CN112969454A - 抑制胆碱向三甲胺(tma)的转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过提供包含假泽兰属的提取物的化合物来抑制个体中胆碱向三甲胺(TMA)的转化并且降低TMAO的方法。

Description

抑制胆碱向三甲胺(TMA)的转化的方法
技术领域
本发明一般涉及抑制个体中三甲胺产生的材料和方法。
背景技术
三甲胺(TMA)及其衍生物三甲胺N-氧化物(TMAO)是与诸如肾病、胰岛素抗性、糖尿病、肥胖症、阿尔茨海默病、痴呆、认知损害、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、三甲基胺尿症和心血管疾病(CVD)之类的障碍相关的代谢物。TMA在肠道中由细菌产生，该细菌能够将包括但不限于胆碱的底物转化为TMA。对于抑制由细菌产生TMA的组合物存在尚未满足的需求。
CVD是一个通用术语，其涵盖影响心脏和血管的一系列病况，包括动脉粥样硬化、冠心病、脑血管疾病、心力衰竭、心肌病、动脉粥样硬化血栓性疾病、主动脉-髂骨疾病和外周血管疾病。CVD通常与涉及狭窄、堵塞、动脉瘤或一个或多个血管解剖或血栓形成(血块形成)的病况相关。与CVD相关的并发症包括但不限于心肌梗塞、中风、心绞痛、急性冠脉综合征、短暂性脑缺血发作、充血性心力衰竭、主动脉瘤、心房颤动或扑动、室性心律失常、心脏传导异常、需要血运重建和死亡。血运重建可以包括但不限于血管成形术、支架置入术、冠状动脉旁路移植术、维修或置换血管分流器或通路诸如动静脉瘘。与动脉粥样硬化血栓性疾病相关的并发症包括但不限于心肌梗塞、中风、肺栓塞、深静脉血栓形成。根据世界卫生组织，CVD是全球死亡的主要原因，其中超过75％的死亡在低收入和中等收入国家发生。世界卫生组织简报第317号，2015年1月更新。世界卫生组织预测，到2030年，糖尿病将成为第七大死因。世界卫生组织简报第312号，2015年1月更新。包括CVD和糖尿病的与TMA和TMAO相关的病况的预防和管理是一个重大的公共卫生问题。
使用植物提取物来治疗各种病症和疾病是传统药物和现代治疗的公认部分。发现假泽兰属的成员(菊科的一部分)遍布于南美洲和中美洲。示例性物种包括M.guacoBonpl.、薇甘菊(M.micrantha)、M.cordifolia、M.trinervis、M.trachypleura、M.grazielae、M.sessilifolia、M.speciosa和M.scandens。报道了来自不同假泽兰属物种的提取物，所述提取物在各种疾病相关途径中具有效果，包括抗炎有益效果、抗菌效果、毒蛇咬伤治疗效果、和止痛效果。Brigida da Silva AS,Owiti AO,BarbosaWL.Pharmacology of Mikania genus:A systematic review.Phcog Rev 2018；12:230-237；Rufatto LC,Gower A,Schwambach J,Moura S.Genus Mikania:chemicalcomposition and phytotherapeutical activity，Brazilian Journal ofPharmacognosy 2012；22(6):1384-1403。然而，没有已知的抑制胆碱向TMA的转化的来自假泽兰属物种的提取物的报道。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现：来自假泽兰属的植物提取物抑制通过肠道或消化道微生物群的胆碱代谢，从而导致三甲胺(TMA)的形成降低。我们惊奇地发现，Mikaniaguaco Bonpl.提取物在体内和体外抑制胆碱向TMA的转化。本公开提供用于例如在体外和体内抑制胆碱向TMA的转化以改善或维持心血管、脑血管或外周血管健康并改善或预防与TMA和TMAO相关的病症的组合物和方法。在某些方面，本发明提供一种或多种抑制个体中胆碱向TMA的转化的方法。
在某些方面，本发明提供一种或多种减少TMAO产生的方法，该方法包括通过提供假泽兰属的提取物来抑制细菌将胆碱向TMA的转化。本发明提供一种抑制个体中胆碱向TMA的转化的方法。该方法包括向个体施用包含假泽兰属提取物的组合物。
本发明还提供改善或维持心血管健康的方法。方法可包括以改善或维持心血管健康的量向个体施用包含如本文所述的假泽兰属提取物的组合物。本发明还提供改善个体中与胆碱向TMA的转化相关的病症的方法。该方法包括以有效改善病症的量向个体施用包含如本文所述的假泽兰属提取物的组合物。在一些实施方案中，病症可以是三甲基胺尿症、肾功能降低或受损、肾病、慢性肾病(CKD)、终末期肾病(ESRD)、胰岛素抗性、糖尿病、肥胖症、阿尔茨海默病、痴呆、认知损害、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或心血管疾病，诸如心绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病(CAD)、颈动脉疾病、心内膜炎、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞(MI)、高血压/高血压症、高胆固醇血症/高脂血症、外周动脉疾病(PAD)或中风。在一些实施方案中，病症是由于口腔生物膜形成和牙周病引起的不良心室重构、心室收缩功能障碍、心室舒张功能障碍、心脏功能障碍、室性心律失常、或心血管疾病或动脉粥样硬化。
本发明还提供假泽兰属提取物在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持心血管健康以及改善与胆碱向TMA的转化相关的病症中的用途；以及包含假泽兰属提取物的组合物用于在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持心血管健康以及改善与胆碱向TMA的转化相关的病症的用途。
上述总结并非旨在限定本发明的每个方面，而且在其它部分描述了附加方面，诸如具体实施方式。此外，本发明包括(作为附加方面)以任何方式在范围上比由上文示出的特定段落所定义的变体更为狭义的本发明的全部实施方案。例如，本发明的某些方面被描述为属，并且应当了解属的各个成员各自是本发明的一个方面。另外，应当将以属来描述或者选择属的成员的方面理解为涵盖属的两个或更多个成员的组合。在某些方面，本发明可被描述为涉及底物，例如胆碱，并且还可涉及所述底物的代谢物或前体，例如胆碱的前体或代谢物，诸如卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷酸胆碱或甘油磷酸胆碱。
对于以“一个”或“一种”来描述或进行权利要求的本发明的方面，应当了解这些术语意味着“一个(种)或多个(种)”，除非上下文明确要求更受限制的含义。术语“或者”应该理解为涵盖了另选的或共同的条目，除非上下文明确另有要求，例如X或Y意指X或Y或者上述两者。如果本发明的方面被描述成“包含”特征，则实施方案还考虑了“由……所述特征组成”或者“基本上由……所述特征组成”。
具体实施方式
本发明的组分描述于以下段落中。
本发明提供减少TMA产生的一种或多种方法，该方法包括：使用包含假泽兰属的一种或多种提取物的组合物抑制由细菌引起的胆碱向TMA的转化。此类假泽兰属的组合物或提取物可用于在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，或抑制细菌产生TMA，或使细菌的多微生物混合物的组成(诸如在肠道内)向不太能够生成TMA的群落转变。细菌的多微生物混合物的组成变化可由于有利于作为代谢底物的胆碱和/或胆碱相关化合物的细菌菌种的增殖减少。假泽兰属的一种或多种提取物以及包含假泽兰属的一种或多种提取物的一种或多种组合物可以有效抑制由个体肠道或消化道中的细菌例如由底物(包括但不限于胆碱)产生TMA和TMAO的量施用于个体。
由驻留在哺乳动物肠道中的细菌合成的TMA在肝脏和表达黄素单加氧酶(FMO)的其他组织(包括但不限于脂肪组织)中被氧化为三甲胺N-氧化物(TMAO、TMANO)。TMA的示例性前体包括胆碱、甜菜碱、磷脂酰胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、肉毒碱、L-肉毒碱、TMAO、鞘磷脂和卵磷脂，它们中的许多来自饮食来源，诸如例如全蛋和牛肝。这些来源可作为细菌的底物，可将它们代谢成TMA。不希望受特定机制或生物化学途径的束缚，通过甘氨酰基酶同系物、胆碱三甲胺裂解酶(CutC)促进胆碱向TMA的厌氧转化。Craciun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(2012),109:21307-21312。个由体肠道中的细菌引起胆碱向TMA的转化的降低引起从肠吸收的TMA降低，引起肝脏中由黄素单加氧酶3(FMO3)酶使TMA氧化成TMAO后血浆TMAO的随后降低。Wang等人，Nature(2011),472:57-63。较低的血浆TMAO水平与人类主要心血管事件的较低发生率有关。Tang等人，New England Journal of Medicine(2013)368:1575-1584。胆碱向TMA的转化可以由一种细菌介导或者包含涉及两种、三种或更多种细菌的多步骤过程。
如前所述，本发明至少部分地基于以下发现：假泽兰属提取物干扰肠道微生物群的胆碱代谢，从而引起TMA和三甲胺N-氧化物(TMAO)的形成降低。本公开提供用于例如在体外和体内抑制胆碱向TMA的转化以改善或维持心血管、脑血管和外周血管健康并改善或预防与增加的TMA和TMAO相关的病症的组合物和方法。与TMA水平的升高相关的其他病症可包括由阴道中的细菌产生TMA导致阴道气味，或者由身体上的细菌产生TMA导致体臭，或者由口腔中的细菌产生TMA导致口臭或口腔护理生物膜形成，或在妊娠期间，其中孕晚期和产后期与血栓形成的风险增加相关，因此降低TMA和TMAO的水平可能会降低这种风险。本公开还提供了用于通过抑制胆碱分解代谢来增加在患有其中胆碱可用性增加将是有利的病症的个体肠道中的胆碱可用性的组合物和方法。一种此类病症是在妊娠期间和产后阶段，其中母亲肠道中胆碱可用性增加可促进胎儿和新生儿的脑发育。
肠道细菌中胆碱向TMA的转化归因于甘氨酰基酶同系物、胆碱三甲胺裂解酶CutC。Craciun等人，(2014)ACS Chem Biol 9:1408–1413。已经描述了并非所有肠道微生物都包含含有CutC的基因簇。Martinez-del Campo等人，(2015)mBio 6(2):e00042-15.doi:10.1128/mBio.00042-15。cut基因簇包含一组编码甘氨酰基酶CutC的基因，以及甘氨酰基活化蛋白CutD、cutC/D基因簇。Craciun等人，(2012)PNAS 109:21307-21312。
相比之下，大多数测序细菌将胆碱转化为甘氨酸甜菜碱(GB或三甲基甘氨酸)，其主要作为渗透保护剂。另外，一些细菌可将胆碱转化为GB，并且然后转化为甘氨酸，其可用作碳和氮的来源。Wargo(2013)Appl.Environ.Microbiol.79:2112-2120。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种此类细菌，可经由GB、二甲基甘氨酸(DMG)和肌氨酸将胆碱转化为甘氨酸。
除非另外指明，否则下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计。除非另外指明，否则本文提及的所有成分的百分比、比率和水平均基于该成分的实际量，并且不包括在可商购获得的产品中可与这些成分一起使用的溶剂、填料或其它物质。
除非另外指明，否则本文所涉及的所有测量均在25℃下进行。室温(RT)被认为是25℃。
本发明组合物的组分描述于以下段落中。
如本文所用，“剂量”是指根据可靠的医学经验或消费者指南，包含一定量适于在单个场合施用的化合物、成分或提取物(例如生物提取物)的药物、制剂、或饮食补充剂(诸如液体制剂或口服剂量单元)的体积。剂量可口服。在一个示例中，剂型可为液体药物，并且可为约30mL，在另一个示例中为约25mL，在另一个示例中为约20mL，在另一个示例中为约15mL，并且在另一个示例中为约10mL，并且在另一示例中为约5mL。在另一个示例中，液体药物的剂量可为约5mL至约75mL，在另一个示例中约10mL至约60mL，在另一个示例中约15mL至约50mL，在另一个示例中约25mL至约40mL，并且在另一个示例中约28mL至约35mL。在另一个示例中，剂型可为固体剂型，并且可为约25mg至约5g，在另一个示例中为约1g至约10g，在另一个示例中约2g至约15g，在另一个示例中为约100mg至约3g，在另一个示例中为约250mg至约2g，在另一个示例中为约500mg至约1.6g，并且在另一示例中为约750mg至约1g。另外，剂型可为固体剂型，其中剂量为不同的量，例如一个剂量为约3g或剂量可为约1.6g。考虑到液体或固体剂量尺寸，可调节成分的浓度以提供适当剂量的成分。在某些实施方案中，剂量可以约每4小时、约每6小时、约每8小时、约每12小时、或约每24小时施用。
在各种实施方案中，以有效实现期望效果(例如，抑制胆碱向TMA的转化、改善或维持心血管健康或改善与胆碱向TMA的转化相关的病症的量施用的剂量包括介于约1μg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约1μg的假泽兰属提取物至约50mg的假泽兰属提取物，或介于约1μg的假泽兰属提取物至约5mg的假泽兰属提取物，或介于约1μg的假泽兰属提取物至约0.5mg的假泽兰属提取物，或介于约10μg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约100μg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约1mg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约10mg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约100mg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约250mg的假泽兰属提取物至约500mg的假泽兰属提取物，或介于约10μg的假泽兰属提取物至约250mg的假泽兰属提取物，或介于约100μg的假泽兰属提取物至约250mg的假泽兰属提取物，或介于约100μg的假泽兰属提取物至约100mg的假泽兰属提取物，或介于约1mg的假泽兰属提取物至约100mg的假泽兰属提取物，或介于约1mg的假泽兰属提取物至约10mg的假泽兰属提取物，或介于约10mg的假泽兰属提取物至约100mg的假泽兰属提取物。
如本文所用，“药物”是指包含假泽兰属提取物的组合物，诸如药物，包括处方药物、非处方药物、柜台后药物、以及它们的组合。在一些示例中，药物可为可包含植物物质、植物提取物、维生素、矿物质的饮食补充剂，和包括饮食补充剂或诸如植物成分在内的补充剂(VMS)。
药物组合物可为任何合适的形式，包括液体组合物和固体口服剂型。液体组合物的非限制性示例可包括糖浆、饮料、补给水、泡沫组合物、凝胶组合物、悬浮于液体制剂中的颗粒、凝胶或泡沫中的固体、盐水洗剂、以及它们的组合。固体口服剂型的非限制性示例可包括片剂、胶囊、囊片、小药囊、舌下剂型、颊面剂型、软凝胶和其它液体填充的胶囊、可溶性剂型(包括可溶性条)、膜、口香糖(包括中心填充的口香糖)、软糖(包括中心填充的软糖)、锭剂、中心填充的片剂、粉末、颗粒、丸粒、微球体、纳米球体、小珠或彩色糖豆、以及它们的组合。片剂可包括压缩片剂、咀嚼片、可溶性片剂等。在一些示例中，可将药物以软膏诸如基于凡士林的软膏施用于皮肤。在一些示例中，可在递送装置中提供药物。在其它示例中，药物可被吸入诸如鼻喷剂或吸入剂。在其他示例中，药物可存在于饮料中诸如温热饮料。在其他示例中，药物可包含药物活性物质。
药物可为可直接递送至口腔、喉咙或皮肤的形式。在一些实施方案中，药物组合物可通过递送装置递送，该递送装置选自点滴器、泵、喷雾器、滴液器、经由鼻腔通道递送的盐水洗器、杯、瓶、罐、加压喷雾器、雾化器、吸气装置、可挤压小袋、电动注射器、泡罩卡、和其它包装和设备、以及它们的组合。喷雾器、雾化器和吸气装置可连有电池或电源。
如本文所用，术语“个体”包括人类和其它类型的共享TMAO途径的哺乳动物，诸如家畜，包括但不限于家犬(犬科动物)、猫(猫科动物)、马、牛、雪貂、兔、猪、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、马等。
各种各样的个体可能希望降低由其肠道或消化道中的细菌产生的TMA水平。例如，被诊断患有心血管疾病的个体可以由医师指导以采用处方药或者改变生活方式，从而调制血液胆固醇水平或TMAO水平以降低严重心血管事件的风险。其它未曾诊断患有心血管疾病但希望改善或维持心血管健康的个体也可能希望降低由消化道细菌产生的TMA水平。如本文进一步描述，TMA降低(以及引申开来，TMAO)通过本文所述的组合物实现，该组合物可包括例如包含假泽兰属提取物的饮食补充剂。
本公开包括抑制胆碱向TMA的转化的方法、改善心血管健康的方法、以及改善与胆碱向TMA的转化相关的病症的方法，该方法包括向个体施用包含假泽兰属提取物的组合物。下面描述组合物和方法的特征。章节标题是为了方便阅读，而并非旨在限制本身。全部本文件旨在作为统一的公开内容相关联，并且应当理解本文所述特征的全部组合均被考虑，即使特征的组合并非共同见于本文件的相同句子、段落或者章节之中。应该理解，本文所述的方法、提取物或组合物的任何特征可以全部或部分地删除，与本文所述的任何其它特征组合或替代本文所述的任何其它特征。
假泽兰属
在某些实施方案中，根据本发明的假泽兰属包括与SEQ ID NO.1具有大于94％的序列同一性和/或与SEQ ID NO.2具有大于94％的序列同一性的假泽兰属植物。在本发明的一个方面，假泽兰属包括来自下列物种的植物：M.guaco Bonpl.、薇甘菊(M.micrantha)、M.trinervis、M.cordifolia、M.grazielae、M.Sessilifolia、M.Speciosa、或M.trachypleura、以及它们的组合。另外，根据本发明的假泽兰属包括来自下列物种的植物：M.Guaco Bonpl.、薇甘菊(M.micrantha)、M.trinervis、M.cordifolia、M.grazielae、M.Sessilifolia、M.Speciosa、M.trachypleura、M.thapsoides、M.hemisphaerica、紫绒藤(M.ternata)、M.hastato-cordata、或M.campanulate、以及它们的组合。本文中，“序列同一性”通过出于最佳比较目的比对两个主题多肽(氨基酸)或多核苷酸(核酸、DNA或RNA)序列来确定(例如，可将空位引入第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中以进行最佳比对，而出于比较目的可忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，出于比较目的而进行比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少50％，更优选地至少60％，甚至更优选地至少70％、80％或90％，甚至更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％或95％(即，其中100％等于整个编码序列)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两条序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数，不考虑需要引入以实现两条序列的最佳比对的空位数和每个空位的长度。
SEQ ID NO 序列
1 Mikania guaco ETS(外部转录间隔)区
2 Mikania guaco ITS(内部转录间隔)区
示出SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸序列的序列表以标题为“15401M&_Seq_ST25.”的文本文件与本申请同时提交。文本文件于2019年11月5日创建，大小为1.81千字节。
提取物
本发明的方法包括向个体施用假泽兰属提取物或包含假泽兰属提取物的组合物。提取物可从整株植物、植物的不同部分(包括但不限于叶、根、茎、地上部分(即在地面以上生长的那些)、地下部分(即在地面以下生长的那些)、种子、发芽的种子、胚芽、整株花或花的部分(即花瓣、雄蕊)、树皮或它们的组合)产生或衍生而来。整株植物的部分或植物的部分可为新鲜的，冷冻的，在0℃或-20℃或-70℃、或介于0℃和-70℃之间冷冻的，储存在液氮中的，干燥的，研磨的，粉末状的，冷藏的，脱水的，或它们的组合。
在一些实施方案中，提取物通过使用溶剂制备，所述溶剂包括但不限于水、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、己烷、或它们的组合。在实施方案中，提取物使用基于醇的溶剂来制备。在实施方案中，提取物使用醇-水性溶剂来制备。在实施方案中，提取物通过超临界流体提取来制备。超临界流体提取的示例是使用超临界二氧化碳。
假泽兰属提取物或包含假泽兰属提取物的组合物以有效实现所需有益效果，例如抑制胆碱向TMA的转化，改善或维持心血管健康、或改善与胆碱向TMA的转化相关的病症的量施用。
在各种实施方案中，假泽兰属提取物或包含假泽兰属提取物的组合物展示出1×10-3或更低、5×10-3或更低、1×10-4或更低、5×10-4或更低、1×10-5或更低、5×10-5或更低、或者1×10-6或更低、或者1×10-7或更低、或者1×10-8或更低、或者1×10-9或更低、或者1×10-10或更低、或者1×10-11或更低、或者1×10-12或更低、或者介于1×10-9和1×10-3之间、或者介于1×10-12和1×10-9之间、或者介于1×10-9和1×10-6之间、或者介于1×10-8和1×10-6之间、或者1×10-6和1×10-3之间、介于1×10-6和1×10-4之间、介于1×10-6和1×10-5之间、介于1×10-5和1×10-3之间、或者介于1×10-4和1×10-3之间、或者介于1.7×10-11和1×10-7之间的IC50，(观察到由胆碱形成TMA(或TMAO)的50％抑制；mg/mL。在实施例2、实施例3或实施例5中所述的测定中，数据也可表示为g/mL)。在各种实施方案中，包含假泽兰属提取物的组合物展示出介于1×10-11和1×10-7之间，或介于1×10-8至1×10-3，或介于1.2×10-6至2×10-3，或介于1×10-6至1×10-4之间的IC50(观察到由胆碱形成TMA的50％抑制；mg/mL。在实施例2、实施例3或实施例5中所述的测定中所测量的，数据也可表示为g/mL)。
在各种实施方案中，假泽兰属提取物或包含假泽兰属提取物的组合物展示出1×10-3或更低、5×10-3或更低、1×10-4或更低、5×10-4或更低、1×10-5或更低、5×10-5或更低、或者1×10-6或更低、或者1×10-7或更低、或者1×10-8或更低、或者1×10-9或更低、或者1×10-10或更低、或者1×10-11或更低、或者1×10-12或更低、或者介于1×10-9和1×10-3之间、或者介于1×10-12和1×10-9之间、或者介于1×10-9和1×10-6之间、或者介于1×10-8和1×10-6之间、或者1×10-6和1×10-3之间、介于1×10-6和1×10-4之间、介于1×10-6和1×10-5之间、介于1×10-5和1×10-3之间、或者介于1×10-4和1×10-3之间、或者介于1.7×10-11和1×10-7之间的EC50，(观察到由胆碱形成TMA(或TMAO)的50％抑制；mol/L)，在实施例6中描述的测定中。在各种实施方案中，包含假泽兰属提取物的组合物展示出介于1×10-11和1×10-7之间，或介于1×10-8至1×10-3，或介于1.2×10-6至2×10-3，或介于1×10-6至1×10-4之间的EC50(观察到由胆碱形成TMA的50％抑制；mg/kg)，如在实施例6中所述的测定中所测量的。
在各种实施方案中，假泽兰属提取物包含大于10ng/mL的(2-羟乙基)二甲基氧化锍、或大于50ng/mL、或大于100ng/mL、或小于500mg/mL、或小于100mg/mL、或小于10mg/mL、或介于10ng/mL和500mg/mL之间、或介于10ng/mL和100mg/mL之间、或介于10ng/mL和1mg/mL之间、或介于10ng/mL和500μg/mL之间、或介于10ng/mL和125μg/mL之间、或介于10ng/mL和100μg/mL之间、或介于10ng/mL和10μg/mL之间、或介于10ng/mL和1μg/mL之间、或介于10ng/mL和500ng/mL之间、或介于10ng/mL和100ng/mL之间、或介于50ng/mL和500mg/mL之间、或介于50ng/mL和100mg/mL之间、或介于50ng/mL和1mg/mL之间、或介于50ng/mL和500μg/mL之间、或介于50ng/mL和125μg/mL之间、或介于50ng/mL和100μg/mL之间、或介于50ng/mL和10μg/mL之间、或介于50ng/mL和1μg/mL之间、或介于50ng/mL和500ng/mL之间、或介于50ng/mL和100ng/mL之间的(2-羟乙基)二甲基氧化锍。在一个实施方案中，当根据实施例8测试时，起始提取物包含25mg生物原料/1mL甲醇。
本发明包括抑制个体中胆碱向TMA的转化的方法，该方法包括向个体施用如前所述的假泽兰属提取物或包含假泽兰属提取物的组合物。在某些实施方案中，如本文所述，个体可能需要降低的TMA水平、改善心血管健康等。个体可在施用之前表现出升高水平的TMA或其代谢物(例如，TMAO、二甲胺(DMA)或单甲胺(MMA))。在各种实施方案中，个体患有心血管疾病，摄入高胆碱饮食，或表现出一种或多种CVD风险因素(例如，吸烟、压力、高总胆固醇、高LDL胆固醇、低HDL(高密度脂蛋白)胆固醇、年龄、高血压、CVD家族史、肥胖症、前驱糖尿病、糖尿病等)。
还预期在体外抑制胆碱向TMA的转化的方法。例如，该方法可包括使细菌诸如肠道微生物群中表示的细菌或代谢胆碱以产生TMA的细菌溶胞产物与如前所述包含假泽兰属提取物的组合物接触。在各种实施方案中，细菌可选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、脱硫孤菌(Desulfovibrio alaskensis)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、闪烁梭菌(C.scindens)、aldenense梭菌(C.aldenense)、氨基丁酸梭菌(C.aminobutyricum)、tanakaei柯林斯菌(Collinsella tanakaei)、阴道厌氧球菌(Anaerococcus vaginalis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、哈式溃疡菌(Desultitobacteriumhafniense)、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、克雷伯氏杆菌(K.pneumonia)、彭氏变形杆菌(P.penneri)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗格森埃希菌(E.fergussonii)、或它们的组合。在某些实施方案中，细菌可为表达cutC/D基因簇的细菌。本公开还提供鉴定抑制TMA产生的化合物或提取物的方法。该方法包括使细菌(诸如，作为肠道微生物群的一部分的细菌)或代谢胆碱以产生TMA的细菌溶胞产物与候选组合物(诸如，包含假泽兰属提取物的组合物)接触以及检测TMA(或其代谢物)。在某些实施方案中，将由与候选组合物或细菌溶胞产物接触的细菌产生的TMA(或其代谢物)水平与(a)未与组合物或已知的TMA产生抑制剂接触的细菌或细菌溶胞产物产生的TMA水平或(b)与候选组合物接触之前由细菌或细菌溶胞产物产生的TMA水平相比较。由细菌或细菌溶胞产物产生的TMA水平的降低指示候选组合物抑制胆碱向TMA的转化。
还预期在体外抑制胆碱向TMA的转化的方法。所述方法包括使细菌或细菌溶胞产物与一种或多种包含假泽兰属提取物的组合物接触。在各种实施方案中，细菌包括单一细菌物种或菌株，或者包括两种或更多种(例如，三种、四种、五种或更多种)不同细菌物种或细菌菌株的混合物。类似地，细菌溶胞产物可由单一细菌物种或菌株或者两种或更多种(例如，三种、四种、五种或更多种)不同细菌物种或细菌菌株的混合物(包括粪便或其他肠内容物衍生的多微生物集合，或来自口腔的多微生物集合)产生。
应该理解，“抑制胆碱向TMA的转化”不需要经由胆碱代谢完全消除TMA的产生。预期由胆碱或胆碱相关代谢物作为前体形成TMA方面的任何降低，例如降低至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％；并且还包括约1％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、以及它们的任何组合。
在各种实施方案中，包含假泽兰属提取物的组合物对胆碱向TMA转化的抑制不由抗生素作用机制引起，例如其不由抗菌作用机制引起，或由与载体对照物相比将细胞活力降低至10％或更低的作用机制引起。
在各种实施方案中，包含假泽兰属提取物的组合物对胆碱向TMA转化的抑制不由直接抗炎作用机制引起。
在本发明的一个实施方案中，当与载体对照相比时，提供胆碱向TMA转化的50％抑制所需的假泽兰属组合物或提取物的量小于将细胞活力降低至10％或更低的假泽兰属组合物或提取物的量。
用于在体外或体内测量TMA的任何合适的方法可以用于本发明的上下文中。可以定量或定性地评估TMA、TMA的代谢物(包括TMAO、DMA或MMA)、TMA的稳定同位素(诸如氘标记的TMA，诸如d3-TMA、d6-TMA或d9-TMA)、TMAO的稳定同位素(诸如氘标记的TMAO，诸如d3-TMAO、d6-TMAO或d9-TMAO)、DMA的稳定同位素(诸如氘标记的DMA，诸如d3-DMA或d6-DMA)、MMA的稳定同位素(诸如氘标记的MMA，诸如d3-MMA)或胆碱(包括胆碱的稳定同位素，例如d9-胆碱)。检测和定量TMA的示例性方法描述于例如美国公布2010/00285517，其公开内容全文以引用方式并入本文。例如，TMA(或三甲胺-N-氧化物(TMAO)、DMA或MMA)或胆碱的水平任选地经由质谱法、紫外光谱法或核磁共振光谱法测量。质谱仪包括电离源(诸如电喷雾电离)、根据质荷(m/z)比分离电离源中形成的离子的分析仪、以及用于带电离子的检测器。在串联质谱法中，包括两个或更多个分析仪。此类方法在本领域中是标准的并且包括例如具有在线电喷雾电离(ESI)和串联质谱的HPLC。
在各种实施方案中，在来自个体的生物样品中测量TMA或TMAO。生物样品包括但不限于全血、血浆、血清、尿液、粪便、唾液、汗液、阴道液、龈沟液或组织。样品可以使用任何临床上可接受的实践来收集，并且如果需要，则在适当的缓冲溶液中稀释，肝素化，浓缩或分馏。可以使用许多生理学pH下的许多水性缓冲溶液中的任一种，诸如磷酸盐、Tris等。也可以使用酸化的缓冲液。例如，向样品中加入缓冲液后的最终pH可任选地在pH 1和pH 6之间，或者在pH 1.5和pH 3.0之间。
此外，可将生物样品中的TMA(或其代谢物或稳定同位素)或胆碱的水平与对照值相比较。所用的对照值将取决于本发明的实施方案。在某些实施方案中，对照值可以是在施用或暴露于包含假泽兰属提取物的组合物之前在个体中(或由细菌)产生的TMA或TMAO的水平。此外，对照值可基于从参考群体(诸如，来自普通人群的一组个体、诊断患有心血管疾病或其他TMA相关病症的个体、先前未诊断患有TMA相关病症的个体、非吸烟者等，其未暴露于包含假泽兰属提取物的组合物)获得的可相比的样品中测量的水平。TMA或TMAO或胆碱的水平可以与单个对照值或一系列对照值相比较。通过将来自个体的生物样品中的TMA的量与对照值相比较，任选地将个体鉴定为在施用之前具有增强的TMA水平。
本发明还提供改善个体的心血管健康的方法。该方法包括以有效改善心血管健康的量向个体施用包含假泽兰属提取物的组合物，所述提取物如上文子标题“提取物”中所述。通过测试动脉弹性、血压、踝/臂指数、心电图、心室超声、血小板功能(例如，血小板聚集)和血/尿测试来评估心血管健康，以测量例如胆固醇、白蛋白排泄、C反应蛋白、TMAO或血浆B型肽(BNP)浓度。在本发明的各种方面，包含假泽兰属提取物的组合物的施用改善或维持测定结果中的一种或多种在正常范围内。每个测试的结果的正常范围在本领域中是已知的。在一些实施方案中，心血管健康的改善以循环总胆固醇水平降低、循环低密度脂蛋白(LDL)降低、循环甘油三酯降低、循环TMAO水平降低和/或血压降低为特征。
本发明还包括改善对其有需要的个体中与胆碱向TMA的转化相关的病症的方法。该方法包括以有效改善病症的量向个体施用包含假泽兰属提取物的组合物。“改善病症”是指在与至少部分地由TMA引起的病症相关的症状的严重程度或发作方面的任何降低。本领域普通技术人员将理解，TMA有关的病症或与其相关的症状的任何程度的保护或改善对诸如人类的个体是有益的。通过降低个体中症状的严重程度或延迟症状出现改善个体的生活质量。因此，一方面，在确定个体处于发展TMA有关的病症的风险中之后或在检测到TMA有关的病症之后尽可能尽快地执行的一种方法。
在本发明的各个方面，与胆碱向三甲胺的转化相关的病症为心血管疾病、三甲基胺尿症、肾功能降低或受损、肾病、慢性肾病、终末期肾病、三甲基胺尿症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、阿尔茨海默病、痴呆、认知损害、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，由阴道中的细菌产生TMA水平增加从而导致阴道气味，或者由身体上的细菌产生TMA导致体臭，或者由口腔中的细菌产生TMA导致口臭或口腔护理生物膜形成，或在妊娠期间，其中孕晚期和产后期与血栓形成的风险增加相关，因此降低TMA和TMAO的水平可能会降低这种风险。
术语“心血管疾病”(CVD)在本领域中用于提到影响身体的心脏、心脏瓣膜和脉管系统(诸如，动脉和静脉)的病况，并且涵盖包括但不限于下列的疾病和病况：动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌梗塞、急性冠脉综合征、心绞痛、充血性心力衰竭、主动脉瘤、主动脉夹层、髂动脉或股动脉瘤、肺动脉栓塞、原发性高血压、心房颤动、中风、短暂性脑缺血发作、收缩功能障碍、舒张功能障碍、心肌炎、房性心动过速、心室纤颤、心内膜炎、动脉病、血管炎、动脉粥样硬化斑块、易损斑块、急性冠脉综合征、急性缺血发作、心脏性猝死、外周血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病(PAD)、脑血管疾病、不良心室重构、心室收缩功能障碍、心室舒张功能障碍、心功能障碍、室性心律失常等。
病况可能是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化涉及动脉粥样硬化斑块的形成，其导致脉管系统狭窄(narrowing)(“狭窄(stenosis)”)，这最终可能导致血管的部分或完全闭塞或破裂(动脉瘤)、心力衰竭、主动脉夹层和缺血事件诸如心肌梗塞和中风。在各种非限制性实施方案中，本发明的方法抑制、降低或逆转(全部或部分地)动脉粥样硬化的发作或发展(例如，降低或防止动脉硬化或增厚、斑块形成、内皮损伤或动脉炎症)。将认识到，病症诸如动脉粥样硬化的改善可通过多种途径发生。在一个示例中，病症的改善由宿主肠道中胆碱向TMA的转化的抑制引起，而不是由宿主中的局部抗炎机制引起。
病症可能是三甲基胺尿症。三甲基胺尿症(TMAU)是一种病症，其特征在于个体不能将TMA转化为TMAO，其中受影响的个体可能在其尿液、汗液或呼吸中存在鱼状体臭。Yamazaki等人，Life Sciences(2004)74:2739-2747。此类个体可受益于由肠道中的细菌对底物(包括但不限于胆碱)代谢至TMA的减少。具有TMAU的个体或希望降低其TMA和TMAO水平的个体也可消耗活性炭或叶绿素铜，其充当多价螯合剂，例如使TMA不能转移到个体的血流中。此类多价螯合剂可吸附TMA，然后TMA与多价螯合剂一起从消化道排出。
本发明还提供包含假泽兰属的提取物的组合物在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持与胆碱向TMA的转化相关的病症中的用途；以及包含假泽兰属的提取物的组合物在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持与胆碱向TMA的转化相关的病症中的用途。如前所述，本发明至少部分地基于以下发现：假泽兰属提取物抑制通过肠道微生物群进行的胆碱代谢，从而导致TMA和三甲胺N-氧化物(TMAO)的形成减少。本公开提供用于例如在体外和体内抑制胆碱向TMA的转化以改善或维持心血管、脑血管和外周血管健康并改善或预防与TMA和TMAO相关的病况的组合物和方法。
在各种实施方案中，包含假泽兰属提取物的组合物的施用导致TMA或TMAO水平降低、总胆固醇水平降低、LDL水平降低、HDL水平升高、甘油三酯水平降低或与CVD相关的其他生物标志物(例如，排泄的白蛋白、C反应蛋白或血浆B型肽(BNP))的水平正常化。在一些实施方案中，当施用于个体时，包含假泽兰属提取物的组合物降低心血管疾病、三甲基胺尿症、肾功能降低或受损、肾疾病、慢性肾疾病、终末期肾病、胰岛素抗性、三甲基胺尿症、肥胖症、糖尿病、阿尔茨海默病、痴呆、认知损害或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的风险。
施用方案和组合物
施用给个体的包含假泽兰属提取物的组合物的量足以抑制(全部或部分地)由胆碱形成TMA。在本公开的各种方面，该量改善心血管健康或相对于与TMA相关的不希望的病症实现有益的生物应答(例如，该量足以改善、减缓进展或预防病症(诸如CVD))。有益效果可以通过例如临床病况的改善、症状的减轻或通过本文所述的任何测定或临床诊断测试来检测。个体的确切有效量可以取决于个体的体重、身材和健康；病况的性质和程度；以及选择施用的组合物或试剂组合。在各种方面，施用给个体的组合物的量为约0.001mg/kg至约1000mg/kg。以mg/kg计的特定剂量范围包括约0.1mg/kg至约500mg/kg、约0.5mg/kg至约200mg/kg、约1mg/kg至约100mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg、以及约5mg/kg至约30mg/kg。有效量可作为组合物的单次施用或作为分次剂量(诸如，同时或在接近的时间以多个亚单位施用的单剂量)施用给个体。一定量的组合物可每天递送一次、两次或三次；每周一次、两次或三次；或者每月一次、两次、三次或四次。化合物可作为在体外或体内转化成活性药物的前药递送。
包含假泽兰属提取物的组合物通过允许抑制胆碱向TMA的转化的任何途径来施用。在本发明的各种方面，包含提取物的组合物肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、肺内、皮下或肌内)、鞘内、局部、透皮、直肠、口服、舌下、鼻内或通过吸入递送至个体。在各种实施方案中，提取物或包含提取物的组合物经由诸如通过摄取施用到胃肠道。当与胃肠道中的体液接触时，也可采用持续或延伸释放制剂来实现化合物的受控释放。持续释放制剂在本领域中是已知的，并且通常包含生物可降解聚合物的聚合物基质、水溶性聚合物或两者的混合物，任选地还有合适的表面活性剂。
剂型可包含聚合物。聚合物的非限制性示例可包括亲水性聚合物、水不溶性聚合物、丙烯酸酯共聚物、乙酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、聚乙酸乙烯酯和衍生物(可以商品名
Figure BDA0003052561420000171
从BASF(Tarrytown，N.J.)商购获得)、紫胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、以及它们的组合。
在一个方面，该聚合物可为亲水性聚合物。亲水性聚合物可在水性酸性介质(诸如胃)中缓慢溶胀和溶解，从而在胃中缓慢释放活性物质。然而，当剂型到达肠时，pH增加。亲水性聚合物可以受控量溶解，并且在整个消化道中实现活性物质的延长释放。
亲水性聚合物的非限制性示例可包括天然的或部分或完全合成的亲水性树胶如阿拉伯树胶、黄蓍胶、刺槐豆胶、瓜耳胶或刺梧桐树胶，改性的纤维素物质如乙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素(CMC)或CMC的盐，羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羟乙基纤维素、醋酸纤维素四氢邻苯二甲酸酯、醋酸纤维素六氢邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基纤维素琥珀酸酯；蛋白质物质，诸如琼脂、果胶、角叉菜胶和海藻酸盐；以及其他亲水性聚合物，诸如羧聚乙烯、明胶、酪蛋白、玉米醇溶蛋白、多糖、改性淀粉衍生物、以及它们的组合。
在一个示例中，亲水性聚合物可为HPMC，其可以商品名METHOCELTM醚商购获得(购自
Figure BDA0003052561420000172
Harleysville，Pa.)。在一个示例中，可使用METHOCELTMK100LV和/或METHOCELTMK 100M实现期望的溶解曲线。
在另一方面，聚合物可为水不溶性聚合物。在一个方面，该水不溶性聚合物不溶于pH低于5的溶液，因此不溶于胃的胃液中存在的低pH环境。水不溶性聚合物的非限制性示例可包括聚丙烯酸、丙烯酸类树脂、丙烯酸胶乳分散体、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、以及本领域的技术人员常用的其他聚合物。
丙烯酸酯共聚物的非限制性示例可包括与甲基丙烯酸共聚的甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸以及与甲基丙烯酸和酯共聚的酯、含氨的丙烯酸酯共聚物、以及它们的组合。
在一个方面，聚合物可为基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子共聚物。在一个方面，聚合物可包括以商品名“
Figure BDA0003052561420000173
FS30D”销售的聚(丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)7:3:1聚合物，其购自Evonik Industries(Darmstadt，Germany)。在另一方面，聚合物还可包括以商品名“
Figure BDA0003052561420000181
L30D”销售的聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1:1聚合物，其可从Evonik Industries(Darmstadt，Germany)商购获得。
在一个方面，聚合物可为缓释聚合物。在一个方面，缓释聚合物可为亲水性聚合物诸如HPMC。
在一个方面，缓释部分可包含聚合物。缓释部分可包含按所述部分的重量计约10％至约30％的聚合物，或者约15％至约25％的聚合物，或者约18％至约23％的聚合物。在另一方面，缓释部分可包含按所述部分的重量计约25％至约60％的聚合物，或者约30％至约50％，或者约35％至约45％，或者约40％至约50％的聚合物。
在一个方面，聚合物的玻璃化转变温度(Tg)在暴露于水时可为相对耐变化的。聚合物可在加工期间由于片剂组分或制片压力暴露于水。与具有相对耐变化的Tg的聚合物一起工作的优点是聚合物在加工期间相对较不暴露于水。大部分无定形的或部分无定形的聚合物的Tg可随水含量的增加而显著降低，这意指必须额外小心以防止在加工期间暴露于水或与引入的赋形剂一起确保聚合物体系在加工期间不降低Tg范围。如果发生这种情况，可能会影响制造问题，诸如剂型的硬度。
Tg在一定温度范围内发生。Ti为拐点温度，并且Tf为外推起始温度。聚合物在约75％相对湿度下的Ti可大于约25℃，或者大于约40℃，或者大于约60℃，或者大于约80℃，或者大于约90℃，或者大于约100℃，或者大于约110℃，或者大于约115℃，或者大于约120℃，如通过下文所述的玻璃化转变温度测试方法所测定的。在另一方面，聚合物的Ti在约75％相对湿度下可为约40℃至约175℃，或者约60℃至约160℃，或者约90℃至约155℃，或者约100℃至约150℃，或者约110℃至约148℃，或者约120℃至约145℃，或者约122℃至约139℃，如由下文所述的玻璃化转变温度测试方法所测定的。
玻璃化转变温度可使用以下方法测定。首先，可将4-5mg聚合物样品转移到标准开口铝样品盘中，其可购自DSC Consumables Inc.(Austin，Minn.)。开口盘可在控制在75％相对湿度的室内平衡数天。在样品平衡后，可将样品盘气密密封并采用ASTM方法E1356-08(2013年4月30日)，并且可根据ASTM方法E1356-08在5℃至250℃的温度范围内在高敏差示扫描量热仪(诸如购自Seiko Instruments Inc.的Seiko X-DSC7000)上运行。Ti和Tf可按照ASTM方法测定。
在一个方面，聚合物可为羟丙甲纤维素，并且可具有约80cP至约250,000cP，或者约100cP至约150,000cP，或者约25,000cP至约100,000cP，或者约50,000cP至约80,000cP的粘度，如通过35美国药典(USP)<911>(2012年12月1日正式启用)并根据用于粘度类型大于600mPa·s的羟丙甲纤维素样品的方法所测量。
在一个方面，约50％至约90％的聚合物颗粒可介于106μm和212μm之间，或者约60％至约80％，或者约70％至约80％，或者约72％至约77％。在另一方面，大于75％的聚合物颗粒可小于212μm，或者大于85％，或者大于90％，或者大于95％，或者大于97％。聚合物粒度分布可使用35USP<786>通过分析筛分进行粒度分布估计(2012年12月1日正式启用)和通过使用机械搅拌以供干式筛分方法来测定。粒度可影响制剂在加工期间的行为、制剂的可压缩性和/或最终产品的均匀度。
在一个方面，速释部分可包含按所述速释部分的重量计约15％至约50％、或者约25％至约40％、或者约30％至约38％的单糖和/或二糖。在另一方面，速释部分可包含按速释层的重量计大于约20％、或者大于约25％、或者大于约30％、或者大于约33％的可溶性赋形剂。在另一方面，速释部分可包含按所述速释部分的重量计小于约50％、或者小于约40％、或者小于约25％、或者小于约20％、或者小于约16％的溶胀性赋形剂，所述溶胀性赋形剂包括溶胀性聚合物。
本发明提供了用于本文所述方法的假泽兰属提取物，或包含用一种或多种生理上可接受的赋形剂、载体、稳定剂、制片剂或稀释剂配制的假泽兰属提取物的组合物。赋形剂包括但不限于载体分子，该载体分子包括大的缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、螯合剂(例如，EDTA)、碳水化合物(例如，糊精、羟烷基纤维素或羟烷基甲基纤维素)、脂质体、硬脂酸、液体(例如，油、水、盐水、甘油或乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、粘合剂、崩解剂、流平剂、润滑剂、填料等等。
剂型可包含附加赋形剂，包括但不限于：润滑剂，诸如微晶纤维素、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、粉末状硬脂酸、氢化植物油、聚乙二醇和矿物油；着色剂；粘合剂，诸如蔗糖、乳糖、淀粉糊剂、聚乙烯吡咯烷酮和玉米糖浆；助流剂，诸如胶态二氧化硅和滑石；表面活性剂，诸如月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、三乙醇胺、聚氧乙烯脱水山梨糖醇、泊洛沙醇和季铵盐；防腐剂和稳定剂；甜味剂，诸如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、麦芽糖、木糖醇和山梨糖醇；黄原胶；和藻酸。
剂量或剂型的示例包括：
(i)速释胶囊，其包含明胶胶囊或速释羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊、1μg至500mg的假泽兰属提取物、10％-99％的填料(例如乳糖、微晶纤维素、麦芽糖糊精或蔗糖)、至多1％的润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂基延胡索酸钠或硬脂酸)、至多5％的流平剂(例如二氧化硅或滑石)、任选地崩解剂，其中所述组合物任选地在包封之前用适宜的粘结剂通过湿法或干法制粒步骤加工；
(ii)速释片剂，其包含1μg至500mg的假泽兰属提取物、10％-99％的填料或粘结剂(例如乳糖、微晶纤维素、麦芽糖糊精或蔗糖)、至多1％的润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂基延胡索酸钠或硬脂酸)、至多5％的流平剂(例如二氧化硅或滑石)、任选地崩解剂，其中所述组合物任选地在压片之前用适宜的粘结剂通过湿法或干法制粒步骤加工；
(iii)缓释胶囊，其包含DRcapsTM胶囊(Capsugel,USA)、明胶胶囊或速释羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊、1μg至500mg的假泽兰属提取物、10％至60％的缓释赋形剂(例如，K100M HPMC)、10％-70％的填料或粘结剂(例如乳糖、微晶纤维素、麦芽糖糊精或蔗糖)、至多1％的润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂基延胡索酸钠或硬脂酸)、至多5％的流平剂(例如二氧化硅或滑石)、任选地崩解剂，并且其中所述组合物任选地在包封之前用适宜的粘结剂通过湿法或干法制粒步骤加工；
(iv)缓释片剂，其包含1μg至500mg的假泽兰属提取物、10％至60％的缓释赋形剂(例如K100M HPMC)、10％-70％的填料或粘结剂(例如乳糖、微晶纤维素、麦芽糖糊精或蔗糖)、至多1％的润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂基延胡索酸钠或硬脂酸)、至多5％的流平剂(例如二氧化硅或滑石)、任选地崩解剂，并且其中所述组合物任选地在包封之前用适宜的粘结剂通过湿法或干法制粒步骤加工；
(v)假肠溶胶囊，其包含DRcapsTM胶囊(Capsugel，USA)、明胶胶囊或速释HPMC胶囊、1μg至500mg的假泽兰属提取物、10％-60％的填料(例如乳糖、微晶纤维素、麦芽糖糊精或蔗糖)、至多1％的润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂基延胡索酸钠或硬脂酸)、至多5％的流平剂(例如二氧化硅或滑石)、任选地崩解剂，其中所述组合物任选地在包封之前用合适的粘结剂通过湿法或干法制粒步骤加工，并且所述胶囊任选地用伪肠溶选项包衣，所述伪肠溶选项包括
Figure BDA0003052561420000211
Clear YS-1-19025-A(Colorcon，USA)和
Figure BDA0003052561420000212
(Colorcon，USA)的组合；以及
(vi)假肠溶片剂(具有或不具有持续释放)，其包含1μg至500mg的假泽兰属提取物、10％-99％的填料或粘结剂(例如乳糖、微晶纤维素、麦芽糖糊精或蔗糖)、至多1％的润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂基延胡索酸钠或硬脂酸)、至多5％的流平剂(例如二氧化硅或滑石)、任选地崩解剂，其中所述组合物任选地在压片之前用合适的粘结剂通过湿法或干法制粒步骤加工，并且所述片剂用伪肠溶选项包衣，所述伪肠溶选项包括
Figure BDA0003052561420000213
Clear YS-1-19025-A(Colorcon，USA)和
Figure BDA0003052561420000214
(Colorcon，USA)的组合。
诸如用于肠胃外或口服施用的组合物通常为固体(例如，冻干粉末或饼)、液体溶液、乳剂或悬浮液，而用于肺部施用的可吸入组合物通常为液体或粉末。示例性剂型包括但不限于片剂、糖锭剂、锭剂、水或油悬浮液、非水溶液、粉末、可分散粉末或颗粒剂(包括微粒化粒子或纳米粒子)、乳剂、硬或软胶囊、硬或软液体填充的胶囊、胶囊锭、糖浆剂和酏剂。固体剂量组合物例如片剂或液体填充的胶囊可以是未包衣的，或者可以通过包括微胶囊的已知技术包衣以延迟在胃肠道或消化道中的崩解和吸收。固体剂量组合物可以被包衣以靶向递送至消化道的特定区域。例如，组合物可以被肠溶包衣以将组合物靶向递送至小肠、大肠或结肠。附加的示例性剂型可以包含悬浮液或液体基体中的包衣的微胶囊或包衣的微珠。在一些实施方案中，组合物以液体剂量递送，例如作为饮料、水或醇中的浸出剂或酊剂、组合物在热水或接近沸水中浸出后浸出剂(诸如茶)。在一些实施方案中，包含假泽兰属提取物的组合物以饮食(例如食物或饮料)补充剂形式提供。饮食补充剂是口服给药的，并且通常包含维生素、矿物质、草药或其它植物成分、氨基酸、酶、器官组织、来自腺体的组织或代谢物。例如，包含假泽兰属提取物的组合物可作为呈条形式的食物提供。
在一些实施方案中，本文所述的提取物或组合物在适用于低溶解度物质和提取物的基于脂质的组合物中可配制成口服。基于脂质的组合物通常可增强此类物质和提取物的口服生物利用度。因此，在一些方面，组合物包含一定量的本文所述的提取物以及至少一种选自中链脂肪酸及其丙二醇酯的赋形剂(例如，可食用脂肪酸的丙二醇酯，诸如辛酸和癸酸脂肪酸)和生理学上可接受的表面活性剂诸如聚氧乙烯40氢化蓖麻油。
在一些实施方案中，本文所述的提取物或组合物可以延迟释放组合物的形式提供，并且任选地在个体的消化道的特定区域中释放。例如，可以提供提取物或组合物，使得提取物或组合物在消化道的远侧部分诸如回肠或结肠中自口服组合物释放。在某些实施方案中，延迟释放组合物在特定pH下或在一定pH范围内释放提取物或组合物，以在个体的消化道内靶向递送。提取物或组合物可以例如在pH 6.0和pH 9.0之间、pH 6.5和pH 8.0之间、pH 6.5和pH 7.5之间、pH 7.0和pH 7.5之间、或者pH 7.0和pH 8.0之间释放。
本发明的方法可包括向个体施用第二试剂。术语“第二试剂”仅用于将该试剂与假泽兰属提取物或包含假泽兰属提取物的组合物加以区分，并不意指限制在方法中使用的附加试剂的数量或表示施用顺序。一种或多种第二试剂任选地掺入具有同时施用但以分开的剂型或者在时间上分开施用的具有假泽兰属提取物的组合物中。
示例性第二试剂包括但不限于抗微生物剂(诸如杀死肠道中的细菌的抗生素)；改善肠道蠕动的试剂(诸如纤维或洋车前子)；进一步降低肠道中TMA水平的试剂，包括多价螯合剂(诸如活性炭或叶绿素铜)；进一步降低TMA水平或产生TMA代谢物的试剂；改善心血管健康的一个或多个方面的试剂，诸如使血压正常化、减少血管炎症、减少血小板活化、使脂质异常正常化的试剂；促进体内TMA排泄的试剂；或结合TMA使得它不能转换为TMAO的试剂。在各种实施方案中，第二试剂选自ω3油、水杨酸(阿司匹林)、二甲基丁醇、大蒜油、大蒜提取物、橄榄油、磷虾油、Co酶Q-10、益生菌、益生元、膳食纤维、车前子壳、开心果、铋盐、植物甾醇、葡萄籽油、葡萄渣、绿茶提取物、维生素D、抗氧化剂(诸如维生素C和维生素E)、姜黄、姜黄素、白藜芦醇、红曲米、米的发酵形式、大豆的发酵形式、乳酸发酵的水果和蔬菜(包括乳酸发酵的苹果泥)、小檗碱、活性木炭或叶绿素铜。在某些实施方案中，组合物包含二甲基丁醇或由除胆碱之外的前体(例如甜菜碱、磷脂酰胆碱、巴豆甜菜碱或肉毒碱)形成TMA的抑制剂。另外的示例性第二试剂描述于US 2017/0151208、US 2017/0151250、US 2017/0152222、US 2018/0000754、美国专利申请16/149882、美国专利申请16/149913、或美国专利申请16/149938中，这些专利文献以引用方式并入本文。
本公开的方法还可包括施用一种或多种心血管疾病疗法。疗法的示例包括但不限于他汀类(例如，LipitorTM(阿托伐他汀)、PravacholTM(普伐他汀)、ZocorTM(辛伐他汀)、MevacorTM(洛伐他汀)和LescolTM(氟伐他汀))或干扰HMGCoA还原酶的活性的其它试剂；烟酸(尼克酸，其降低LDL胆固醇水平)；贝特类(其降低血液甘油三酯水平并且包括例如苯扎贝特(诸如
Figure BDA0003052561420000231
)、环丙贝特(诸如
Figure BDA0003052561420000232
)、氯贝丁酯、吉非贝齐(诸如，
Figure BDA0003052561420000233
)和非诺贝特(诸如，
Figure BDA0003052561420000234
))；胆汁酸树脂(诸如考来烯胺、考来替泊(Colestipol)(考来替泊(Colestid))和Cholsevelam(Welchol))；胆固醇吸收抑制剂(诸如依替米贝
Figure BDA0003052561420000235
Figure BDA0003052561420000236
)；植物甾醇(诸如谷甾醇(Take Control(Lipton))；谷甾烷醇(Benechol)或豆甾烷醇)；藻酸盐和果胶；卵磷脂和营养制品(诸如绿茶提取物和其它提取物，包括多酚，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、Cholest-ArrestTM(500mg大蒜和200mg卵磷脂)、CholestawayTM(700mg碳酸钙)、170mg氧化镁、50μg(吡啶甲酸铬)、Cholest-OffTM(900mg植物固醇/甾烷醇)、Guggul Bolic(750mg香胶甾酮(印度穆库尔没药树脂)、以及
Figure BDA0003052561420000241
(600mg陈蒜提取物和380mg卵磷脂))。
在前述实施方案的相关变体中，包含单独或与一种或多种第二试剂组合的本文所述的假泽兰属提取物的组合物可任选地布置成试剂盒或包装或单位剂量，诸如允许共同施用多种试剂的试剂盒或包装或单位剂量。另一方面，包含假泽兰属提取物和一种或多种第二试剂的组合物是混合物。在各种实施方案中，试剂盒或包装或单位剂量的一种或多种组分与关于施用这一种或多种组分到个体的说明书一起包装。
本发明的其它方面和优点将在考虑以下例示性实施例后理解，该例示性实施例并非旨在以任何方式进行限制。
实施例
实施例1：假泽兰属提取物的制备
除非另有说明，否则所有提取程序均在室温(RT)和大气压下进行。
以下是可用于从假泽兰属物种中产生提取物的示例性方法。
从生物原料粉末中提取。
用于获得假泽兰属物种提取物的示例源生物原料(BRM)示于表1中。
表1
Figure BDA0003052561420000242
Figure BDA0003052561420000251
a.ChromaDex，Irvine CA，USA。部件号00031379-506，guaco(假泽兰属(Mikania))叶。以粉末形式提供，并且在本文中称为生物原料(BRM)粉末。
b.ChromaDex，Irvine CA，USA。批号为MM032719，薇甘菊(Mikania micrantha)。以干燥的叶和茎的形式提供，从其中手动分离出叶的样品，并称为该样品的BRM。
c.PhytoPharmacon,Inc.，Ganter，North Carolina，USA。目录号BP2432。以冻干粉末形式提供。
d.PhytoPharmacon,Inc.，Ganter，North Carolina，USA。目录号BP2434。以冻干粉末形式提供。
e.非商业样品。
提取物ID 1：将15mL螺旋盖聚苯乙烯管(15mL离心管，EK-4021，AccuFlow SystemsInc，Maryland，USA)中的两克生物原料(BRM)粉末悬浮在10mL的1:1(体积/体积)水:乙醇(UltraPureTM无DNA酶/RNA酶蒸馏水，目录号10977，乙醇，200标准，EMD EX0276-3，ThermoFisher Scientific，Massachusetts，USA)中并涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒1和上清液1。移除上清液1并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在RT(室温)下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液1获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Invitrogen)中以生成提取物ID 1，并且如上所述涡旋。基于2克(g)BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％Triton X-100中稀释的提取物ID 1的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 2：将15mL螺旋盖聚苯乙烯管(15mL离心管，EK-4021，AccuFlow SystemsInc，Maryland，USA)中的两克生物原料(BRM)粉末悬浮在10mL的1:1(体积/体积)己烷:乙酸乙酯(己烷，GR ACS，EMD HX0299-6；乙酸乙酯，无水，99.8％，目录号270989-1L，SigmaAldrich，Missouri，USA)并涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒2和上清液2。移除上清液2并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液2获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Thermo Fisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 2。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID 2的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 3：将15mL螺旋盖聚苯乙烯管中的丸粒2重悬于10mL乙酸乙酯(乙酸乙酯，无水，99.8％，目录号270989-1L，Sigma Aldrich)中，并且涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒3和上清液3。移除上清液3并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液3获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Thermo Fisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 3。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID3的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 4：将15mL螺旋盖聚苯乙烯管中的丸粒3重悬于10mL乙醇(乙醇，200标准，EMD EX0276-3)中并涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒4和上清液4。移除上清液4并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液4获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Thermo Fisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 4。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID 4的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 5：将15mL螺旋盖聚苯乙烯管中的丸粒4重悬于10mL水(UltraPureTM无DNA酶/RNA酶的蒸馏水，Invitrogen目录号10977)中并涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒5和上清液5。移除上清液5并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液5获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Thermo Fisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 5。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID 5的系列稀释液。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 6：将5mL螺旋盖聚苯乙烯管(5mL Five-OTM螺帽MacroTubesTM，MTC Bio目录号C2540)中的半克(0.5g)生物原料(BRM)粉末悬浮于2.5mL甲醇(甲醇，>99.8％ACS，VWR BDH1135-4LG)中并涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒6和上清液6。移除上清液6并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液6获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Thermo Fisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 6。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID 6的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 7：将5mL螺旋盖聚苯乙烯管(5mL Five-OTM螺帽MacroTubesTM，MTC Bio目录号C2540)中的半克(0.5g)生物原料(BRM)粉末悬浮于2.5mL室温水(得自MilliQAdvantage A10的超纯水)中并涡旋(3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒7和上清液7。移除上清液7并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液7获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(Thermo Fisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 7。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID 7的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 8：将5mL螺旋盖聚苯乙烯管(5mL Five-OTM螺帽MacroTubesTM，MTC Bio目录号C2540)中的半克(0.5g)生物原料(BRM)粉末悬浮于2.5mL的50℃水(得自MilliQAdvantage A10的超纯水)中并涡旋(室温下，3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒8和上清液8。移除上清液8并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液8获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(ThermoFisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 8。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100中稀释的提取物ID 8的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 9：将5mL螺旋盖聚苯乙烯管(5mL Five-OTM螺帽MacroTubesTM，MTC Bio目录号C2540)中的半克(0.5g)生物原料(BRM)粉末悬浮于2.5mL 100℃的水(得自MilliQAdvantage A10的超纯水)中并涡旋(室温下，3200rpm)15分钟。将混合物以800-1000×g离心15分钟以生成丸粒9和上清液9。移除上清液9并分成聚丙烯微量离心管中的1mL等分试样，然后在氮气吹扫下干燥。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将从上清液9获得的干燥丸粒重悬于100μL无菌水+0.1％(体积/体积)Triton X-100(ThermoFisher)中并如上所述涡旋，以生成提取物ID 9。基于2g BRM/10mL溶剂的估计起始浓度，制备在(溶剂-水与0.1％(体积/体积)Triton X-100)中稀释的提取物ID 9的系列稀释液。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
提取物ID 10：样品以干燥叶和茎的形式得自供应商。用手分离叶片，然后如提取物ID 6所述制备。
提取物ID 11：样品以96孔板中每孔10mg干燥提取物的形式得自供应商。用移液管将样品重悬于DMSO中至10mg/mL的浓度进行混合。
提取物ID 12：样品以96孔板中每孔10mg干燥提取物的形式得自供应商。用移液管将样品重悬于DMSO中至10mg/mL的浓度进行混合。
提取物ID 13至18：样品作为生物原料接收并如提取物ID 6所述进行处理。
实施例2：用于鉴定和表征抑制由胆碱形成TMA的提取物的测定。
该实施例提供用于鉴定和表征抑制由胆碱形成TMA的假泽兰属提取物的示例性测定。
使奇异变形杆菌29906(Pm)菌株在500ml营养肉汤培养基(3g/L牛肉提取物，5g/L蛋白胨；Difco#234000)中在37℃下以250rpm振荡有氧生长过夜。生物质通过在4℃以6000×g离心12分钟而沉淀。使细胞丸粒在240mL冰冷的1X磷酸盐缓冲盐水(不含Ca2+和Mg2+)中悬浮。加入90微克溶菌酶(Sigma#L6876，批号#SLBG8654V；Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)并在4℃下以320rpm振荡温育30分钟。溶胞是经由具有预冷却到4℃的直径为1"的腔室的法式滤压壶(French press)在1000psi(高比率；内部PSI相当于约16000)实现。将溶胞产物在4℃下以6,000×g离心12分钟以使额外的碎片粒化。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce#23225；Thermo Fisher Scientific Co.，Waltham，MA)测定离心的溶胞产物上清液的蛋白质浓度，并用1×杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)将蛋白质浓度调节至3mg/ml。将离心的上清液溶胞产物等分成20mL体积并在-80℃下冷冻储存。
奇异变形杆菌29906(Pm)溶胞产物用1×DPBS稀释至1.5mg/mL蛋白质。加入氯化胆碱(CC)(1M储备液)以达到2.5mM氯化胆碱的最终浓度。混合物使用涡旋混合器混合约15秒，并在37℃下温育22小时。温育后，将150μL的CC处理的Pm溶胞产物分配到深孔板(聚丙烯，2mL体积，Corning Axygen目录#P-DW-20-C)中。以1:100稀释度加入来自表1的候选提取物和载体对照物(无菌水与0.1％(体积/体积)Triton X-100、DMSO或水的相应载体对照物)或对照化合物(IC50对照，8-喹啉半硫酸盐(Sigma目录号55100))(例如，每孔1.5μL)。将平板在平板振荡器上搅拌1分钟。向所有孔中加入d9-氯化胆碱(1.5μL，5mM，Cambridge IsotopeLaboratories,Inc.，USA，氯化胆碱(三甲基-D9，98％)，目录号DLM-549)以达到50μM的最终d9-氯化胆碱浓度。
再次将平板在平板振荡器上搅拌1分钟，并在37℃下温育2小时。温育后，向每个孔中加入1.5μL甲酸(最终浓度＝1％甲酸)。将平板在平板振荡器上搅拌1分钟并置于冰上。将细胞溶胞产物样品掺杂稳定同位素标记的内标(向每个样品中加入22.5μL的6μg/mL的13C3-三甲胺(13C3-TMA))，然后在如下所述的蛋白质沉淀之后从溶胞产物中分离d9-三甲胺(d9-TMA)、三甲胺(TMA)和13C3-TMA。将用0.1％甲酸酸化的乙腈(600μL)加入到每个样品中，然后将其离心(2100g，20分钟)以使蛋白质和其它沉淀物粒化。如下所述移出并分析上清液。分离的上清液样品中的TMA、d9-TMA和13C3-TMA在具有来自Waters Corp.,Milford,Mass.的Atlantis Silica HILIC Sentry保护管柱(
Figure BDA0003052561420000302
3μm,2.1mm×10mm)的来自Waters Corp.,Milford,Mass.的Waters Atlantis HILIC Silica柱(2.1mm×50mm，3μm粒子)上进行梯度高效液相色谱(HPLC)，其中具有0.1％甲酸的10mM甲酸铵水溶液作为流动相A且0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B。检测和定量通过在多反应监测(MRM)MS/MS条件下操作的串联质谱法实现(TMA，m/z60.1→44.1；d9-TMA，m/z 69.1→49.1；13C3-TMA，m/z63.0→46.1)。使用在80％/20％/0.1％乙腈/水/甲酸中制备的TMA和d9-TMA校准标准物(STD)通过绘制每种标准物的应答(峰面积TMA/峰面积13C3-TMA)对浓度构建回归曲线。通过二次(1/x2)回归曲线插值确定细胞溶胞产物中TMA和d9-TMA的浓度。
实施例2提供鉴定和定量样品中的TMA以及筛选候选抑制提取物或组合物的示例性方法。
对于来自表1的代表性的假泽兰属提取物，如实施例2所述，抑制胆碱向TMA的转化的IC50测量值列于表2中。
表2
Figure BDA0003052561420000301
Figure BDA0003052561420000311
实施例3：多微生物筛选方法
人粪便与氘标记胆碱提取物的多微生物温育筛选方法，包括细胞活力测定。在用于实验之前，将所有材料在厌氧室中预还原24小时，并且在厌氧条件下(用85％氮气、5％氢气、10％二氧化碳吹扫的室)进行实验程序。
从没有慢性疾病、血源性疾病或活动性感染的健康男性志愿者收集人粪便样品。志愿者在捐赠前两个月内未接受抗生素，并提供书面知情同意。通过将粪便重悬于包含3％(重量/体积)胰酶大豆液体培养基、1％(重量/体积)海藻糖(pH 7.3)的培养基中来稀释样品以制备20％(重量/体积)粪便浆液。将粪便浆液匀化并使用具有170μm整合膜的均质袋用手过滤。将DMSO(5％(重量/体积)加入滤过的浆液中，并且将等分试样储存于-80℃下的低温小瓶中直至使用。用M9培养基(Na2HPO4(6g/L)、KH2PO4(3g/L)、NaCl(0.5g/L)，其中添加0.1mM CaCl2和1mM MgSO4)将冷冻粪便浆液稀释至0.2％(重量/体积)并分配(1mL)到深孔96孔板中。将包含50μM d9-氯化胆碱和剂量等效在2mg/mL至31ng/mL范围内的化合物的稀释粪便浆液密封并在37℃下振荡温育。20小时后，使用PrestoBlue细胞活力试剂(ThermoFisher Scientific，USA)分析粪便多微生物群落的等分试样的活力，如下所述。随后将反应板离心(在4℃下4000×g并持续12分钟)以沉淀粪便，转移150μL等分试样并加入甲酸至1％(体积/体积)进行猝灭。所有粪便处理和多微生物测定步骤均在厌氧环境中进行。通过LC/MS/MS测定产物，并且如先前对于实施例2中TMA和d9-TMA的检测和分析所述计算IC50值。
对于来自表1的代表性的假泽兰属提取物，如实施例3所述，抑制胆碱向TMA的转化的IC50测量值列于表3中。
表3
提取物ID 提取物源 IC<sub>50</sub>(Log g/mL)提取物
1 Mikania guaco，叶，提取物ID 1 -6.03
5 Mikania guaco，叶，提取物ID 5 -5.99
16 Mikania grazielae，茎，提取物ID 16 -4.37
18 Mikania sessilifolia，叶，提取物ID 18 -3.74
实施例3提供了筛选胆碱向TMA的转化的候选抑制提取物或组合物的示例性方法。
对于PrestoBlue细胞活力测定，将粪便多微生物群落测定的6μL等分试样添加到黑色透明底部96孔板中的84μL M9培养基中。向其中添加10μL PrestoBlue试剂，加盖并以800rpm摇动1分钟。将板在37℃下温育30分钟，并按照制造商的说明进行荧光读数。细胞活力计算为与载体对照物(例如1％DMSO)相比的荧光％。
表4在PrestoBlue测定中使用假泽兰属的代表性提取物，如实施例3中测定的细胞活力数据。记录最大测试浓度，连同与载体对照物相比细胞活力被测定为10％或更低的最低测试浓度。如果在任何测试浓度下细胞活力不被测定为10％或更低，则将细胞标记为N/A。
表4
Figure BDA0003052561420000321
实施例4：临床前筛选方法
从第0天开始，小鼠(C57bl/6，约19g，10周龄；n＝5/组)根据NIH指南在12:12小时光照:黑暗循环中维持并随意提供有1％胆碱加入饮食(制备的Envigo定制制剂，类似于Teklad Global Rodent Diet 2018)。在引入饮食的同时，使用1.5”22G球尖弯曲喂食针对小鼠每天灌服一次，以剂量0、1.0、3.1、10、31、100或310mg/kg/天中的一个或多个给予200μl或更少水中的化合物。每天早上收集一次尿液。用手约束动物，并且通过盆腔区域的轻微触诊表达膀胱。将l-5μl尿液的等分试样在具有按扣顶部的1.5mL锥形底管中以1,300×g离心5min，以沉淀任何潜在的细胞碎片，并将上清液转移至具有o形环密封的干净螺旋盖管中并储存在-80℃直至分析。在管饲后20小时收集60微升或更少的血液到肝素化毛细管中。将血液保持在4℃，然后使用离心机(在被设计成毛细管的离心机中5min)旋转以在收集后4小时内分离血浆和血细胞比容。将血浆样品储存在-80℃下。
胆碱代谢物的测量：
为了测量血浆中的TMA，在-80℃下储存之前将样品酸化(最终10mM HCl)。使用稳定的同位素稀释HPLC和在线电喷雾电离串联质谱(LC/EST/MS/MS)方法定量TMAO和三甲胺(TMA)及其d9-同位素异构体，如(Wang Z，Klipfell E，Bennett BJ等人，(2011)Gut florametabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease，Nature 472：57-63)使用d4(1,1,2,2)-胆碱、d3(甲基)-TMAO和d3(甲基)-TMA作为内标。通过分析尿肌酸酐浓度调整尿液中TMAO的浓度以进行尿稀释。在研究期间的不同天采集样品，并且施用不同剂量以避免在较高剂量的提取物或组合物中的一些下的副作用。
实施例4提供了筛选用于胆碱向TMA和TMAO的转化的候选抑制提取物或组合物的示例性方法。
实施例5：用于鉴定和表征抑制由胆碱形成TMA的提取物或组合物的附加体外测 定。
植物提取物抑制细胞溶胞产物或全细胞中胆碱向TMA的转化的能力使用如Wang,Z、Roberts,AB、Buffa JA等人，(2015)Non-lethal inhibition of gut microbialtrimethylamine production for the treatment of atherosclerosis,Cell 163:1585-1595中所述的方法来测定。简而言之，通过抑制由重组奇异变形杆菌(P.mirabilis)Cut C/D溶胞产物、重组D.Alaskensis Cut C/D溶胞产物、或全细胞野生型奇异变形杆菌代谢的胆碱向TMA的转化，将功效测量为Log IC50(mg/mL)。
实施例5提供鉴定和定量样品中的TMA以及筛选候选抑制提取物或组合物的示例性方法。
实施例6：测定化合物功效的快速临床前方法。
挑战：根据NIH指南，将C57bl/6雌性小鼠(8周龄，约20g体重)保持在正常饮食下的12:12小时的光照:黑暗周期中，置于干净笼中，在灌胃前约1小时禁食。
样品制备：将上清液5(得自实施例1)中的各1mL等分试样放置于聚丙烯微量离心管中，并且在氮气吹扫下干燥(称为实施例6干燥的上清液5)。将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。将实施例6干燥的上清液5的所得干燥丸粒重悬于0.15mL/管超纯水(命名为实施例6重悬的上清液5)中。将四个管的实施例6重悬的上清液5混合以获得0.6mL材料。通过质谱法验证后，发现实施例6重悬的上清液5为0.6g/mL。将该0.6mL材料以1:1与4.8mg/mL d9-胆碱混合。给予每只动物0.2mL实施例6重悬的上清液5+d9-胆碱混合物，或其0.2mL稀释液等分试样。
使用1.5"22G球形尖端弯曲喂食针，通过管饲法给予小鼠0.2mL实施例6的重悬上清液5+d9-胆碱混合物(得自上文)或0.2mL的1/10、1/100或1/1000系列稀释液，以施用混合物。在禁食2小时后(灌胃给药后1小时)恢复喂食。在灌胃后1小时、2小时或3小时，将血液(30μL)收集到肝素化毛细管中。将血液保持在4℃，然后使用离心机(在被设计成毛细管的离心机中5min)旋转以在收集后4小时内分离血浆和血细胞比容。将血浆样品储存在-80℃下。通过LC-MS/MS测量d9胆碱、d9TMA和d9TMAO的浓度，如实施例4所述。
植物区系归一化：将灌胃后二十四小时的小鼠置于干净的笼中，并且将来自常规小鼠的粪便散布在所有笼中。
实施例6提供了筛选胆碱向TMA和TMAO的转化的候选抑制提取物或组合物的示例性方法。
与载体对照(如实施例6中对于代表性假泽兰属提取物所述)相比，抑制TMAO的血浆水平的EC50测量值(提供50％有效抑制的浓度)示于表5中。
表5：与载体对照相比，抑制TMAO产生的计算的EC50(mg/Kg)，如实施例6所述。在灌 胃后3小时计算EC50 。
表5
提取物ID 提取物源 EC<sub>50</sub>(mg/Kg)提取物
1 Mikania guaco，叶，提取物ID 1 22.3
实施例7：(2-羟乙基)二甲基氧化锍的提取和鉴定
使用生物测定指导的分级分离进行Mikania guaco叶中(2-羟乙基)二甲基氧化锍的提取和鉴定。对分配样品和级分样品测试生物活性以确定哪些样品需要进一步纯化。
Mikania guaco叶粉末(ChromaDex，Irvine CA，USA，部件号00031379-506，guaco(假泽兰属(Mikania))叶)用100mg/mL浓度的甲醇提取，并且搅拌过夜。过滤样品以去除固体颗粒，并且经由旋转蒸发器干燥提取物以制备提取物ID 19。提取物ID 19在4:1体积/体积氯仿/甲醇中以10mg/mL的浓度重构。向溶液中添加等体积的水并搅拌5分钟。去除有机层以获得期望的水性部分，然后将其在旋转蒸发器中干燥。将来自水性部分的丸粒以3mg/mL的浓度在1:1体积/体积正丁醇/水中重构。从该样品收集水性部分并干燥以制备提取物ID20。
在水中使提取物ID 20至多达200mg/mL，并使用制备型液相色谱进行分级分离。最初，使用C18柱(Waters，Atlantis T3，5μm，19×250mm)以0％至20％甲醇的水溶液(0.1％甲酸)梯度以13mL/min经过20分钟进行反相色谱。收集4-5分钟时的第一洗脱峰并在旋转蒸发器中干燥以制备提取物ID 21。在水中使提取物ID 21至多达200mg/mL，并使用HILIC(YMC，二醇，5μm，20×250mm)柱进行第二轮制备型液相色谱，其中A＝90:10体积/体积乙腈/水(10mM甲酸铵)并且B＝水(10mM甲酸铵)。梯度为在25分钟内以18mL/min的流动相A从90％至65％。使用相同的HILIC柱，在90:10体积/体积乙腈/水(10mM甲酸铵)等度条件下，对6-8分钟时洗脱(以80mg/Ml重悬于水中)的干燥级分进行第三轮制备型液相色谱。收集从该第二轮HILIC洗脱的13-14分钟时的级分并在旋转蒸发器中干燥以制备提取物ID 22，并进行处理以用于鉴定。
结构鉴定
使用HPLC-高分辨率质谱(HRMS)、串联质谱(MS/MS)、NMR(1H、13C和HSQC)和IR阐明提取物22中(2-羟乙基)二甲基氧化锍的结构。HRMS数据提供了C4H11O2S+的分子式和C2H7OS+的突出MS/MS碎片离子。因此，乙氧基化物官能团的存在得到支持。FT-IR支持羟基和亚砜官能团的存在。HSQC NMR确认了两个不同的亚甲基基团和两个相同的甲基基团的质子/碳相关性。另外，HRMS和NMR数据与文献中对于该结构报道的数据相匹配(Warabi,K.等人，Comparative Biochemistry and Physiology Part B，2001,27-30)，以进一步确认该鉴定。
Figure BDA0003052561420000361
(2-羟乙基)二甲基氧化锍，其中X-为氯离子、溴离子、碘离子或药学上可接收的阴离子。
从Mikania guaco叶中进行甲醇提取的中等规模制备。
在500mL螺旋盖聚苯乙烯烧瓶(Thermo Scientific)中，将十克Mikania guaco叶粉末(ChromaDex，Irvine CA，USA，部件号00031379-506，guaco(假泽兰属(Mikania))叶)悬浮于200mL甲醇(VWR BDH BDH1135-4LG)中，并且混合1小时。将混合物以1000×g离心20分钟以生成丸粒23和上清液23。去除上清液23并在氮气吹扫下在旋转蒸发器中干燥以生成提取物ID 23。在样品完全干燥后，计算提取物ID 23的重量。将所有样品在RT(室温)下保存在不透光的干燥器中直至使用。使用0.1％体积/体积Triton X-100(Sigma T8787)将提取物ID 23的等分试样重悬至25mg/mL的原液浓度，并如上进行涡旋。提取物ID 23的系列稀释液在无菌水与0.1％Triton X-100中稀释，基于50μg/mL的高剂量制备。然后将所有样品在室温下保存在不透光的干燥器中直至使用。
胆碱向TMA的转化的抑制
为了测试胆碱向TMA转化的抑制，将提取物ID 19、20、21、22或23(0.5mg)重悬于100μL的0.1％Triton X-100的无菌水溶液中至5mg/mL的最终浓度。基于50μg/mL的高剂量，在无菌水中的0.1％Triton X-100中制备提取物ID 19、20、21、22或23的系列稀释液。
提取物ID 19、20、21、22和23根据实施例2的方法用0.1％Triton X-100无菌水溶液中的系列稀释液进行测试。对于提取物ID 19、20、21、22和23，基于重悬的材料的实际质量计算样品浓度。测试的剂量范围为50μg/mL至0.0031μg/mL。数据示于表6中。
表6
提取物ID 提取物源 IC<sub>50</sub>(Log g/mL)提取物
19 Mikania guaco，叶，提取物ID 19 -6.72
20 Mikania guaco，叶，提取物ID 20 -7.09
21 Mikania guaco，叶，提取物ID 21 -7.42
22 Mikania guaco，叶，提取物ID 22 -8.59
23 Mikania guaco，叶，提取物ID 23 -6.75
根据实施例3测定提取物ID 20、21、22和23，如表7(胆碱向TMA转化的抑制)和表8(PrestoBlue活力数据)中所示。对于提取物ID 20、21、22和23，基于重悬的材料的实际质量计算样品浓度。测试的剂量范围为50μg/mL至0.763ng/mL。
表7
提取物ID 提取物源 IC<sub>50</sub>(Log g/mL)提取物
20 Mikania guaco，叶，提取物ID 20 -6.13
21 Mikania guaco，叶，提取物ID 21 -6.66
22 Mikania guaco，叶，提取物ID 22 -7.83
23 Mikania guaco，叶，提取物ID 23 -5.79
表8
Figure BDA0003052561420000381
实施例8：用于检测(2-羟乙基)二甲基氧化锍的质谱法。
如实施例1中的提取物ID 6和提取物ID 10所述制备植物材料的甲醇提取物，不同的是在氮气吹扫下干燥上清液后，将所得丸粒重悬于水中(UltraPureTM无DNA酶/RNA酶蒸馏水，Invitrogen目录号10977)以检测(2-羟乙基)二甲基氧化锍。
用0.1％甲酸的80％/20％乙腈/水溶液的植物提取物稀释100倍至500倍，并且掺入内标(13C3-三甲胺(13C3-TMA))。然后使(2-羟乙基)二甲基氧化锍和13C3-TMA在具有Atlantis二氧化硅HILIC Sentry保护柱(
Figure BDA0003052561420000382
3μm，2.1mm×10mm)的Waters AtlantisHILIC Silica柱(2.1×50mm，3μm颗粒)上进行梯度HPLC分析，10mM甲酸铵的水溶液与0.1％甲酸作为流动相A，并且0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B。检测和定量通过串联质谱法进行，其在多反应监测(MRM)MS/MS条件下操作((2-羟乙基)二甲基氧化锍的m/z为123.0→79.0，13C3-TMA的m/z为63.0→46.1)。使用在80％/20％/0.1％乙腈/水/甲酸中制得的(2-羟乙基)二甲基氧化锍校正标准物，通过绘制每种标准物的响应(峰面积(2-羟乙基)二甲基氧化锍/峰面积13C3-TMA)与浓度的关系图，来构建回归曲线。由二次(1/x2)回归曲线通过内插法测定植物提取物中(2-羟乙基)二甲基氧化锍的浓度。
表9
Figure BDA0003052561420000391
BQL＝低于定量极限(样品中的定量极限：10ng/mL)。
(2-羟乙基)二甲基氧化锍校正标准物的制备。
合成来源于如Carle J.S.、Christophersen,C.(1982)Toxicon 20:1，307-310中所述的方法。
Figure BDA0003052561420000392
在室温下向三甲基氧化锍氯化物(0.461g，3.585mmol)和37％HCHO(0.29mL，1当量)的溶液中添加10N NaOH(1.08mL，3当量)。将所得溶液在室温下搅拌15分钟。溶液通过浓盐酸来中和并蒸发。将固体残余物在EtOH(5mL)中于室温下研磨15分钟。过滤悬浮液。由MS分析滤液，示出多种化合物，包括SM、单加合物、二加合物和三加合物。蒸发滤液，并在高真空下进一步干燥，得到0.247g浅黄色固体。将来自过滤的固体在冰浴中在MeOH(2mL)中研磨30分钟并过滤。蒸发滤液，并在高真空下进一步干燥，得到0.165g白色固体，批次A-383-65B。1HNMR(300MHz,D2O):δ4.24-4.30(m,2H),4.17-4.23(m,2H),3.87(s,6H)。ESI-HRMS：123.0470(M+)。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其他变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。
Figure IDA0003052561460000011
Figure IDA0003052561460000021

Claims (8)

1.一种在个体中抑制胆碱向三甲胺(TMA)的转化并降低TMAO水平的方法，所述方法包括向所述个体施用包含假泽兰属的提取物的组合物，
其中所述组合物以有效抑制所述个体中由胆碱形成三甲胺(TMA)的量施用，并且所述胆碱向TMA的转化被抑制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物来源于Mikania guaco的叶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用于制备所述提取物的提取溶剂为1:1(体积/体积)的水:乙醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述假泽兰属提取物的量为约1μg至约500mg。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述假泽兰属提取物的量为约1μg至约50mg。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当与使用EC50所测量的载体对照相比时，所述假泽兰属提取物对胆碱向TMA的转化提供至少约50％的抑制。
7.根据权利要求6所述的方法，其中当与载体对照相比时，提供对胆碱向TMA的转化的至少约50％抑制的假泽兰属提取物的量小于将细胞活力降低至10％或更低的假泽兰属提取物的量。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用第二试剂，所述第二试剂选自：ω3油、水杨酸、二甲基丁醇、大蒜油、橄榄油、磷虾油、Co酶Q-10、益生菌、益生元、膳食纤维、车前子壳、开心果、铋盐、植物甾醇、葡萄籽油、葡萄渣、绿茶提取物、维生素D、抗氧化剂、姜黄、姜黄素、红曲米、米的发酵形式、大豆的发酵形式、乳酸发酵的苹果泥、小檗碱和白藜芦醇。
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