CN104582507A - 心血管疾病和血栓形成的治疗与预防 - Google Patents

心血管疾病和血栓形成的治疗与预防 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于治疗和/或预防心血管疾病(CVD)的组合物，以及其应用和使用方法。详细地说，本发明提供了使用抑制肠道中的TMA产生的化合物如3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)或由式I表示或如图20-23中所示的其它化合物治疗和/或预防心血管疾病。

Description

心血管疾病和血栓形成的治疗与预防
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年6月11日提交的美国临时专利申请61/658,208的优先权，这个专利申请以全文引用的方式并入。
技术领域
本文提供了用于治疗和/或预防心血管疾病(CVD)的组合物，以及其应用和使用方法。详细地说，本发明提供了使用抑制肠道中的TMA产生的化合物(如3,3-二甲基-1-丁醇(DMB))或由式I表示或图中所示的其它化合物治疗和/或预防心血管疾病。
发明背景
心血管疾病(CVD)是心脏和血管疾病的通用术语，包括动脉粥样硬化、冠状动脉心脏病、脑血管疾病、主髂动脉疾病和外周血管疾病。患有CVD的受试者可能发展出许多并发症，包括(但不限于)心肌梗塞、中风、心绞痛、短暂性缺血性发作、充血性心脏衰竭、主动脉瘤和死亡。CVD导致美国每两例死亡中的一例，并且是头号致命性疾病。因此，心血管疾病的预防是重大公共卫生重要性的领域。
推荐低脂肪膳食和锻炼来预防CVD。另外，医学专业人员可以向据知处于患有CVD的风险下的那些个体开立许多治疗剂。这些治疗剂包括降低胆固醇和三酸甘油酯的血液水平的脂质降低剂、使血压正常的试剂、如阿司匹林(aspirin)的试剂，或防止血小板活化并且减少血管炎症的血小板ADP受体拮抗剂(例如，氯吡格雷(clopidogrel)和噻氯匹定(ticlopidine))，以及多效剂，如过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)激动剂，其具有减少炎症、促进胰岛素增敏、改善血管功能以及纠正脂质异常的广泛范围的代谢作用。更侵袭性的疗法(如施用多种药物)或手术干预可以用于处于患有CVD的高风险下的那些个体。因为CVD疗法可能具有不良副作用，所以需要具有鉴别处于近期经历不良心脏事件的风险下的那些个体、特别是处于高风险下的那些个体的方法。
心血管疾病的主要风险因子包括年龄、高血压、过早CVD的家族病史、吸烟、高总胆固醇、低HDL胆固醇、肥胖和糖尿病。CVD的主要风险因子是相加的，并且通常被医师一起用于风险预测算法中以靶向最有可能受益于CVD治疗的那些个体。CVD的可测试标志包括：主动脉斑块形成的水平、总血液胆固醇水平、血液三酸甘油酯水平、血液低密度脂蛋白水平、血液高密度脂蛋白水平、泡沫细胞的形成，以及胆碱相关三甲胺(TMA)和含三甲胺化合物(如三甲胺N-氧化物(TMAO))的水平。
发明概要
本文提供了用于治疗和/或预防心血管疾病(CVD)的组合物，以及其应用和使用方法。详细地说，本发明提供了使用以下化合物治疗和/或预防心血管疾病：抑制肠道中的TMA产生的化合物，如3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)、N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦；或由式I表示的其它化合物。式I如下：
式I：
其中n为整数，或n为0，指示CH2不存在；
其中Y为C、Si、P、S、Ge、Sn、Pb、P、As、Sb或Bi；
其中X为O或S并且相应键存在或不存在或为双键，
其中R为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；
其中Z为C、CH2、CH、O或S，
其中XR为酯、硫酯或硫羰酸酯；甘油，或以下三个式之一：
其中R'为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；并且
其中X'为O或S。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防心血管疾病和/或血栓形成的方法，其包括：a)鉴别具有增加的血小板凝集和/或升高的TMAO水平的受试者，以及b)向这个受试者施用包含以下的组合物：N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦，或由式I表示的化合物(例如，二甲基丁醇和/或其衍生物)，和/或肠道靶向抗生素和/或益生元(prebiotic)(例如，改变肠菌群组成的含纤维食物)和/或益生素(probiotic)(例如，含益生素食物，如乳酪)。在某些实施方案中，组合物包含二甲基丁醇或图20-23中所示的化合物。在其它实施方案中，鉴别包括观察对来自显示增加的血小板凝集的受试者的样品进行的血小板凝集试验的结果(例如，在纸上或在电脑屏幕上)。在其它实施方案中，鉴别包括观察对来自显示升高的TMAO水平的受试者的样品进行的TMAO试验的结果。在某些实施方案中，鉴别包括观察对来自所述显示升高的TMA或TMAO水平的受试者的样品或呼出气进行的TMA或TMAO试验的结果。
在一些实施方案中，组合物包含含有式I化合物(或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦)的食物或饮料。在其它实施方案中，组合物包含含有式I化合物(或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦)的食物或液体，其选自由以下组成的群组(但不限于此)：橄榄油、特级初榨橄榄油、葡萄籽油、含酵母食物和红葡萄酒。在其它实施方案中，组合物包含有利于降低TMAO水平的化合物。在某些实施方案中，组合物在药丸或胶囊(例如，具有填充剂或粘合剂)中提供。在特定实施方案中，式I化合物(例如，二甲基丁醇)防止TMA从来自肠道菌群的胆碱或其它三甲胺营养素(例如，肉毒碱、甘油磷酸胆碱、磷酸胆碱、磷脂酰胆碱)形成，或削弱胆碱转运。在额外实施方案中，式I化合物(或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦)当施用于受试者时诱导以下一者或多者：降低的三甲胺水平、降低的总胆固醇水平、降低的LDL水平、增加的HDL水平和降低的三酸甘油酯水平。在其它实施方案中，式I化合物当施用于受试者时降低心血管疾病的风险。在其它实施方案中，式I化合物(或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦)当施用于受试者时降低血小板活化和/或血栓形成的风险。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防心血管疾病和/或血栓形成的方法，其包括向受试者施用包含式I化合物(例如，二甲基丁醇和/或其衍生物和/或图20-23中所示的化合物，如N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦)的组合物。在其它实施方案中，受试者已经被确定为具有增加的血小板凝集。在某些实施方案中，受试者已经被确定为具有升高的TMAO水平。在其它实施方案中，施用是以使得心血管疾病和/或血栓形成的至少一个症状减轻或消除为条件。在其它实施方案中，受试者的膳食富含胆碱。在其它实施方案中，组合物包含二甲基丁醇。在某些实施方案中，组合物的施用抑制胆碱转化成三甲胺。在其它实施方案中，组合物的施用抑制胆碱转运。
在一些实施方案中，式I具有选自由以下组成的群组的式：
在其它实施方案中，式I具有选自由以下组成的群组的式：
在某些实施方案中，式I具有选自由以下组成的群组的式：
在一些实施方案中，式I具有选自由以下组成的群组的式：
在其它实施方案中，式I具有选自由以下组成的群组的式：
在特定实施方案中，组合物与一种或多种为心血管疾病提供治疗的试剂共同施用。在其它实施方案中，这一种或多种试剂包含一种或多种靶向肠道菌群的抗生素(例如，杀死肠道中负责产生TMAO的细菌的抗生素)。在其它实施方案中，组合物与一种或多种为发炎性疾病提供治疗的试剂共同施用。在其它实施方案中，组合物与一种或多种降低TMA和/或TMA水平，或改善肠运动性的试剂(例如，纤维、车前子或一些其它益生元)共同施用。
在一些实施方案中，本发明提供了在经历程序的受试者中预防血栓形成、心脏病发作和/或降低血小板高反应性的方法，其包括：在程序之前将肠道菌群靶向抗生素施用于受试者，其中这种程序与引起血栓形成、心脏病发作和/或血小板高反应性的风险相关联，并且其中施用是以使得血栓形成和/或心脏病发作得以预防和/或血小板高反应性得以降低为条件。
在某些实施方案中，程序是选自由以下组成的群组的仪器化程序：牙科、手术、结肠镜检查和心血管支架程序。在某些实施方案中，肠道菌群靶向抗生素选自由以下组成的群组：环丙沙星(ciprofloxin)、弗来格(flagyl)(甲硝哒唑(metronidazole))、万古霉素(vancomycin)、硫酸新霉素(neomycin sulfate)和氨苄西林(ampicillin)。在特定实施方案中，施用是在程序的50小时内(例如，程序的48小时......40小时......36小时......28小时......22小时......15小时......10小时......7小时......5小时......4小时......3小时......2小时......1小时......5分钟)。在其它实施方案中，方法进一步包括在程序之前，观察在施用肠道菌群靶向抗生素之后从受试者获取的样品的血小板凝集试验的结果。在额外实施方案中，方法进一步包括进行这种程序。
在一些实施方案中，本发明提供了包括以下的方法：a)对来自受试者的样品进行血小板凝集试验以判定所述样品与正常水平相比是否显示升高的血小板凝集；以及b)推荐所述受试者接受用于治疗心血管疾病或血栓形成的治疗性组合物，和/或生成推荐所述受试者接受用于治疗心血管疾病或血栓形成的治疗性组合物的报告，其中所述治疗性组合物包含式I化合物(例如，二甲基丁醇和/或其衍生物)和/或肠道靶向抗生素、益生元和/或益生素。
在某些实施方案中，本发明提供了包括以下的方法：a)对来自受试者的样品进行TMAO水平试验以判定所述样品与正常水平相比是否显示升高的TMAO水平；以及b)推荐所述受试者接受用于治疗心血管疾病或血栓形成的治疗性组合物，和/或生成推荐所述受试者接受用于治疗心血管疾病或血栓形成的治疗性组合物的报告，其中所述治疗性组合物包含式I化合物(例如，二甲基丁醇和/或其衍生物)和/或肠道靶向抗生素、益生元和/或益生素。
在某些实施方案中，本发明提供了包括以下的方法：a)对来自受试者的样品或呼出气进行TMA水平试验以判定所述样品或呼出气与正常水平相比是否显示升高的TMA水平；以及b)推荐所述受试者接受用于治疗心血管疾病或血栓形成的治疗性组合物，和/或生成推荐所述受试者接受用于治疗心血管疾病或血栓形成的治疗性组合物的报告，其中所述治疗性组合物包含式I化合物(例如，二甲基丁醇和/或其衍生物)和/或肠道靶向抗生素、益生元和/或益生素。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗和/或预防心血管疾病的组合物，其包含被配置为施用于受试者的式I化合物(例如，二甲基丁醇、其衍生物或相关化合物)。在一些实施方案中，组合物包含二甲基丁醇。在一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种为心血管疾病提供治疗的医药剂。在一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种医药载剂。在一些实施方案中，式I化合物削弱胆碱转运。在一些实施方案中，式I化合物当施用于受试者时诱导以下一者或多者：降低的三甲胺水平、降低的总胆固醇水平、降低的LDL水平、增加的HDL水平和降低的三酸甘油酯水平。在一些实施方案中，式I化合物当施用于受试者时降低心血管疾病的风险。在一些实施方案中，式I化合物当施用于受试者时降低发炎性疾病的风险。在一些实施方案中，组合物是用生理学上可接受的缓冲液配制。在一些实施方案中，组合物在具有填充剂或粘合剂的药丸或胶囊中提供。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗和/或预防心血管疾病的方法，其包括向受试者施用包含式I化合物(例如，二甲基丁醇、其衍生物或相关化合物)的组合物。在一些实施方案中，受试者处于发展心血管疾病的风险下。在一些实施方案中，受试者罹患心血管疾病。在一些实施方案中，施用是以使得所述心血管疾病的至少一个症状减轻或消除为条件。在一些实施方案中，受试者的膳食富含胆碱。在一些实施方案中，组合物包含二甲基丁醇。在一些实施方案中，组合物抑制胆碱转化成TMA或其它三甲胺。在一些实施方案中，组合物的施用抑制胆碱转运。在一些实施方案中，包含式I化合物的组合物与一种或多种为心血管疾病提供治疗的试剂共同施用。在一些实施方案中，组合物与一种或多种为发炎性疾病提供治疗的试剂共同施用。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗、预防或改善受试者的心血管疾病的征象或症状的方法。在一些实施方案中，式I化合物(例如，二甲基丁醇、其衍生物或相关化合物)或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦与一种或多种其它治疗剂、营养品、补充剂、医药品和/或食物一起提供于试剂盒中。在一些实施方案中，式I化合物(例如，二甲基丁醇、其衍生物或相关化合物)是作为食物或饮料补充剂提供。在一些实施方案中，式I化合物或图20-23中的那些(例如，二甲基丁醇、其衍生物或相关化合物)是作为医药品提供。在一些实施方案中，式I化合物(例如，二甲基丁醇、其衍生物或相关化合物)是作为综合CVD治疗或预防策略的一部分和/或与其它疗法、健康饮食、锻炼和/或临床医师和本领域技术人员已知的其它策略联合提供。
在一些实施方案中，式I化合物或图20-23中所示的那些(例如，DMB、包含DMB的化合物、DMB相关化合物和/或其衍生物)的施用为一种或多种心血管疾病提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)，所述心血管疾病包括(但不限于)：绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心脏衰竭、冠状动脉疾病(CAD)、颈动脉疾病、心内膜炎、心脏病发作(例如，冠状动脉血栓形成、心肌梗塞[MI])、高血压(high blood pressure/hypertension)、高胆固醇血症/高脂质血症、二尖瓣脱垂、外周动脉疾病(PAD)、中风，等等。
附图简述
图1示出了胆碱、三甲胺N-氧化物和3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)的分子式。
图2A和2B示出了结构上相似的化合物对巨噬细胞胆固醇蓄积的影响，以及将膳食PC和胆碱的肠道菌群依赖性代谢与动脉粥样硬化联系起来的整体路径的概括。图2A示出了在结构上相似的化合物、胆碱、TMAO和二甲基丁醇(DMB)当中蓄积于巨噬细胞中的胆固醇的差异。向雄性C57BL/6J.Apoe-/-小鼠(15周大)安排单独的普通饲料(对照)，或在胆碱(1.0％)、TMAO(0.12％)或DMB(1.0％)存在下补充的普通饲料。从指定数目的20周龄的小鼠回收腹腔巨噬细胞，并且通过稳定同位素稀释GC/MS来定量细胞胆固醇含量，并且针对DNA含量进行标准化。图2B示出了整体路径的示意性图解。
图3示出了主动脉根部切片的图像，其展示膳食对主动脉损伤的蓄积的影响。
图4示出了膳食对主动脉损伤的蓄积的影响的图，以及通过DMB施用使来自膳食胆碱的主动脉粥样硬化斑块减少。
图5示出了胆固醇、三酸甘油酯、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇的血浆水平的图，以及如何施用DMB可以降低致动脉粥样硬化脂质水平
图6A-E示出了来自以下喂食小鼠的膳食的腹腔巨噬细胞的染色：(a)只有饲料，(b)补充胆碱，(c)补充DMB，以及(d)补充胆碱+DMB。图(e)示出了计算的泡沫细胞％。
图7示出了从20周龄的小鼠回收的腹腔巨噬细胞中的总胆固醇的图。并且DMB治疗诱导胆固醇蓄积的减少。
图8示出了展示DMB施用促进抑制胆碱体内转化成TMA的图。
图9示出了用口服广谱抗生素压制肠菌群抑制了TMA和TMAO产生，从而确认TMA和TMAO形成的肠道菌群需求。图9还示出了DMB抑制高胆碱膳食的小鼠中的TMA和TMAO形成。
图10A示出了高胆碱膳食的动物具有提高的TMAO血浆水平和增加的血小板高反应性，如通过针对ADP的血小板凝集增加来监测。
图10B示出了血浆TMAO的压制明显减少胆碱膳食诱导的血小板凝集增加。
图11A示出了高胆碱膳食的动物具有提高的TMAO血浆水平。
图11B示出了DMB抑制小鼠中的TMAO形成，而且明显降低血小板高反应性。
图12概括了来自实施例7加上其它的小鼠组的数据。图12绘制了血小板凝集反应对比指定膳食和治疗(菌群的DMB或抗生素压制)的最大幅度。图12示出了添加DMB阻断来自高胆碱膳食或内源TMAO的血小板高反应性(凝集)。
图13示出了膳食胆碱或其它含三甲胺营养素的肠道菌群依赖性代谢物TMAO提高体内血栓形成速率。这里的实验是在动脉粥样硬化倾向的ApoE-/-小鼠中进行，并且显示出抑制肠道菌群介导的胆碱转化成TMAO的抗生素应适用于促进血栓形成速率降低。
图14示出了膳食胆碱的肠道菌群依赖性代谢物TMAO在不存在血脂异常的情况下提高野生型小鼠的体内血栓形成速率，并且抑制肠道菌群介导的胆碱或其它膳食三甲胺转化成TMA和TMAO的抗生素或其它手段应适用于促进血栓形成速率降低。
图15示出了在存在对比不存在抗生素或DMB的情况下小鼠的体内血栓形成数据的概括。图15示出了DMB与抗生素都阻断高胆碱膳食所见的体内血栓形成速率的降低，而且阻断膳食诱导的TMAO水平升高。
图16A-16D示出了在经口摄取两个硬水煮蛋之后磷脂酰胆碱代谢物(TMAO、胆碱、甜菜碱)以及在抗生素之前和之后d9-磷脂酰胆碱的人类血浆水平。
图17示出了根据TMAO四分位数，长期主要不良心脏事件的卡普兰-迈耶估计值(Kaplan-Meier estimate)。
图18示出了根据基线TMAO水平，在患者子组当中主要不良心脏事件的风险。危险比是比较最高四分位数与最低四分位数。TMAO预测了以其它方式从传统风险因子未鉴别为处于风险下的多个低风险队列中的主要不良心脏事件的风险增加。
图19示出了在经口摄取两个硬水煮蛋之后TMAO以及在抗生素之前和之后d9-磷脂酰胆碱的人类24小时尿液水平。
图20示出了TMA产生的营养素类似物抑制剂的通用结构。式中的变量与本文中针对式I所描述的相同。
图21A和21B示出了可以用作TMA产生的抑制剂的胆碱类似物的化学结构。
图22A和22B示出了可以用作TMA产生的抑制剂的肉毒碱类似物的化学结构。
图23示出了可以用作TMA产生的抑制剂的某些胆碱衍生物。
图24示出了显示三甲基甲硅烷基乙醇充当从来自奇异变形杆菌(proteus mirabilis)的胆碱产生TMA的抑制剂的数据图。
定义
如本文所用的术语“心血管疾病”(CVD)或“心血管病症”是用于将影响身体的心脏、心脏瓣膜和血管结构(例如，动脉和静脉)的众多病状归类的术语，并且涵盖包括(但不限于)以下的疾病和病状：动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌梗塞、急性冠状动脉综合症、绞痛、充血性心脏衰竭、主动脉瘤、主动脉夹层、髂或股动脉瘤、肺栓塞、原发性高血压、心房颤动、中风、短暂性缺血性发作、收缩功能障碍、舒张功能障碍、心肌炎、房性心动过速、心室纤维性颤动、心内膜炎、动脉病、血管炎、动脉粥样硬化斑块、易损斑块、急性冠状动脉综合症、急性缺血性发作、心脏性猝死、外周血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病(PAD)和脑血管疾病。
如本文所用的术语“动脉粥样硬化性心血管疾病”或“病症”指的是包括动脉粥样硬化作为特定类型的心血管疾病的组分或前体的心血管疾病的子集，并且包括(但不限于)CAD、PAD、脑血管疾病。动脉粥样硬化是在动脉血管壁中发生的慢性发炎反应。其涉及到形成粥样斑块，这些粥样斑块可以导致动脉变窄(“狭窄”)，并且可以最终导致动脉开口的部分或完全封闭和/或斑块破裂。因此，动脉粥样硬化性疾病或病症包括粥样斑块形成和破裂的结果，包括(但不限于)动脉狭窄或变窄、心脏衰竭、动脉瘤形成(包括主动脉瘤)、主动脉夹层，以及缺血事件，如心肌梗塞和中风
如本文所用的心血管事件指的是由心血管疾病引起的受试者中的不良状况的表现，如心脏性猝死或急性冠状动脉综合症，包括(但不限于)心肌梗塞、不稳定性绞痛、动脉瘤或中风。术语“心血管事件”可以在本文中与术语心血管并发症互换使用。虽然心血管事件可以是急性状况，但其也可以代表先前检测到的状况恶化到一定程度，在此其代表对受试者的健康构成重大威胁，如先前已知的动脉瘤扩大或高血压升到威胁生命的水平。
如本文所用的术语“诊断”可以包涵确定受试者的疾病的性质，以及确定疾病的严重性和可能结果或疾病的发作和/或恢复的前景(预后)。“诊断”还可以包涵在合理治疗的情形下诊断，其中诊断指导治疗，包括治疗的初始选择、对治疗的修改(例如，剂量和/或给药方案的调整或生活方式改变的建议)，等等。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且一般指的是哺乳动物，包括(但不限于)灵长类动物，包括猿和人类、马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物、各种驯养的牲畜(例如有蹄动物，如大猪、小猪、山羊、绵羊，等等)，以及驯养的宠物和维持在动物园中的动物。在一些实施方案中，受试者特定地是人类受试者。
发明详述
本发明提供了用于治疗处于发展或患有心血管疾病的风险下的受试者的组合物和方法。在某些实施方案中，来自式I的化合物用于治疗处于发展或患有心血管疾病的风险下的受试者。在一些实施方案中，将3,3,-二甲基-1-丁醇(又称为二甲基丁醇、DMB)，即胆碱的氮原子被碳置换的胆碱类似物(见图1)施用于受试者。在一些实施方案中，本发明提供了将来自式I的化合物或图20-23中所示的那些(例如，DMB)施用于处于发展或患有心血管疾病的风险下的受试者。在一些实施方案中，将治疗有效量的以下各物：来自式I或图20-23的化合物(例如，DMB、包含DMB的化合物、DMB相关化合物和/或其衍生物)施用于受试者以治疗和/或预防CVD。在一些实施方案中，将式I或图20-23的化合物(例如，DMB、包含DMB的化合物、DMB相关化合物和/或其衍生物)联合一种或多种用于CVD的已接受的治疗共同施用于受试者。在某些实施方案中，将肠道菌群靶向抗生素施用于受试者以治疗或预防CVD和/或血栓形成。
尽管本发明不限于任何特定的作用机制并且对作用机制的理解对于实施本发明不是必需的，但来自式I的化合物(或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦)当施用于受试者(例如，人类受试者、动物测试受试者)时充当削弱胆碱转运的益生元，并且因此能够降低血浆中的三甲胺(例如，TMAO)水平。在一些实施方案中，来自式I或图20-23的化合物的施用使得TMA水平降低。在一些实施方案中，来自式I的化合物的施用使得TMAO水平降低。在一些实施方案中，施用来自式I(或图20-23)的化合物治疗和/或预防三甲胺(例如，TMAO)相关或引起的病状和/或疾病(例如，CVD、发炎性疾病(例如，类风湿性关节炎))。三甲胺在发炎性病状中增加并且将巨噬细胞活性从静止表型调节到活跃表型。在一些实施方案中，式I化合物作为用于发炎性疾病(例如，CVD、类风湿性关节炎，等等)的治疗剂施用。
在一些实施方案中，式I化合物、包含DMB的化合物、DMB相关化合物和/或其衍生物或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦施用于处于CVD的风险下、疑患CVD或罹患CVD的受试者使得CVD的一个或多个标志和风险因子(例如，总胆固醇、LDL、HDL、三酸甘油酯、TMAO，等等)有所改进。在一些实施方案中，式I化合物、DMB、包含DMB的化合物、DMB相关化合物和/或其衍生物或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦施用于处于CVD的风险下、疑患CVD或罹患CVD的受试者促成以下一者或多者：主动脉斑块形成减少、总胆固醇减少、血液中的三酸甘油酯水平降低、血液中的LDL水平降低、血液中的HDL水平增加、泡沫细胞的产生和/或数目减少、TMA(例如，TMAO)产生(例如，来自胆碱)减少、微生物菌群催化的TMA(例如，TMAO)产生减少，以及CVD的其它指标和/或风险因子改变。
在一些实施方案中，式I化合物、DMB、包含DMB的化合物、DMB相关化合物或图20-23和/或其衍生物的施用为一种或多种发炎性疾病提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)，所述发炎性疾病包括(但不限于)：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、关节炎(例如，类风湿性关节炎)、哮喘、CVD(例如，动脉粥样硬化)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、结肠炎、皮炎、憩室炎、肝炎、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮、肾炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、溃疡性结肠炎，等等。在一些实施方案中，如图20-23中所示的式I化合物、DMB、包含DMB的化合物、DMB相关化合物和/或其衍生物的施用为一种或多种心血管疾病提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)，所述心血管疾病包括(但不限于)：绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心脏衰竭、冠状动脉疾病(CAD)、颈动脉疾病、心内膜炎、心脏病发作(例如，冠状动脉血栓形成、心肌梗塞(MI))、高血压、高胆固醇血症/高脂质血症、二尖瓣脱垂、外周动脉疾病(PAD)、中风，等等。
在一些实施方案中，式I化合物(例如，DMB)或如图20-23中所示的化合物为过量胆碱(例如，过量膳食胆碱)相关的(例如，引起的)心血管疾病和/或发炎性疾病提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)。在一些实施方案中，式I化合物(例如，DMB)为过量三甲胺(例如，TMAO、源自胆碱的TMA，等等)相关的(例如，引起的)疾病、病状和/或病症提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)。在一些实施方案中，DMB为三甲胺(例如，TMAO、源自胆碱的TMA，等等)相关的(例如，引起的)疾病、病状和/或病症提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)。在一些实施方案中，式I化合物(例如，DMB)为过量三甲胺(例如，TMAO、源自胆碱的TMA，等等)相关的(例如，引起的)疾病、病状和/或病症提供治疗(例如，姑息性的、预防性的、治疗性的，等等)。在一些实施方案中，抑制胆碱转化成TMA(例如，TMAO)的式I化合物(例如，DMB相关化合物和/或其衍生物)为疾病提供治疗。在一些实施方案中，抑制胆碱转运的式I化合物(例如，DMB相关化合物和/或其衍生物)为疾病提供治疗。在一些实施方案中，式I化合物(例如，DMB相关化合物和/或其衍生物)降低CVD和/或由任何机制引起的其它发炎性疾病的风险。
在本发明的一些实施方案中，将组合物单独或与其它疗法、医药品、补充剂和/或指定膳食组合，或以医药组合物形式施用于患者，在医药组合物中其与赋形剂或其它医药学上可接受的载剂混合。取决于施用目标(例如，病状的严重性、治疗的持续时间，等等)、组合物(例如，包含式I化合物，如DMB)可以经过配制并且全身或局部施用。配制和施用的技术可以在"Remington's Pharmaceutical Sciences"(Mack Publishing Co,Easton Pa.)的最新版本中找到。适合的途径可以例如包括经口或经粘膜施用；以及肠道外递送，包括肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内施用。在一些实施方案中，式I化合物(例如，DMB)可以按固体、半固体或液体剂型的形式施用：如药片、胶囊、药丸、粉末、栓剂、溶液、酏剂、糖浆、悬浮液、乳膏、口含片、糊剂和喷雾，这些剂型经过适当配制以提供所需的治疗型态。如本领域的技术人员应认识到，取决于所选的施用途径来选择组合物形式。
在一些实施方案中，医药组合物(例如，包含式I化合物，如DMB)或N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦以单次或多次剂量施用。在一些实施方案中，医药组合物(例如，包含式I化合物，如DMB，或图20-23中所示的那些)以单次剂量施用。在一些实施方案中，提供单个口服药丸或胶囊，其含有医药组合物(例如，包含式I化合物，如DMB)和一种或多种额外医药剂。在一些实施方案中，使用含有医药组合物(例如，包含式I化合物，如DMB，或如图20-23中所示)的胶囊，其呈释放(例如，立即释放、定时释放、延迟释放，等等)的形式。特定施用途径和给药方案将由技术人员按照将要治疗的个体的状况和所述个体对治疗的反应来确定。在一些实施方案中，可以调整本发明的组合物的取代基以提供用于通过任何适合的技术施用的所需的溶解度或其它特征。
DMB在结构上类似于胆碱，除了DMB由于碳原子取代氮原子(见图2A和2B)而缺乏C-N键。因而，本发明涵盖胆碱衍生物的用途(参看例如EP0155825和US 2006020585；以全文引用的方式并入本文中)，胆碱衍生物经过改性以使得其由于类似的氮到碳的取代而缺乏C-N键。示范性的组合物以式I呈现。
在某些实施方案中，采用血小板凝集测试(例如，用来判定患者的血小板是否是高反应性的，从而导致CVD或血栓形成的风险增加)。血小板凝集或功能测试是一组使用设备来测量血小板凝集并促进血液样品凝固的能力的试验。如下文所描述，存在多种用于测量血小板功能的可用测试。
一种类型的试验被称为封闭时间试验。在这个试验中，将血液暴露于使血小板活化的多种物质。然后将血液牵引通过模拟的伤口，即小管中涂布有胶原蛋白(一种促进血小板结合到伤口的蛋白质)的小孔。在正常血液中，经过活化的血小板将结合到经过涂布的孔，最终堵塞其。测量堵塞这个孔所需的时间，就称为封闭时间。封闭时间越长，血小板功能越低下。如果血小板计数很低，如果血小板功能下降，如果血小板功能所需的其它蛋白质减少，或如果抗血小板药物存在，那么这个测试可能有异常。
另一种类型的试验被称为粘弹性测定试验。设计这种类型的试验以测定血液凝块在形成时的强度。将物质添加到血液中以开始凝固，同时随着时间测量凝块强度。测量由总凝块强度、达到最大强度的时间以及随着时间的强度损失组成。如果血小板计数很低，如果血小板功能下降，或如果抗血小板药物存在，那么这些测试可能有异常。
另一种类型的试验是终点小珠或终点血小板凝集试验。这些试验测定在添加物质以使血小板活化之后凝集的经过涂布的小珠或血小板的数目。其提供了凝集的单一量度(终点)而不是随着时间凝集的量度。凝集或粘在小珠上的血小板越多指示血小板功能越好。如果血小板计数很低，如果血小板功能下降，或如果抗血小板药物存在，那么这些测试可能有异常。
另一种类型的试验被称为出血时间试验。在过去，血小板功能异常的初步筛查是出血时间—一种涉及到在内前臂上制造两个小而浅的标准化切口并测量其停止出血所耗费的时间量的测试。
另一种类型的试验是血小板凝集测定试验。许多不同的物质可以使血小板活化，包括伤口中的蛋白质、从其它经过活化的血小板释放的因子，以及由帮助血小板形成强的栓塞以停止出血的凝血系统产生的因子。已经描述了由于这些活化系统中的一者或多者所伴随的问题而引起的许多不同的血小板异常。血小板凝集测定一般由4到8个独立测试组成。在每个测试中，将不同的血小板活化物质添加到血液中，接下来测量经过几分钟的血小板凝集。当完成时，医师或技术人员评论并解释整组测试以判定是否存在异常血小板功能的任何迹象。
额外的试验是基于流式细胞测量术。可以使用流式细胞测量术来评估血小板的功能缺陷。这个测试使用激光来确定存在于血小板表面上的蛋白质以及当血小板被活化时其如何变化。
额外的试验是基于体内血栓形成速率。可以响应特定刺激来评估在活生物体内血小板的活化并且进行监测，例如使用生体组织检镜，其实时地使血管内的血流和生长中的血栓(血小板凝块)直接成像。
在某些实施方案中，抗生素(例如，肠道菌群靶向抗生素)用于本发明的方法中。本发明不受所采用的抗生素的类型限制。所述抗生素试剂的实例包括(但不限于)氨基糖苷、袢霉素(Ansamycin)、碳头孢烯(Carbacephem)、碳青霉烯(Carbapenem)、头孢菌素(Cephalosporin)、糖肽、大环内酯、单菌霉素(Monobactam)、青霉素(Penicillin)、多肽、多粘菌素(Polymyxin)、喹诺酮(Quinolone)、磺酰胺、四环素(Tetracycline)，以及其它(例如，胂凡纳明(Arsphenamine)、氯霉素(Chloramphenicol)、克林霉素(Clindamycin)、林可霉素(Lincomycin)、乙胺丁醇(Ethambutol)、磷霉素(Fosfomycin)、梭链孢酸(Fusidic acid)、呋喃唑酮(Furazolidone)、异烟肼(Isoniazid)、利奈唑胺(Linezolid)、甲硝哒唑、莫匹罗星(Mupirocin)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、平板霉素(Platensimycin)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide)、奎奴普丁/达福普丁(Quinupristin/Dalfopristin)、利福平(Rifampicin)(在美国是利福平(Rifampin))、甲砜霉素(Thiamphenicol)、他咪唑(Timidazole)、氨苯砜(Dapsone)和氯法齐明(lofazimine))。这些种类的抗生素的实例包括(但不限于)阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、新霉素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、链霉素(Streptomycin)、托普霉素(Tobramycin)、巴龙霉素(Paromomycin)、格尔德霉素(Geldanamycin)、除莠霉素(Herbimycin)、氯碳头孢(Loracarbef)、厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亚胺培南/西司他丁(Imipenem/Cilastatin)、美罗培南(Meropenem)、头孢羟氨苄(Cefadroxil)、头孢唑林(Cefazolin)、头孢噻吩(Cefalotin或Cefalothin)、头孢氨苄(Cefalexin)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢孟多(Cefamandole)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢丙烯(Cefprozil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢克肟(Cefixime)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢妥仑(Cefditoren)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢泊肟(Cefpodoxime)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢布烯(Ceftibuten)、头孢唑肟(Ceftizoxime)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢吡普(Ceftobiprole)、替考拉宁(Teicoplanin)、万古霉素、阿奇霉素(Azithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、地红霉素(Dirithromycin)、红霉素(Erythromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、醋竹桃霉素(Troleandomycin)、泰利霉素(Telithromycin)、壮观霉素(Spectinomycin)、氨曲南(Aztreonam)、阿莫西林(Amoxicillin)、氨苄西林、阿洛西林(Azlocillin)、羧苄西林(Carbenicillin)、氯唑西林(Cloxacillin)、双氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、美洛西林(Mezlocillin)、甲氧西林(Meticillin)、萘夫西林(Nafcillin)、苯唑西林(Oxacillin)、青霉素、哌拉西林(Piperacillin)、替卡西林(Ticarcillin)、杆菌肽(Bacitracin)、粘杆菌素(Colistin)、多粘菌素B、环丙沙星(Ciprofloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、曲伐沙星(Trovafloxacin)、格帕沙星(Grepafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、替马沙星(Temafloxacin)、磺胺米隆(Mafenide)、偶氮磺胺(Sulfonamidochrysoidine)(古体词)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)、磺胺二甲异恶唑(Sulfanilimide)(古体词)、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、磺胺异恶唑(Sulfisoxazole)、甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim)、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲恶唑(rimethoprim-Sulfamethoxazole)(复方新诺明(Co-trimoxazole))(TMP-SMX)、地美环素(Demeclocycline)、多西环素(Doxycycline)、米诺环素(Minocycline)、氧四环素(Oxytetracycline)和四环素。
实验
实施例1
磷脂酰胆碱代谢物的结构专一性
在开发本发明的实施方案期间进行实验以检查磷脂酰胆碱代谢物在促进促动脉粥样硬化巨噬细胞表型方面的结构专一性，如通过内源泡沫细胞形成来监测。向断奶时的C57BL/6J.Apoe-/-小鼠安排普通饲料膳食(对照)或补充有胆碱、TMAO或胆碱类似物DMB的普通饲料，在DMB中胆碱的季胺氮被碳置换(见图2，右边)。因此，DMB在结构上与胆碱相同，除了不存在供肠道菌群潜在裂解并形成TMA的C-N键。补充有任一种三甲胺物质(胆碱或TMAO)的喂食小鼠的膳食显示出增加的巨噬细胞胆固醇含量与升高的血浆TMAO水平。相比之下，膳食DMB补充不会导致TMAO增加，并且不会增加内源巨噬细胞中的胆固醇蓄积。
实施例2
DMB对动脉粥样硬化的影响
在开发本发明的实施方案期间进行实验，其展示了富含胆碱的膳食(例如，西方膳食)导致增强的动脉粥样硬化，并且添加化合物DMB阻断膳食诱导的动脉粥样硬化增强。向断奶时(4周)的C57BL/6J.Apoe-/-雄性小鼠安排补充有1.3％胆碱、1.3％DMB、两者或未补充两者的饲料膳食。用油红O/溶血毒素将主动脉根部切片染色。在主动脉内部的红油染色区域指示损伤斑块(见图3和4)。添加DMB到普通饲料膳食中显著(约90％)减少apoE-/-小鼠中的主动脉斑块形成(见图4)。此外，添加胆碱完全阻断由高胆碱膳食诱导的动脉粥样硬化斑块的增加(见图4)。这些数据指示了DMB能够减少主动脉斑块形成并且逆转由高胆碱膳食诱导的斑块形成。这些数据进一步指示DMA可以提供用于预防和/或治疗斑块形成和动脉粥样硬化性心脏病的疗法。
实施例3
DMB对脂蛋白型态的影响
在开发本发明的实施方案期间进行实验以比较喂食小鼠的饲料或补充有1.3％胆碱、1.3％DMB或两者的饲料中(1)胆固醇、(2)三酸甘油酯、低密度脂蛋白-胆固醇和HDL胆固醇的血浆水平(见图5)。添加DMB到小鼠膳食中改善了小鼠的致动脉粥样硬化脂蛋白型态，其中致动脉粥样硬化胆固醇水平(总胆固醇、低密度脂蛋白和三酸甘油酯)显著降低并且高密度脂蛋白增加。
实施例4
DMB对胆固醇蓄积和泡沫细胞形成的影响
在开发本发明的实施方案期间进行实验以检查添加DMB对胆固醇蓄积和泡沫细胞形成的影响。向断奶时(4周)的C57BL/6J.Apoe-/-雄性小鼠安排补充有1.3％胆碱、1.3％DMB、两者或未补充两者的饲料膳食。收集腹腔巨噬细胞，固定于4％多聚甲醛中，并且用油红O/溶血毒素染色。添加DMB逆转了高胆碱膳食诱导的胆固醇蓄积和泡沫细胞形成(见图6)。
实施例5
DMB对总胆固醇的影响
在开发本发明的实施方案期间进行实验以确定DMB对小鼠腹腔巨噬细胞中的总胆固醇水平的影响(见图7)。向断奶时(4周)的C57BL/6J.Apoe-/-雄性小鼠安排补充有1.3％胆碱、1.3％DMB、两者或未补充两者的饲料膳食。通过稳定同位素稀释LC/MS/MS来定量细胞的总胆固醇。用细胞溶解物中的蛋白质含量来定量细胞数。通过添加DMB阻断了由高胆碱膳食诱导的巨噬细胞胆固醇含量的显著增加(见图7)。这些数据指示了高胆碱膳食诱导的泡沫细胞形成的减少。
实施例6
DMB对三甲胺产生的影响
在开发本发明的实施方案期间进行实验以检查DMB对肠微生物菌群催化的从胆碱产生三甲胺的影响。将小鼠盲肠均化以作为肠微生物菌群的来源。D9-胆碱用作底物，并且通过稳定同位素稀释LC/MS/MS来定量d0-TMA的产生。添加DMB明显抑制肠道菌群介导的胆碱分解代谢成TMA(见图8)。
实施例7
DMB和抗生素抑制TMAO产生和血小板凝集
在开发本发明的实施方案期间进行实验以检查DMB和抗生素对压制肠道菌群介导的TMAO产生以及对压制血小板凝集的作用。
1)展示出DMB和抗生素抑制体内TMA和TMAO形成。
向六周大的雌性小鼠安排指定膳食+/-图9中所示，包括饲料、饲料+抗生素(ABS；其为0.5g/L万古霉素、1g/L硫酸新霉素、1g/L甲硝哒唑和1g/L氨苄西林)、TMAO、CH(补充有1.0％wt/wt胆碱的饲料)、CH与ABS，以及CH+DMB。向6周龄的小鼠安排这些膳食，并且用膳食维持3周。然后回收血浆，并且通过稳定同位素稀释LC/MS/MS测定TMA与TMAO。注意，富含胆碱的膳食(类似于西方膳食)导致血浆TMA和TMAO水平增加。图9示出了用口服广谱抗生素压制肠菌群抑制了TMA和TMAO产生，从而确认TMA和TMAO形成的肠道菌群需求。图9还示出了DMB抑制高胆碱膳食的小鼠中的TMA和TMAO形成。
2)高胆碱膳食增强体外血小板凝集并且膳食胆碱介导的血小板高反应性通过用口服抗生素压制肠道菌群而受抑制。
在这个实施例中，向小鼠在断奶时安排普通饲料膳食，或安排高胆碱膳食。几周后，移出全血，并且分离血小板。然后测定血小板的次最大激动剂ADP触发血小板凝集的能力。平行地，通过已经确立的稳定同位素稀释LC/MS/MS分析来测定TMAO的血浆水平。如图10A中所示，高胆碱膳食的动物具有提高的TMAO血浆水平。重要地，来自这些动物的血小板还显示出明显增强的血小板凝集反应。这是高胆碱膳食的小鼠中促血栓形成表型的明确信号。在类似的研究中，也向高胆碱的小鼠安排广谱抗生素的混合液(描述于上文和Wang等,Nature 2011年4月,472(7341):57-63中，出于所有目的以全文引用的方式并入)以压制肠微生物菌群，并且降低血浆TMAO水平。如图10B中所示，血浆TMAO的压制明显减少胆碱膳食诱导的血小板凝集增加。这些数据指示了可以减少膳食依赖性TMAO产生的药物可以是抗血栓形成的，从而降低血小板高反应性。所述药物(例如，DMB或抗生素)由于其不应诱导过量出血(例如，如同商业的抗血栓形成药物，如氯吡格雷或华法林(Warfarin))而有吸引力。就是说，TMAO只加强血小板功能，并且降低TMAO水平(如同使用DMB、抗生素或一些其它药物或方法、功能食物、益生素或益生元)将减少体内血栓形成，而不会降低低于“正常”的功能，并且因此不会增加出血风险。
3)肠道菌群酶抑制剂DMB抑制由膳食胆碱诱导的血小板高反应性。
使用与上述部分2)所描述的相同的实验设计，但这次向小鼠组中的一组安排补充有胆碱的膳食并且给予DMB。图11A示出了高胆碱膳食的动物具有提高的TMAO血浆水平，并且图11B示出了DMB抑制小鼠中的TMAO形成，而且明显降低血小板高反应性。
4)靶向负责TMAO形成的肠道菌群酶抑制来自膳食胆碱的血小板高反应性。
图12概括了来自上述小鼠组的数据。图12绘制了血小板凝集反应对比指定膳食和治疗(菌群的DMB或抗生素压制)的最大幅度。概括起来，图12示出了添加DMB阻断来自高胆碱膳食或内源TMAO的血小板高反应性(凝集)。图12示出了富含胆碱的膳食提高血小板凝集速率，但只有在完整肠菌群存在下才这样，因为用抗生素压制菌群防止TMAO形成，并且抑制膳食诱导的血小板凝集增强。图12进一步示出了用TMAO直接补充膳食促进血小板凝集增强。
5)膳食胆碱的肠道菌群依赖性代谢物TMAO提高动脉粥样硬化倾向的ApoE-/-小鼠的体内血栓形成速率。
在这个实施例中，使用生体组织检镜对图13中的指定小鼠组测定颈动脉体内血栓形成速率。向小鼠安排指定膳食+/-ABS，持续3周。注意，富含胆碱的膳食产生TMAO并且加速体内血栓形成速率，但只有在完整肠菌群存在下才这样，因为用抗生素压制菌群防止TMAO形成，并且抑制膳食诱导的体内血栓形成速率提高。还注意，用TMAO直接补充膳食促进体内血栓形成速率加速。
图13中所示的数据指示了抑制TMAO形成应使得血栓形成速率降低。这些研究延伸到在来自多种指定膳食的小鼠的体外血小板凝集研究之前所见的体内研究。注意，富含胆碱的膳食提高体内血栓形成速率，如通过颈动脉中血流停止的时间来监测。时间越短指示血小板凝集越快(增强的体内血栓形成)。
6)膳食胆碱的肠道菌群依赖性代谢物TMAO提高野生型小鼠的体内血栓形成速率。
这个实施例重复上文刚才的研究，除了使用野生型小鼠。结果示于图14中。图14指示了抑制野生型小鼠中的TMAO形成使得血栓形成速率降低。这是有意义的，因为其显示出个人并不必须受来自TMAO的增强的血小板活化的影响而患有高脂质血症。
7)DMB抑制WT小鼠中TMAO介导的体内血栓形成速率提高
使用生体组织检镜对图15中所示的指定小鼠组测定颈动脉体内血栓形成速率。向小鼠安排指定膳食+/-ABS或DMB，持续3周。图15示出了在存在对比不存在抗生素或DMB的情况下小鼠的体内血栓形成数据的概括。图15示出了DMB和抗体阻断高胆碱膳食所见的体内血栓形成速率的降低，而且阻断TMAO水平。
实施例8
磷脂酰胆碱的肠道菌群代谢预示主要不良心脏事件的风险
这个实施例描述了所进行的实验，其显示了磷脂酰胆碱的肠道菌群代谢预示主要不良心脏事件的风险，并且抗生素可以用于压制所述肠道菌群代谢(并且因此可以用于预防心脏事件)。
方法
研究患者和设计
在这个实施例中描述了获克利夫兰医学中心机构审查委员会(Cleveland Clinic Institutional Review Board)批准的两个前瞻性研究。所有参与者都给予书面知情同意书。第一个研究代表了年龄>18岁的健康志愿者的队列(N＝40)，其没有慢性病或终末器官功能障碍(包括心脏衰竭、肾衰竭、肺病或血液病的已知病史)，没有活动性感染或接受抗生素，并且没有使用益生素。受试者在第1次随访期间经历膳食“磷脂酰胆碱(PC)激发”(见下文)。在他们当中，向6名每天给予500mg甲硝哒唑两次并且每天给予500mg环丙沙星一次，持续1周，并且重复在抗生素之后进行的PC激发(第2次随访)。在停用抗生素和重新获得肠道菌群之后≥一个月进行第三次和最后的PC激发(第3次随访)。
第二个研究由年龄≥18岁的4,007名稳定成人受试者组成，其经历选择性诊断心导管检查，没有急性冠状动脉综合症的迹象并且心肌钙蛋白I(cTnI)<0.03μg/L。CVD被定义为冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病、冠状动脉或外周血管再生、在冠状动脉造影期间一个或多个血管上>50％狭窄的有记载的病史，或心肌梗塞(MI)或中风的病史。用科克罗夫特-高尔特方程式(Cockcroft-Gault equation)来估算肌酐清除率。在Abbott Architect平台(Abbott Laboratories,Abbott Park IL)上测量常规实验室测试，但髓过氧化物酶除外，其使用CardioMPO测试(Cleveland Heart Labs,Inc.,Cleveland,OH)来测定。在录入之后对于所有受试者经过随后的3年确认裁定的结果，包括MACE(主要不良心脏事件)，如全因死亡率、非致命性MI或非致命性中风。
膳食磷脂酰胆碱激发
将简单的膳食PC/胆碱激发测试以已知来源的PC的形式连同示踪水平的可摄取的氘标记PC(d9-三甲基-二棕榈酰基磷脂酰胆碱氯化物[d9-PC])作为标准医用同位素一起提供给受试者(在调查性新药(Investigational New Drug)免除审查下)。每个“PC激发”由过夜(12小时)的快速和散点随机尿液收集之后在基线处抽吸的血液组成。在基线处，向受试者提供2个包括蛋黄(估计每个蛋黄的总胆碱为约250mg)的硬水煮蛋(大尺寸)以在10分钟的时段内与含50mg d9-PC的明胶胶囊一起进食。在1、2、3、4、6和8小时的时间点进行连续静脉血取样，伴随进行24小时尿液收集。所提供的高纯度d9(三甲基)-PC(>98％同位素富集)在用d3-甲基碘进行彻底甲基化之后从1-棕榈酰基,2-棕榈酰基,sn-甘油-3-磷酸乙醇胺合成(Cambridge IsotopesLaboratories Inc,Andover MA)。通过制备型薄层色谱法和高效液相色谱法分离d9-PC，结晶并在真空下干燥，并且通过多核NMR和质谱分析确认其纯度(>99％)。
胆碱代谢物的测量
从收集到乙二胺四乙酸管中的全血分离出所分析的血浆等分试样，维持在0-4℃下直到在4小时内处理，并且储存在-80℃下。将来自24小时尿液收集的等分试样离心旋转以使任何潜在的细胞碎片沉淀，并且将上清液储存在-80℃下直到分析。使用稳定同位素稀释HPLC来定量TMAO、三甲胺(TMA)、胆碱、甜菜碱和其d9同位素体，其中使用如最近所描述的在线电喷雾电离串联质谱分析(LC/ESI/MS/MS)方法，使用d4(1,1,2,2)-胆碱、d3(甲基)-TMAO和d3(甲基)-TMA作为内标10。为了测量血浆中的TMA，将样品酸化(最终10mM HCl)，随后储存在-80℃下。通过尿液肌酐浓度的分析来调整尿液中TMAO的浓度用于进行尿液稀释。
统计分析
使用用于连续变量的斯氏t检验(Student's t-test)和威尔科克森秩和检验(Wilcoxon-Rank sum test)以及用于分类变量的卡方检验(chi-square test)以检查组之间的差异。将血浆TMAO水平分成四分位数以供分析。使用Cox比例危险回归的卡普兰-迈耶分析用于时间事件分析以确定MACE的危险比(HR)和95％置信区间(95％CI)。通过针对包括年龄、性别、收缩压、糖尿病病史、低密度和高密度脂蛋白胆固醇、三酸甘油酯、吸烟史的传统心脏风险因子，加上BMI、药物、估算的肌酐清除率和血浆hsCRP水平作调整来进行逻辑回归分析。使用净重新分类改善(NRI)指数来评估通过纳入TMAO而引入的模型性能的改善。使用ROC曲线下面积来计算C统计量。从Cox模型估算MACE事件的三年预测概率。所有分析都使用R版本2.8.0(Vienna,Austria)进行。P值<0.05(双侧)被认为是统计上显著的。
结果
TMAO是人类中膳食PC的代谢物并且肠道菌群在其形成中起到强制性作用。
人类中膳食PC消化的主要路径是经由胰脂肪酶，其被分泌到肠腔中并且促进脂肪酸从磷脂裂解，于是甘油磷酸胆碱与游离脂肪酸都被吸收16,17。最近在无菌和常规的小鼠中的同位素示踪剂研究显示，啮齿动物中膳食PC(和胆碱)的定量次要代谢路径最终产生促动脉粥样硬化代谢物TMAO，其产生需要肠微生物菌群10。尚未确立人类中的TMAO产生是否需要肠道菌群。因此，在初始研究中试图判定TMAO是否可以来源于受试者中的膳食PC，并且如果这样的话，TMAO的形成是否需要肠微生物菌群。蛋黄是PC的已知膳食来源。在PC激发之后，未标记的TMAO、胆碱和甜菜碱存在于基线处的空腹血浆中(图16c)，并且在PC/d9-PC摄取之后在血浆中容易地检测到TMAO与d9-TMAO，如通过LC/MS/MS监测(图16a、b)。在餐后也观测到TMAO、胆碱和甜菜碱的天然同位素(图16d)与d9示踪剂形式(图16c)的时间依赖性增加。在“PC激发”之后24小时尿液样本的检查类似地显示出TMAO和d9-TMAO的存在(图19)。在健康受试者队列(n＝40)中在血浆与绝对尿液TMAO浓度(史皮尔曼相关系数(Spearman's r)＝0.58，p<0.001)和尿液TMAO/肌酐比(史皮尔曼相关系数＝0.91，p<0.001)之间观测到强相关性。明显地，通过服用口服广谱抗生素1周压制肠微生物菌群使得空腹血浆中可检测的TMAO以及在PC激发之后血浆(图16中央(第2次随访))或24小时尿液收集(图19)中的TMAO或d9-TMAO完全压制。在平行分析中，在第1次随访时在PC激发之后观测到血浆TMA和d9-TMA的餐后升高，但在抗生素之后被完全压制到不可检测的水平。相比之下，游离胆碱或甜菜碱(天然丰度和d9同位素体)的餐后变化的时程不因肠微生物菌群的压制而改变。在停用抗生素和重新获得肠微生物菌群之后经过随后的≥一个月，志愿者的PC激发再次引起血浆(图16)和24小时尿液收集(图4)中TMAO和d9-TMAO的可容易检测和时间依赖性的变化。合起来说，这些结果确立了血浆和尿液TMAO(和TMA)以及游离胆碱和甜菜碱全部形成为人类中膳食PC的代谢物。这些结果还揭露了肠微生物菌群在来自人类中的膳食PC的TMA和TMAO而不是胆碱或甜菜碱的产生中的强制性作用。最后，这些结果指示了肠微生物菌群在影响TMAO的血浆水平中比膳食起到更重要的作用，因为相对于在受试者中观测到的空腹血浆水平的广度(见下文)，进食状态对比禁食状态在个体内仅显示出轻微的变化。
肠道菌群依赖性代谢物TMAO的升高的血浆水平预测非致命性心脏病发作、中风和死亡的偶发风险。
接下来试图检查受试者中TMAO的空腹血浆水平与偶发心血管风险之间的关系。表1说明了具有空腹血浆TMAO水平和长期心血管结果的4,007名受试者的基线特征。
表1.基线特征
值用平均值±标准偏差或中值(四分位间距)表示。
缩写：LDL-c，低密度脂蛋白胆固醇；HDL-c，高密度脂蛋白胆固醇；ApoB，载脂蛋白B；ApoA1，载脂蛋白A1；hsCRP，高敏C反应蛋白；MPO，髓过氧化物酶；WBC，白血球；ACE，血管紧张素转化酶；TMAO，三甲胺N-氧化物
所检查的队列代表了经历选择性心脏评估的中度风险群体，其具有相对良好控制的空腹脂质型态并保留肾功能(表1)。与最低四分位数相比，最高四分位数具有2.5倍增加的风险(HR 2.5，95％CI 2.0-3.2；p<0.001，表2)。
表2.用TMAO的四分位数水平分层的3年MACE风险的未调整和调整的危险比
**p<0.01；HR，危险比。Cox比例危险分析变量被调整为+1个对于连续变量的标准偏差增量。
模型1：针对传统风险因子(年龄、性别、吸烟、收缩压、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和糖尿病)加上对数转换的hsCRP作调整
模型2：针对传统风险因子加上对数转换的hsCRP、髓过氧化物酶、对数转换的估算GFR、总白细胞计数、身体质量指数、阿司匹林、他汀类、ACE抑制剂和β阻断剂作调整
与渐增的TMAO水平相关的MACE的分级风险增加在图17中所示的卡普兰-迈耶分析中清楚地说明。当独立地分析终点时，更高的TMAO水平还赋予了3年追踪的死亡(HR 3.2，95％CI 2.1-4.8；p<0.001)和非致命性MI或中风(HR 2.3，95％CI 1.5-3.6；p<0.001)的显著更高的风险。在针对传统风险因子、hsCRP、eGFR和其它发炎/代谢协变量作调整之后，升高的血浆TMAO水平保持了3年的偶发MACE的显著增加的风险(表2)。纳入TMAO使得风险评估较传统风险因子有显著改善(NRI 8.6％，p<0.001；IDI 9.2％，p<0.001；C统计量68.3％对比66.4％，p＝0.01)。在独立的分析中，排除了在录入研究中之后的30天内经历血管再生的受试者。在这个子队列(n＝3,475)中，TMAO保持与偶发MACE风险显著相关(Q4对比Q1，未调整的HR(95％CI)，2.47(1.87-3.27)；调整的HR(95％CI)，1.79(1.34-2.4)；两个p<0.001)。
肠道菌群代谢物TMAO的升高的血浆水平预测相对较低风险队列中增加的MACE风险。
升高的血浆TMAO水平的预后价值在具有降低的整体心脏风险的各种子组中保持显著(图18)，包括较年轻的那些、在女性当中、没有CVD或CAD等危症的已知病史的那些、针对侵袭性治疗目标治疗脂质的那些、或具有正常血压的那些、非吸烟者、或在具有较低水平的其它已知的心脏/发炎风险标志的那些当中，这些标志如hsCRP、髓过氧化物酶或白血球计数(图18)。
讨论
自从1856年发现以来，胆碱和TMAO代谢已经在动物与人类中广泛地研究4,11,18,19,20。最近使用无菌小鼠的动物模型研究指示了肠道菌群在设置富含PC/胆碱的膳食下经由形成代谢物TMA并转化成TMAO而在动脉粥样硬化中起作用10(以全文引用的方式并入本文中)。尽管已经展示了肠道菌群有助于在动物中产生TMA/TMAO，但尚未确立肠道菌群参与从人类中的膳食PC制造TMAO。这个实施例经由使用稳定同位素示踪剂喂养研究展示了从人类中的膳食PC产生促动脉粥样硬化代谢物TMAO。这个实施例经由用口服广谱抗生素压制肠道菌群，然后在停用抗生素和肠定植之后重新获得TMAO进一步展示了肠道菌群在人类中的TMAO产生中的作用。最后，这个实施例通过显示空腹血浆TMAO水平不依赖于传统心血管风险因子并且在多个较低风险子组内预测MACE的未来发展而展示了这种肠道菌群产生的代谢物的潜在临床预后意义，这些子组包括初级预防受试者与具有更侵袭性的LDL胆固醇或载脂蛋白B目标的受试者。本发明的发现指向肠道菌群依赖性路径在人类的动脉粥样硬化性CAD的病理生理学中的重要贡献，并且指示了抗生素治疗将适用于治疗或预防CAD和相关病状(例如，血栓形成)。
肠微生物菌群在复杂的代谢疾病(如肥胖)中的重要性通过若干开创性研究已经得到广泛认可6-9,21,22。口服广谱抗生素暂时压制肠道菌群和TMAO产生的能力直接展示了肠道菌群在从人类中的PC/胆碱产生TMAO中起到强制性作用。肠道菌群使膳食PC的胆碱部分转化成TMA，其随后被肝FMO转化成TMAO10,24。TMA被肝FMO转化成TMAO的需求25可以帮助解释在经口摄取d9-PC之后在d9-TMAO水平的检测中观测到的延迟，因为监测TMA和d9-TMA产生的独立分析显示出与前体→产物关系一致的时程。有趣的是，TMAO作为重要的等渗液体食物(osmolite)已经在鱼中被鉴别到26，并且鱼的摄取提高了尿液TMAO水平。尽管如此，尿液与血浆TMAO水平之间的高度相关性支持了TMAO的有效尿液清除作为去除含氮废物的手段。因此，TMAO的有效排泄机制由此可以提供保护以防止TMAO如同其它“尿毒症毒素”一样蓄积，并且不会破坏TMAO与心血管风险之间的机制性关联。
虽然先前已经假定了感染病因与动脉粥样硬化之间的关联，但考察抗微生物疗法在预防疾病进展中的作用的研究已经令人失望27,28。重要的是认识到抗微生物疗法(例如，阿奇霉素)的选择在很大程度上是基于靶向假定的生物体(例如，肺炎衣原体(Chlamydia pneumonae))而不是调节肠道菌群组成或其代谢物。在这个实施例中在本发明的研究队列中较高水平的TMAO与偶发心血管风险之间的观测结果确认了从动物模型到人类在PC/胆碱代谢和心血管表型中肠道菌群-宿主相互作用之间的直接关联。替代用抗生素根除病原微生物，本发明的发现暗示血浆TMAO水平可以潜在地鉴别出服从治疗性调节的相对保守的肠道菌群路径。因此，肠微生物菌群涉及到动脉粥样硬化的发展中的认识表明了用于治疗性干预的多个新的潜在途径。举例来说，维持膳食PC的充足而有限的过度消耗有明显的好处，例如经由采用含更多素食和高纤维的膳食，因为这可以潜在地调节肠道菌群组成并且减少总胆碱摄入21。确实，如果采用标准膳食建议的一部分，那么将限制富含PC和胆碱的食物，因为这些食物的脂肪和胆固醇含量通常很高3。或者，靶向肠道菌群调节的干预应在心血管疾病预防中起到重要的附加作用，其使用如益生素的“功能食物”22，或甚至药物干预。这后一种干预可以采用抑制剂的形式以阻断特定肠道菌群介导的路径，或甚至采用短程的非全身性抗生素的形式以减少TMAO产生微生物的“负荷”，如在肠易激综合症的治疗中所见29。
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尽管已经结合特定实施方案描述了本发明，但应了解，如所要求的本发明不应过度地限于所述特定实施方案。确实，相关领域的技术人员所了解的用于执行本发明的所描述的模式的各种修改打算处于以上权利要求书的范围内。

Claims (20)

1.一种治疗和/或预防心血管疾病和/或血栓形成的方法，其包括：
a)鉴别具有增加的血小板凝集和/或升高的TMAO水平的受试者，以及
b)向所述受试者施用：i)包含选自由以下组成的群组的化合物的组合物：N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦；和/或ii)包含由式I表示的化合物的组合物：
其中n为整数，或n为0，指示CH2不存在；
其中Y为C、Si、P、S、Ge、Sn、Pb、P、As、Sb或Bi；
其中X为O或S并且相应键存在或不存在或为双键，
其中R为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；
其中Z为C、CH2、CH、O或S，
其中XR为酯、硫酯或硫羰酸酯；甘油，或以下三个式之一：
其中R'为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；并且
其中X'为O或S。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将益生元、益生素和/或纤维施用于所述受试者。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述鉴别包括观察对来自所述显示增加的血小板凝集的受试者的样品进行的血小板凝集试验的结果。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述鉴别包括观察对来自所述显示升高的TMA或TMAO水平的受试者的样品或呼出气进行的TMA或TMAO试验的结果。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述式I具有选自由以下组成的群组的式：
6.如权利要求1所述的方法，其中所述式I具有选自由以下组成的群组的式：
7.如权利要求1所述的方法，其中所述式I具有选自由以下组成的群组的式：
8.如权利要求1所述的方法，其中所述式I当施用于受试者时诱导以下一者或多者：降低的三甲胺水平、降低的TMAO水平、降低的总胆固醇水平、降低的LDL水平、增加的HDL水平、降低的三酸甘油酯水平、降低的葡萄糖水平和降低的血红蛋白A1C水平。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述二甲基丁醇和/或其衍生物当施用于受试者时降低心血管疾病和/或血栓形成的风险。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述式I具有选自由以下组成的群组的式：
11.如权利要求1所述的方法，其中所述式I具有选自由以下组成的群组的式：
12.一种治疗和/或预防心血管疾病和/或血栓形成的方法，其包括向受试者施用：i)包含选自由以下组成的群组的化合物的组合物：N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦；和/或ii)包含由式I表示的化合物的组合物：
其中n为整数，或n为0，指示CH2不存在；
其中Y为C、Si、P、S、Ge、Sn、Pb、P、As、Sb或Bi；
其中X为O或S并且相应键存在或不存在或为双键，
其中R为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；
其中Z为C、CH2、CH、O或S，
其中XR为酯、硫酯或硫羰酸酯；甘油，或以下三个式之一：
其中R'为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；并且
其中X'为O或S。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述受试者已经被确定为具有增加的血小板凝集。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述受试者已经被确定为具有升高的TMAO水平或升高的TMA水平，如通过呼吸测试所指示。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述施用是以使得所述心血管疾病和/或所述血栓形成的至少一个症状减轻或消除为条件。
16.如权利要求11所述的方法，其进一步包括将益生素、益生元和/或纤维施用于所述受试者。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述组合物包含二甲基丁醇。
18.如权利要求11所述的方法，其中所述组合物与一种或多种为心血管疾病提供治疗的试剂共同施用。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含一种或多种靶向肠道菌群的抗生素。
20.一种食物或饮料，其包含：i)选自由以下组成的群组的化合物：N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)、N-甲基乙醇胺(MEA)、乙醇胺(EA)、三甲基甲硅烷基乙醇和P,P,P-三甲基乙醇膦；和/或ii)由式I表示的化合物：
其中n为整数，或n为0，指示CH2不存在；
其中Y为C、Si、P、S、Ge、Sn、Pb、P、As、Sb或Bi；
其中X为O或S并且相应键存在或不存在或为双键，
其中R为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；
其中Z为C、CH2、CH、O或S，
其中XR为酯、硫酯或硫羰酸酯；甘油，或以下三个式之一：
其中R'为H、烷基、烯基、炔基、苯基或苯甲基；并且
其中X'为O或S。
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