによる DNA増幅に用いたＰＣＲプライマーは、細菌ドメインユニバーサルプライマー27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；配列表の配列番号１）及びユニバーサルプライマー1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；配列表の配列番号２）である。
ＰＣＲ産物はDNAシーケンサー（3730xl DNA Analyzer; Applied Biosystems）でシーケンスし、シーケンスアセンブリはGENETYXソフトウェアバージョン13を使用した。
16SrRNA遺伝子系統分析は、BLASTによって行い、関連する分類群の配列とのマルチプルアラインメントは、GenBankデータベースとCLUSTAL_Xバージョン.1.81を使用した。
系統樹は、MEGAバージョンXバージョン10.1を使用し、近隣結合法で構築した。ツリーのトポロジーと距離は、１０００回のリサンプリングに基づくブートストラップ分析によって確認した。
ＰＣＲテンプレートとして使用するゲノムDNAは、NucleoSpin（登録商標）MicrobialDNAキット（タカラバイオ）を使用して各微生物から調製した。16S rRNA遺伝子のＰＣＲ増幅は以下のＰＣＲ法により行った。
ＰＣＲによる DNA増幅に用いたＰＣＲプライマーは、細菌ドメインユニバーサルプライマー27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；配列表の配列番号１）及びユニバーサルプライマー1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；配列表の配列番号２）である。
ＰＣＲ産物はDNAシーケンサー（3730xl DNA Analyzer; Applied Biosystems）でシーケンスし、シーケンスアセンブリはGENETYXソフトウェアバージョン13を使用した。
16SrRNA遺伝子系統分析は、BLASTによって行い、関連する分類群の配列とのマルチプルアラインメントは、GenBankデータベースとCLUSTAL_Xバージョン.1.81を使用した。
系統樹は、MEGAバージョンXバージョン10.1を使用し、近隣結合法で構築した。ツリーのトポロジーと距離は、１０００回のリサンプリングに基づくブートストラップ分析によって確認した。
図１に、Thermobrachium celere KM-A9株（図中、「Strain A9」と表記）の16S rRNAシーケンスによる系統樹解析結果を示す。また、Thermobrachium celere A9株の16S rRNAシーケンスにより得られた塩基配列を配列表の配列番号３に示す。
Thermobrachium celereA9株と、既知のThermobrachium celereとの遺伝子配列相同性を確認するため、Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）から取り寄せたThermobrachium celere DSM 8682について、前述の方法で16SrRNA解析を行い、塩基配列を調べた。結果を配列表の配列番号４に示す。
16S rRNA解析では、Thermobrachium celereと９９％の相同性を示した。
菌学的性質と16S rRNAシーケンスによる系統樹解析結果に基づき、単離した菌株をThermobrachium celere KM-A9株（国際受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）と命名した。
Thermobrachium celereA9株と、既知のThermobrachium celereとの遺伝子配列相同性を確認するため、Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）から取り寄せたThermobrachium celere DSM 8682について、前述の方法で16SrRNA解析を行い、塩基配列を調べた。結果を配列表の配列番号４に示す。
16S rRNA解析では、Thermobrachium celereと９９％の相同性を示した。
菌学的性質と16S rRNAシーケンスによる系統樹解析結果に基づき、単離した菌株をThermobrachium celere KM-A9株（国際受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）と命名した。
（実施例２）
（Thermobrachium celereのβ-グルコシダーゼ生産能）
Thermobrachium celereは、水素生産菌として既知であるが、β-グルコシダーゼを生産する能力は知られていない。そこで、既知のThermobrachium celereが、β-グルコシダーゼを生産するかどうかを確認するために、Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）から取り寄せたThermobrachium celere DSM 8682を基準株とし、Thermobrachium celere KM-A9株との比較実験を行った。
β-グルコシダーゼ活性は、p-ニトロフェニルβ-D-グルコシド（pNPG）の加水分解を測定することによって決定した。
KM-A9株とThermobrachium celere DSM 8682とを、それぞれ５ｇ／Ｌセロビオースを含むYTG培地で２４時間培養した。
YTG培地は（１リットルあたり）以下で構成される：
０．３６ｇ K2HPO4.2H2O、０．０８ｇ KCｌ、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、４．４ｇ Na2CO3、０．５ｍＬレサズリン（０．１％ｗ／ｖ）溶液、０．２ｇのシステイン及び０．２ｇのNa2S.9H2O
完成した培地のｐＨを３ＮのNaOHで９．０に調整した。
YTG培地は、沸騰水で脱気した後、高純度の二酸化炭素と窒素ガスをそれぞれバブリングしてから、嫌気的にハンゲートチューブに分配した。
反応混合物を、１０μＬの酵素及び１００μＬの１ｍＭ ｐＮＰＧ（４－ニトロフェニルβ－Ｄ－グルクロニド）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、６０℃で１０分間インキュベートした後、２００μＬの０．４ MNa2CO3を添加して反応を停止した。
加水分解により放出されたp-ニトロフェノールは、分光光度計を用い、波長４０５ｎｍにて測定した。酵素アッセイは３回行った。
１ユニット（Ｕ）のβ-グルコシダーゼ活性は、酵素測定条件下で１ｍＬあたり１分あたり１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを遊離する酵素の量として定義した。
（Thermobrachium celereのβ-グルコシダーゼ生産能）
Thermobrachium celereは、水素生産菌として既知であるが、β-グルコシダーゼを生産する能力は知られていない。そこで、既知のThermobrachium celereが、β-グルコシダーゼを生産するかどうかを確認するために、Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）から取り寄せたThermobrachium celere DSM 8682を基準株とし、Thermobrachium celere KM-A9株との比較実験を行った。
β-グルコシダーゼ活性は、p-ニトロフェニルβ-D-グルコシド（pNPG）の加水分解を測定することによって決定した。
KM-A9株とThermobrachium celere DSM 8682とを、それぞれ５ｇ／Ｌセロビオースを含むYTG培地で２４時間培養した。
YTG培地は（１リットルあたり）以下で構成される：
０．３６ｇ K2HPO4.2H2O、０．０８ｇ KCｌ、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、４．４ｇ Na2CO3、０．５ｍＬレサズリン（０．１％ｗ／ｖ）溶液、０．２ｇのシステイン及び０．２ｇのNa2S.9H2O
完成した培地のｐＨを３ＮのNaOHで９．０に調整した。
YTG培地は、沸騰水で脱気した後、高純度の二酸化炭素と窒素ガスをそれぞれバブリングしてから、嫌気的にハンゲートチューブに分配した。
反応混合物を、１０μＬの酵素及び１００μＬの１ｍＭ ｐＮＰＧ（４－ニトロフェニルβ－Ｄ－グルクロニド）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、６０℃で１０分間インキュベートした後、２００μＬの０．４ MNa2CO3を添加して反応を停止した。
加水分解により放出されたp-ニトロフェノールは、分光光度計を用い、波長４０５ｎｍにて測定した。酵素アッセイは３回行った。
１ユニット（Ｕ）のβ-グルコシダーゼ活性は、酵素測定条件下で１ｍＬあたり１分あたり１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを遊離する酵素の量として定義した。
結果を図２に示す。図２中、「●」は基準株の生育、「■」は基準株が示すβ-グルコシダーゼ活性を表し、「○」はKM-A9株の生育、「□」はKM-A9株が示すβ-グルコシダーゼ活性の程度を表す。
この結果から、Thermobrachium celereは、β-グルコシダーゼを生産することがわかる。とりわけ、KM-A9株は、基準株に比べ、生育状況、β-グルコシダーゼ活性の程度が優れていることがわかる。
（実施例３）
（セルロースの糖化）
セルロース分解能を有するClostridium thermocellumとThermobrachium celere KM-A9株との共培養による糖化について調査した。
継代培養のために、Clostridium thermocellumストック培養物を１０ｇ／Ｌセルロースを含む５ｍＬのBM7CO培地に注射器で接種し、嫌気性条件下６０℃で２日間インキュベートした。
Thermobrachium celer KM-A9株 のストック培養物を、５ｇ／Ｌセロビオースを含む５ｍＬのBM7CO培地にシリンジで接種し、嫌気性条件下、６０℃で１６時間インキュベートした。Clostridium thermocellumの継代培養物を、５０ｇ／Ｌのセルロース粉末を含む５ｍＬのＢＭ７ＣＯ培地に注射器によって再び接種し、６０℃で２日間インキュベートした。
その後、Thermobrachium celere KM-A9の継代培養物を上記のClostridium thermocellum培養物に注射器で接種し、嫌気性条件下、６０℃でインキュベートし、１０日間共培養した。
培養中のβ-グルコシダーゼ活性をモニターし、培養中の放出されたグルコースの濃度を、高速液体クロマトグラフィー（日本の京都市、島津製作所）を使用して検出した。
（セルロースの糖化）
セルロース分解能を有するClostridium thermocellumとThermobrachium celere KM-A9株との共培養による糖化について調査した。
継代培養のために、Clostridium thermocellumストック培養物を１０ｇ／Ｌセルロースを含む５ｍＬのBM7CO培地に注射器で接種し、嫌気性条件下６０℃で２日間インキュベートした。
Thermobrachium celer KM-A9株 のストック培養物を、５ｇ／Ｌセロビオースを含む５ｍＬのBM7CO培地にシリンジで接種し、嫌気性条件下、６０℃で１６時間インキュベートした。Clostridium thermocellumの継代培養物を、５０ｇ／Ｌのセルロース粉末を含む５ｍＬのＢＭ７ＣＯ培地に注射器によって再び接種し、６０℃で２日間インキュベートした。
その後、Thermobrachium celere KM-A9の継代培養物を上記のClostridium thermocellum培養物に注射器で接種し、嫌気性条件下、６０℃でインキュベートし、１０日間共培養した。
培養中のβ-グルコシダーゼ活性をモニターし、培養中の放出されたグルコースの濃度を、高速液体クロマトグラフィー（日本の京都市、島津製作所）を使用して検出した。
結果を図３に示す。図３中、「■」はClostridium thermocellumのみの培養におけるグルコース量、「□」はClostridium thermocellumのみの培養におけるβ-グルコシダーゼ活性の程度を表し、「●」は、Clostridium thermocellumとThermobrachium celere KM-A9株との共培養により生じたグルコース量、「○」はClostridium thermocellumとThermobrachium celere KM-A9株との共培養におけるβ-グルコシダーゼ活性の程度を表す。
この結果から、β-グルコシダーゼを添加しなくても、３．５％セルロース濃度でもほぼ完全に糖化されることがわかる。
（実施例４）
（Thermobrachium celere KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子クローニング）
２つのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、BamHI部位を有するセンスプライマー用の5-GGGGATCCATGCAAAAATACACTTTCCC-3（配列表の配列番号５）とBpu1102を含むアンチセンスプライマー用の5-GGCTCAGCTCATTCACAAAGGCTATTAT-3（配列表の配列番号６）をＰＣＲによってβ-グルコシダーゼ遺伝子のコード領域を増幅するように設計した。ＰＣＲ産物を２つの制限酵素BamHIとBpu1102で消化し、同じ制限酵素部位で消化したpET19bベクターにライゲーションした。構築されたプラスミドCcBG1-pET19bを大腸菌BL21（DE3）に形質転換し、標的タンパク質を発現させた。陽性クローンをDNAシーケンシングによって検証した。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列アラインメントは、NCBIサーバー（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）を用いて行った。
Thermobrachium celere KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子のアミノ酸配列を配列表の配列番号７に、Thermobrachium celere KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼの遺伝子配列を配列表の配列番号８に示す。
（Thermobrachium celere KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子クローニング）
２つのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、BamHI部位を有するセンスプライマー用の5-GGGGATCCATGCAAAAATACACTTTCCC-3（配列表の配列番号５）とBpu1102を含むアンチセンスプライマー用の5-GGCTCAGCTCATTCACAAAGGCTATTAT-3（配列表の配列番号６）をＰＣＲによってβ-グルコシダーゼ遺伝子のコード領域を増幅するように設計した。ＰＣＲ産物を２つの制限酵素BamHIとBpu1102で消化し、同じ制限酵素部位で消化したpET19bベクターにライゲーションした。構築されたプラスミドCcBG1-pET19bを大腸菌BL21（DE3）に形質転換し、標的タンパク質を発現させた。陽性クローンをDNAシーケンシングによって検証した。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列アラインメントは、NCBIサーバー（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）を用いて行った。
Thermobrachium celere KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子のアミノ酸配列を配列表の配列番号７に、Thermobrachium celere KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼの遺伝子配列を配列表の配列番号８に示す。
（実施例５）
（KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼの単離、精製）
陽性クローンを100μg/mlアンピシリンを添加したLB培地に接種し、３７℃でインキュベートした。６００ｎｍでの培地の光学密度（OD600）が0.6から8.0に達したら、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.5mMになるように添加してタンパク質発現を誘導し、培養物をさらに４時間培養した。
その後、細胞を８，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収し、20mMイミダゾールを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波処理によって破砕した。１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して破片を除去し、上清を回収して０．４５μｍフィルターでろ過した。
組換え酵素は、Bio-Scale Mini ProfinityIMACカートリッジとBio-GelP6脱塩カートリッジ（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA）を使用し、Profinia Affinity Chromatography Protein Purification Systemで精製した。
タンパク質濃度は、Coomassie（Bradford）タンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準として使用して決定した。
精製されたタンパク質の均一性は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析した。SDS-PAGEによる結果を図４に示す。
（KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼの単離、精製）
陽性クローンを100μg/mlアンピシリンを添加したLB培地に接種し、３７℃でインキュベートした。６００ｎｍでの培地の光学密度（OD600）が0.6から8.0に達したら、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.5mMになるように添加してタンパク質発現を誘導し、培養物をさらに４時間培養した。
その後、細胞を８，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収し、20mMイミダゾールを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波処理によって破砕した。１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して破片を除去し、上清を回収して０．４５μｍフィルターでろ過した。
組換え酵素は、Bio-Scale Mini ProfinityIMACカートリッジとBio-GelP6脱塩カートリッジ（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA）を使用し、Profinia Affinity Chromatography Protein Purification Systemで精製した。
タンパク質濃度は、Coomassie（Bradford）タンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準として使用して決定した。
精製されたタンパク質の均一性は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析した。SDS-PAGEによる結果を図４に示す。
（実施例６）
（KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼの特性）
精製したタンパク質のβ-グルコシダーゼ酵素活性は、実施例２記載の酵素測定方法により調べた。
また、得られたKM-A9株由来の組換えβ-グルコシダーゼ（rTcBG）の熱安定性、β-グルコシダーゼ活性及びグルコース阻害について調べた。
熱安定性は、基質を含まない酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）中で５０から８０℃で１時間プレインキュベートし、残存するβ-グルコシダーゼ活性を測定して、至適温度、熱耐性を調べた。
β-グルコシダーゼのグルコース阻害は、基質としてpNPGを用いた標準反応混合物に異なる濃度（0-1M）のグルコースを添加することによって測定し、アッセイ条件下で初期のβ-グルコシダーゼ活性の５０％を阻害するのに必要なグルコースの濃度（グルコース耐性）を決定した。
なお、特許文献１の実施例１に記載された方法により調整した好熱性の組換えグルコシダーゼ（rCglT）との比較を行った。結果を表１に示す。
（KM-A9株由来のβ-グルコシダーゼの特性）
精製したタンパク質のβ-グルコシダーゼ酵素活性は、実施例２記載の酵素測定方法により調べた。
また、得られたKM-A9株由来の組換えβ-グルコシダーゼ（rTcBG）の熱安定性、β-グルコシダーゼ活性及びグルコース阻害について調べた。
熱安定性は、基質を含まない酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）中で５０から８０℃で１時間プレインキュベートし、残存するβ-グルコシダーゼ活性を測定して、至適温度、熱耐性を調べた。
β-グルコシダーゼのグルコース阻害は、基質としてpNPGを用いた標準反応混合物に異なる濃度（0-1M）のグルコースを添加することによって測定し、アッセイ条件下で初期のβ-グルコシダーゼ活性の５０％を阻害するのに必要なグルコースの濃度（グルコース耐性）を決定した。
なお、特許文献１の実施例１に記載された方法により調整した好熱性の組換えグルコシダーゼ（rCglT）との比較を行った。結果を表１に示す。
この結果から、rTcBGは、rCglTに比べ、酵素活性、グルコース耐性が高いことがわかる。これは、本発明のβ-グルコシダーゼが、rCglTを含めた公知の微生物由来のβ-グルコシダーゼの構造及びシグナルシーケンスが異なることによるものと考えられる。本発明のβ-グルコシダーゼは、N末端部分に強い疎水性のアミノ酸が並んでいるため膜通過しやすくなっていると考えられる。
グルコース耐性が強ければ、糖化効率を上げることが可能である。
本発明のβ-グルコシダーゼは、公知の好熱性β-グルコシダーゼ又は特許文献１のrCglTと置き換えて使用することが可能であり、また、本発明におけるβ-グルコシダーゼを生産する好熱性微生物と併存させて使用することにより、さらに糖化効率を高めることが可能である。
グルコース耐性が強ければ、糖化効率を上げることが可能である。
本発明のβ-グルコシダーゼは、公知の好熱性β-グルコシダーゼ又は特許文献１のrCglTと置き換えて使用することが可能であり、また、本発明におけるβ-グルコシダーゼを生産する好熱性微生物と併存させて使用することにより、さらに糖化効率を高めることが可能である。
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４
配列表フリーテキスト
Claims (2)
- セルロース系バイオマスの存在下、セルロース分解能を有するClostridium thermocellumとβ－グルコシダーゼを生産するThermobrachium celere KM-A9株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）とを培養することで、前記セルロース系バイオマスを糖化させる、セルロース系バイオマスの糖化方法。
- β－グルコシダーゼを生産するThermobrachium celere KM-A9株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３４５４）。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021074485A JP7460978B2 (ja) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | β－グルコシダーゼを生産する微生物及び該β－グルコシダーゼを生産する微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法。 |
| PCT/JP2022/017696 WO2022230670A1 (ja) | 2021-04-26 | 2022-04-13 | β－グルコシダーゼを生産する好熱性微生物、そのスクリーニング方法及びβ－グルコシダーゼを生産する好熱性微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法、並びに好熱性微生物由来のβ－グルコシダーゼ及び該β－グルコシダーゼをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021074485A JP7460978B2 (ja) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | β－グルコシダーゼを生産する微生物及び該β－グルコシダーゼを生産する微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法。 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022168778A JP2022168778A (ja) | 2022-11-08 |
| JP2022168778A5 JP2022168778A5 (ja) | 2023-10-26 |
| JP7460978B2 true JP7460978B2 (ja) | 2024-04-03 |
Family
ID=83848139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021074485A Active JP7460978B2 (ja) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | β－グルコシダーゼを生産する微生物及び該β－グルコシダーゼを生産する微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法。 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7460978B2 (ja) |
| WO (1) | WO2022230670A1 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013137151A1 (ja) | 2012-03-10 | 2013-09-19 | 独立行政法人国際農林水産業研究センター | グルコースの生産方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61128898A (ja) * | 1984-11-29 | 1986-06-16 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | セルロ−スの糖化方法 |
| JP2022520026A (ja) * | 2019-01-29 | 2022-03-28 | スキンプロテクト コーポレイション スンディリアン ブルハド | 合成エラストマー物品およびその生産方法 |
-
2021
- 2021-04-26 JP JP2021074485A patent/JP7460978B2/ja active Active
-
2022
- 2022-04-13 WO PCT/JP2022/017696 patent/WO2022230670A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013137151A1 (ja) | 2012-03-10 | 2013-09-19 | 独立行政法人国際農林水産業研究センター | グルコースの生産方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| POORNIMA Veena, V. et al.，African Journal of Biotechnology，2011年，Vol. 10, No. 66，pp. 14907-14912 |
| R7RUN9，UniProt [オンライン]，2021年04月07日，[検索日 2022.07.04], インターネット：<URL：https://rest.uniprot.org/unisave/R7RUN9?format=txt&versions=24> |
| 伊藤敏之，BGL発現細菌とClostridium thermocellumを用いたセルロースからのグルコース生産，三重大学 修士論文 [オンライン]，2019年，[検索日 2022.07.07], インターネット：<URL：https://mie-u.repo.nii.ac.jp/?action=pages_view_main&active_action=repository_view_main_item_detail&item_ id=12854&item_no=1&page_id=13&block_id=21> |
| 市川俊輔他，Clostridium属細菌によるセルロース系バイオマス分解と化成品原料生産，応用糖質科学，2018年，Vol. 8, No. 2，pp. 94-101 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022168778A (ja) | 2022-11-08 |
| WO2022230670A1 (ja) | 2022-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mehta et al. | Insight into thermophiles and their wide-spectrum applications | |
| Dheeran et al. | Characterization of hyperthermostable α-amylase from Geobacillus sp. IIPTN | |
| Lee et al. | Industrial scale of optimization for the production of carboxymethylcellulase from rice bran by a marine bacterium, Bacillus subtilis subsp. subtilis A-53 | |
| Chan et al. | Characterization of a glucose-tolerant β-glucosidase from Anoxybacillus sp. DT3-1 | |
| JP2009519005A (ja) | バイオマス処理の酵素および方法 | |
| Azadian et al. | Purification and biochemical properties of a thermostable, haloalkaline cellulase from Bacillus licheniformis AMF-07 and its application for hydrolysis of different cellulosic substrates to bioethanol production | |
| Ying et al. | An extremely thermophilic anaerobic bacterium Caldicellulosiruptor sp. F32 exhibits distinctive properties in growth and xylanases during xylan hydrolysis | |
| Zhang et al. | Purification and characterization of a novel and versatile α‐amylase from thermophilic Anoxybacillus sp. YIM 342 | |
| Tariq et al. | Optimization of endoglucanase production from thermophilic strain of Bacillus licheniformis RT-17 and its application for saccharification of sugarcane bagasse | |
| Al-ZaZaee et al. | Identification, characterization of novel halophilic Bacillus cereus Ms6: a source for extra cellular a-amylase | |
| Choi et al. | Purification and Characterization of an Extracellular ${\beta} $-Glucosidase Produced by Phoma sp. KCTC11825BP Isolated from Rotten Mandarin Peel | |
| Lu et al. | Production of novel alkalitolerant and thermostable inulinase from marine actinomycete Nocardiopsis sp. DN-K15 and inulin hydrolysis by the enzyme | |
| Lomthong et al. | Production of raw starch degrading enzyme by the thermophilic filamentous bacterium Laceyella sacchari LP175 and its application for ethanol production from dried cassava chips | |
| Naidoo et al. | Purification and Characterization of an Endoinulinase from Xanthomonas campestris pv. phaseoli KM 24 Mutant | |
| CN104919044A (zh) | 高效纤维素分解酶制剂及其生产方法 | |
| WO1995034644A1 (en) | Pyrodictium xylanase, amylase and pullulanase | |
| Ghosh et al. | Extra-cellular isoamylase production by Rhizopus oryzae in solid-state fermentation of agro wastes | |
| Wang et al. | Identification of archaeon-producing hyperthermophilic α-amylase and characterization of the α-amylase | |
| JP7460978B2 (ja) | β－グルコシダーゼを生産する微生物及び該β－グルコシダーゼを生産する微生物を用いたセルロース系バイオマスの糖化方法。 | |
| Hajiabadi et al. | Isolation and molecular identification of cellulolytic bacteria from Dig Rostam hot spring and study of their cellulase activity | |
| JP5943326B2 (ja) | グルコースの生産方法 | |
| Kato et al. | Two new β-glucosidases from ethanol-fermenting fungus Mucor circinelloides NBRC 4572: enzyme purification, functional characterization, and molecular cloning of the gene | |
| EP0793716A1 (en) | $i(THERMOCOCCUS) AMYLASE AND PULLULANASE | |
| EP0753056A1 (en) | Desulfurococcus amylase and pullulanase | |
| Kim et al. | Production and characterization of crystalline cellulose-degrading cellulase components from a thermophilic and moderately alkalophilic bacterium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210511 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20210428 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220406 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231003 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231003 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20231003 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231016 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20231016 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231108 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240123 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240305 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240312 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7460978 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |