CN111344016B - 用于抑制胆碱向三甲胺(tma)的转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过提供包含式（I）所示化合物的组合物来抑制个体中胆碱向三甲胺（TMA）转化并降低TMAO的方法。

Description

用于抑制胆碱向三甲胺(TMA)的转化的方法

技术领域

本发明总体上涉及用于抑制个体中三甲胺产生的材料和方法。

背景技术

三甲胺(TMA)及其衍生物三甲胺N-氧化物(TMAO)是与诸如肾病、糖尿病、肥胖症、三甲基胺尿症和心血管疾病(CVD)的病症有关的代谢物。TMA在肠道中由细菌产生，该细菌能够将包括但不限于胆碱的底物转化为TMA。对于抑制由细菌产生TMA的化合物存在尚未满足的需求。

CVD是一个通用术语，其涵盖影响心脏和血管的一系列病况，包括动脉粥样硬化、冠心病、脑血管疾病、心力衰竭、心肌病、动脉粥样硬化血栓性疾病、主动脉-髂骨疾病和外周血管疾病。CVD通常与涉及狭窄、堵塞、动脉瘤或一个或多个血管解剖或血栓形成(血块形成)的病况相关。与CVD相关的并发症包括但不限于心肌梗塞、中风、心绞痛、急性冠脉综合征、短暂性脑缺血发作、充血性心力衰竭、主动脉瘤、心房颤动或扑动、室性心律失常、心脏传导异常、需要血运重建和死亡。血运重建可以包括但不限于血管成形术、支架置入术、冠状动脉旁路移植术、维修或置换血管分流器或通路诸如动静脉瘘。与动脉粥样硬化血栓性疾病相关的并发症包括但不限于心肌梗塞、中风、肺栓塞、深静脉血栓形成。根据世界卫生组织，CVD是全球死亡的主要原因，其中超过75％的死亡在低收入和中等收入国家发生。世界卫生组织简报第317号，2015年1月更新。世界卫生组织预测，到2030年，糖尿病将成为第七大死因。世界卫生组织简报第312号，2015年1月更新。包括CVD和糖尿病的与TMA和TMAO相关的病况的预防和管理是一个重大的公共卫生问题。

发明内容

本公开至少部分地基于以下发现：式(I)的化合物通过肠道微生物群抑制胆碱代谢，从而导致三甲胺(TMA)的形成降低。本公开提供用于例如在体外和体内抑制胆碱向TMA的转化以改善或维持心血管、脑血管或外周血管健康并改善或预防与TMA和TMAO相关的病况的组合物和方法。在某些方面，本发明提供一种或多种抑制个体中胆碱向TMA的转化的方法。

在某些方面，本发明提供一种或多种减少TMAO产生的方法，该方法包括通过提供一种或多种如式(I)所示的化合物来抑制由细菌引起的胆碱向TMA的转化。本发明提供一种抑制个体中胆碱向TMA的转化的方法。该方法包括向个体施用包含式(I)所示的化合物的组合物：

其中：

W选自F、Cl、Br或I；X^-为药学上可接受的阴离子，以及其盐或溶剂化物。

式(I)的化合物可以有效抑制个体中胆碱向TMA和TMAO的转化的量施用。

本发明还提供改善或维持心血管健康的方法。该方法可包括向个体施用包含以改善或维持心血管健康的量的如本文所述的如式(I)所示的化合物的组合物。本发明还提供改善个体中与胆碱向三甲胺(TMA)的转化相关的病况的方法。该方法包括向个体施用包含以有效改善病况的量的如本文所述的如式(I)所示的化合物的组合物。在一些实施方案中，病况可以是三甲基胺尿症、肾功能降低或受损、肾病、慢性肾病(CKD)、终末期肾病(ESRD)、糖尿病、肥胖症或心血管疾病，诸如心绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病(CAD)、颈动脉疾病、心内膜炎、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞(MI)、高血压/高血压症、高胆固醇血症/高脂血症、外周动脉疾病(PAD)或中风。在一些实施方案中，病况是由于口腔生物膜形成和牙周病引起的不良心室重构、心室收缩功能障碍、心室舒张功能障碍、心脏功能障碍、室性心律失常或心血管疾病或动脉粥样硬化。

本发明还提供式(I)的化合物，其用于在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持心血管健康以及改善与胆碱向TMA的转化相关的病况；以及式(I)的化合物用于在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持心血管健康以及改善与胆碱向TMA的转化相关的病况的用途。

上述总结并非旨在限定本发明的每个方面，而且在其它部分描述了附加方面，诸如具体实施方式。此外，本发明包括(作为附加方面)以任何方式在范围上比由上文示出的特定段落所定义的变体更为狭义的本发明的全部实施方案。例如，本发明的某些方面被描述为属，并且应当了解属的各个成员各自是本发明的一个方面。另外，应当将以属来描述或者选择属的成员的方面理解为涵盖属的两个或更多个成员的组合。在某些方面，本发明可被描述为涉及底物，例如胆碱，并且还可涉及所述底物的代谢物或前体，例如胆碱的前体或代谢物，诸如卵磷脂或甘油磷酸胆碱。对于以“一个”或“一种”来描述或进行权利要求的本发明的方面，应当了解这些术语意味着“一个(种)或多个(种)”，除非上下文明确要求更受限制的含义。除非上下文明确地另外要求，否则术语“或”应理解为替代地或一起地包括条目，例如X或Y表示X或Y或两者。如果本发明的方面被描述成“包含”特征，则实施方案还考虑了“由…所述特征组成”或者“基本上由…所述特征组成”。

具体实施方式

本发明组合物的组分描述于以下段落中。

本发明提供减少三甲胺(TMA)产生的一种或多种方法，该方法包括：使用包含式(I)所示化合物的组合物抑制由细菌引起的胆碱向TMA的转化。本发明还提供了制备一系列所选卤代烷基胺衍生物的合成方法，如式(I)所示。此类化合物可用于抑制在体内或体外胆碱向TMA的转化，或抑制由细菌产生TMA。式(I)的化合物可以有效抑制由个体肠道中的细菌，例如从底物(包括但不限于胆碱)产生TMA和TMAO的量被施用于个体。

由驻留在哺乳动物肠道中的细菌合成的TMA在肝脏中被氧化为三甲胺N-氧化物(TMAO、TMANO)。TMA的示例性前体包括胆碱、甜菜碱、磷脂酰胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、L-肉碱、TMAO、鞘磷脂和卵磷脂，它们中的许多来自饮食来源，诸如例如全蛋和牛肝。这些来源可作为细菌的底物，可将它们代谢成TMA。不希望受特定机制或生物化学途径的束缚，通过甘氨酰基酶同系物、胆碱三甲胺裂解酶(CutC)促进胆碱向TMA的厌氧转化。Craciun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(2012),109:21307-21312。由个体肠道中的细菌引起胆碱向TMA的转化的降低引起从肠道吸收的TMA降低，引起肝脏中由黄素单加氧酶3(FMO3)酶使TMA氧化成TMAO后血浆TMAO的随后降低。Wang等人，Nature(2011),472:57-63。较低的血浆TMAO水平与人类主要心血管事件的较低发生率有关。Tang等人，NEJM(2013)368:1575-1584。胆碱向TMA的转化可以由一种细菌介导或者包含涉及两种、三种或更多种细菌的多步骤过程。

如前所述，本发明至少部分地基于以下发现：式(I)的化合物干扰肠道微生物群的胆碱代谢，从而引起TMA和三甲胺N-氧化物(TMAO)的形成降低。本公开提供例如在体外和体内抑制胆碱向TMA的转化以改善或维持心血管、脑血管和外周血管健康并改善或预防与增加的TMA和TMAO相关的病况的组合物和方法。与TMA水平的升高相关的其他病况可包括由阴道中的细菌产生TMA导致阴道气味，或者由身体上的细菌产生TMA导致体臭，或者由口腔中的细菌产生TMA导致口臭或口腔护理生物膜的发展，或怀孕期间(妊娠晚期和产后时期)与血栓形成的风险增加相关，因此降低TMA和TMAO水平可降低这种风险。本公开另外提供了组合物和方法，其通过抑制胆碱分解代谢来增加胆碱在个体肠道中的利用率，该个体患有将有益于胆碱利用率增加的病况。一种这样的病况是在怀孕期间和产后时期，其中母亲肠道中胆碱的利用率增加可能会促进胎儿和新生儿的大脑发育。

由肠道细菌引起的胆碱向TMA的转化已归因于甘氨酰基酶同系物、胆碱三甲胺裂解酶CutC。Craciun等人，(2014)ACS Chem Biol 9:1408–1413。已经描述了并非所有肠道微生物都包含含有CutC的基因簇。Martinez-del Campo等人，(2015)mBio 6(2):e00042-15.doi:10.1128/mBio.00042-15。cut基因簇包含一组编码甘氨酰基酶CutC的基因，以及甘氨酰基活化蛋白CutD、cutC/D基因簇，Craciun等人，(2012)PNAS 109:21307-21312。

相比之下，大多数测序细菌将胆碱转化为甘氨酸甜菜碱(GB或三甲基甘氨酸)，其主要作为渗透保护剂。另外，一些细菌可将胆碱转化为GB，并且然后转化为甘氨酸，其可用作碳和氮的来源。Wargo(2013)Appl.Environ.Microbiol.79:2112-2120。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种此类细菌，可经由GB、二甲基甘氨酸(DMG)和肌氨酸将胆碱转化为甘氨酸。

除非另外指明，否则下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计。除非另外指明，否则本文提及的所有成分的百分比、比率和水平均基于该成分的实际量，并且不包括在可商购获得的产品中可与这些成分一起使用的溶剂、填料或其它物质。

除非另外指明，否则本文所涉及的所有测量均在25℃下进行。

本发明组合物的组分描述于以下段落中。

如本文所用，“剂量”是指根据可靠的医学经验，包含一定量适于在单个场合施用的药物活性物质的药物(诸如液体药物或口服剂量单元)的体积。剂型可口服。在一个示例中，剂型可为液体药物，并且可为约30mL，在另一个示例中为约25mL，在另一个示例中为约20mL，在另一个示例中为约15mL，并且在另一个示例中为约10mL，并且在另一个示例中为约5mL。在另一个示例中，液体药物的剂量可为约5mL至约75mL，在另一个示例中约10mL至约60mL，在另一个示例中约15mL至约50mL，在另一个示例中约25mL至约40mL，并且在另一个示例中约28mL至约35mL。在另一个示例中，剂型可为固体剂型，并且可为约25mg至约5g，在另一个示例中为约100mg至约3g，在另一个示例中为约250mg至约2g，在另一个示例中为约500mg至约1.6g，并且在另一示例中为约750mg至约1g。另外，剂型可为固体剂型，其中一个剂量为约3g或剂量可为约1.6g。考虑到液体或固体剂量尺寸，可调节活性成分的浓度以提供适当剂量的活性物质。在某些实施方案中，剂量可以约每4小时、约每6小时、约每8小时、约每12小时、或约每24小时施用。

如本文所用，“药物”是指包含式(I)的化合物的组合物，诸如药物，包括处方药物、非处方药物、柜台后药物、以及它们的组合。在一些示例中，药物可为可包含维生素、矿物质和补充剂(VMS)的饮食补充剂，包括补充剂或成分诸如植物成分。

药物组合物可为任何合适的形式，包括液体组合物和固体口服剂型。液体组合物的非限制性示例可包括糖浆、饮料、补给水、泡沫组合物、凝胶组合物、悬浮于液体制剂中的颗粒、凝胶或泡沫中的固体、盐水洗剂、以及它们的组合。固体口服剂型的非限制性示例可包括片剂、胶囊、囊片、小药囊、舌下剂型、颊面剂型、软凝胶和其它液体填充的胶囊、可溶性剂型(包括可溶性条)、膜、口香糖(包括中心填充的口香糖)、软糖(包括中心填充的软糖)、锭剂、中心填充的片剂、粉末、颗粒、丸粒、微球体、纳米球体、小珠或彩色糖豆、以及它们的组合。片剂可包括压缩片剂、咀嚼片、可溶性片剂等。在一些示例中，可将药物以软膏诸如基于凡士林的软膏施用于皮肤。在一些示例中，可在递送装置中提供药物。在其它示例中，药物可被吸入诸如鼻喷剂或吸入剂。在其他示例中，药物可存在于饮料中诸如温热饮料。在其他示例中，药物可包含药物活性物质。

药物可为可直接递送至口腔、喉咙或皮肤的形式。在一些实施方案中，药物组合物可通过递送装置递送，该递送装置选自点滴器、泵、喷雾器、滴液器、经由鼻腔通道递送的盐水洗器、杯、瓶、罐、加压喷雾器、雾化器、吸气装置、可挤压小袋、电动注射器、泡罩卡、和其它包装和设备、以及它们的组合。喷雾器、雾化器和吸气装置可连有电池或电源。

如本文所用，术语“个体”包括人类和其它类型的共享TMAO途径的哺乳动物，诸如家畜，包括但不限于家犬(犬科动物)、猫(猫科动物)、马、牛、雪貂、兔、猪、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、马等。

各种各样的个体可能希望降低由其消化道中的细菌产生的TMA水平。例如，被诊断患有心血管疾病的个体可以由医师指导以采用处方药或者改变生活方式，从而调制血液胆固醇水平以降低严重心血管事件的风险。其它未曾诊断患有心血管疾病但希望改善或维持心血管健康的个体也可能希望降低由消化道细菌产生的TMA水平。如本文进一步描述，TMA降低(以及引申开来，TMAO)通过本文所述的组合物实现，该组合物可包括例如包含式(I)的化合物的饮食补充剂。

本公开包括抑制胆碱向TMA的转化的方法、改善心血管健康的方法、以及改善与胆碱向TMA的转化相关的病况的方法，该方法包括向个体施用包含式(I)的化合物的组合物。下面描述组合物和方法的特征。章节标题是为了方便阅读，而并非旨在限制本身。全部本文件旨在作为统一的公开内容相关联，并且应当理解本文所述特征的全部组合均被考虑，即使特征的组合并非共同见于本文件的相同句子、段落或者章节之中。应该理解，本文所述的方法或化合物的任何特征可以全部或部分地删除，与本文所述的任何其它特征组合或替代本文所述的任何其它特征。

化合物

本发明的方法可包括向个体施用包含式(I)所示的化合物的组合物：

其中：

W选自F、Cl、Br或I；X^-为药学上可接受的阴离子，以及其盐或溶剂化物。

在某些实施方案中，化合物(如本文表2中所示)可选自N-(氯甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物、2-氟-N-(碘甲基)-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物、(2-氟乙基)(氟甲基)二甲基-l4-氮烷氯化物、和N-(溴甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物，以及其盐或溶剂化物。

在某些实施方案中，化合物可选自N-(氯甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵、2-氟-N-(碘甲基)-N,N-二甲基乙-1-铵、(2-氟乙基)(氟甲基)二甲基-l4-氮烷、N-(溴甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵，以及其药学上可接受的阴离子和盐和溶剂化物。

该化合物以有效实现所需效果，例如抑制胆碱向TMA的转化，改善或维持心血管健康或改善与胆碱向TMA的转化相关的病况的量施用。

本发明还提供了合成作为(I)的代表的所选卤代烷基胺衍生物的方法。通过提供包括如式(I)所示的组合物的组合物，此类化合物衍生物也可用于抑制由细菌产生TMA或抑制在体内或体外胆碱向TMA的转化。

式(I)的化合物可使用以下所示的通用方案1合成。

其中

X^-是药学上可接受的阴离子，并且n为1、2或3，并且包括其任何可接受的盐或溶剂化物；

包括使化合物A：

与结构B的化合物反应的步骤：

其中LG为本领域技术人员已知的任何合适的离去基团，

以形成式(I)的化合物；以及其任何可接受的盐或溶剂化物。

X^-可为能够与铵基团形成盐的阴离子。在某些实施方案中，X^-为药学上可接受的阴离子，该阴离子选自氯离子、溴离子、碘离子、磷酸盐和硫酸盐。附加的药学上可接受的酸加成盐包括例如琥珀酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐和三氟甲烷磺酸盐或三氟甲磺酸盐，因此X^-可选自琥珀酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐和乙醇酸盐。X-优选地为氯离子、溴离子、碘离子、三氟甲烷磺酸根或三氟甲磺酸根，盐形式。当目标化合物以亚砜形式存在时，则不存在X^-。当目标化合物以羧酸盐形式存在时，则不存在X^-。

“烷基”是指包含1至30个碳原子(即，C₁-C₃₀)，例如1至20个碳原子(即，C₁-C₂₀)或1至10个碳原子(即，C₁-C₁₀)的直链和支链饱和烃基团。在各种实施方案中，式(I)的烷基基团独立地选自C₁-C₄烷基，即具有涵盖整个范围(即，1至约4个碳原子)以及所有子组(例如，1-2、1-3、1-4、2-3、2-4、3-4、1、2、3和4个碳原子)的碳原子数目的烷基基团。烷基基团的非限制性示例包括烯丙基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基(2-甲基丙基)、叔丁基(1,1-二甲基乙基)和炔丙基。除非另有指明，否则烷基基团可以是未取代的烷基基团或取代的烷基基团。烷基基团也可被例如羟基(OH)、烷氧基、羧基、环烷基、杂环烷基和卤素中的一种或多种取代。

术语“杂烷基”被定义为与烷基相同，除了烃链或支链含有一至三个独立地选自氧、氮或硫的杂原子。术语“杂环烷基”或“杂环”与环烷基类似地定义，不同之处在于环包含一至三个独立地选自氧、氮或硫的杂原子。杂环烷基基团的非限制性示例包括哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、4H-吡喃、二氢呋喃、吗啉、噻吩、1,4-二噁烷、呋喃、吡啶、吡咯、吡咯烷、咪唑、吡唑、三唑、噻唑、吡嗪、吡喃、噁唑、噁嗪、噻嗪、嘧啶等。环烷基和杂环烷基基团可以是任选地被例如一至三个独立选择的烷基、烯基、OH、C(O)NH₂、NH₂、氧代(＝O)、芳基、卤代烷基、卤基和烷氧基的基团取代的饱和或部分不饱和环系。杂环烷基基团还可被烷基、羟烷基、烷氧基芳基、亚烷基芳基和亚烷基杂芳基进一步N-取代。

术语“环烷基”或“碳环的”是指包含3至8个碳原子(例如，3-5、5-8、3、4、5、6、7或8个碳原子)的脂肪族环状烃基团。环烷基基团的非限制性示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。除非另有指明，否则环烷基基团可以是未取代的环烷基基团或取代的环烷基基团。

术语“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指“-OH”基团。术语“氨基”或“胺”是指-NH₂或-NH-基团。“胺”包括任选地被一个或多个附加的杂原子取代的环胺。术语“羧基(carboxy)”或“羧基(carboxyl)”是指“-COOH”基团。术语“硫醇”或“巯基”是指“-SH”基团。术语“氰基”是指-C≡N基团，也被称为-CN。

“取代的”烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或烷氧基是指具有至少一个被非氢基(即，取代基)取代的氢基的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或烷氧基。非氢基(或取代基)的示例包括但不限于烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、醚、芳基、杂芳基、杂环烷基、羟基、氧基(或氧代)、烷氧基、酯、硫酯、酰基、羧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基或硫。当取代的烷基基团包含多于一个非氢基时，取代基可以与同一个碳或者两个或更多个不同的碳原子键合。

预期生理学上可接受的卤代烷基胺衍生物的盐，并且可通过使铵化合物与包含离去基团的烷基化剂反应来形成。通常在具有硫的烷基化反应中采用的离去基团是本领域已知的。离去基团，诸如但不限于本领域技术人员，包括卤化物(氯、溴、碘等)和醇的磺酸酯(甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、枯烯磺酸酯、三氟甲磺酸酯等)。生理学上接受的盐可直接由硫与烷基化剂的烷基化反应形成，或者可通过离子交换方法制备。生理上接受的盐包括但不限于卤代烷基胺卤化物、磷酸盐、羧酸盐和磺酸盐。

预期所公开的化合物的盐，诸如生理学上可接受的盐，并其可通过使适当的碱或酸与化学计量当量的化合物反应来制备。通常用于形成生理学上可接受的盐的酸包括无机酸，诸如二硫化氢、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，以及有机酸，诸如对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、二酒石酸、抗坏血酸、马来酸、苯磺酸、富马酸、葡糖酸、葡糖醛酸、甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、枯烯磺酸、乳酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸，以及相关的无机酸和有机酸。生理学上可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、三氟甲烷磺酸盐或三氟甲磺酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、O-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐以及其它盐。生理学上可接受的酸加成盐包括例如用无机酸诸如盐酸和氢溴酸形成的那些以及用有机酸诸如马来酸形成的那些。

生理学上可接受的碱加成盐可用金属或胺诸如碱金属和碱土金属或有机胺形成。化合物的生理学上可接受的盐也可以用生理学上可接受的阳离子来制备。可使用的生理学上可接受的阳离子是本领域公知的，并且包括碱金属、碱土金属、铵和季铵阳离子。碳酸盐或碳酸氢盐也是这方面的选择。用作阳离子的金属的示例是钠、钾、镁、铵、钙、铁等。可使用的胺的示例包括但不限于异丙胺、组氨酸、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。

在其他实施方案中，该化合物是稳定的同位素变体，例如其中氘取代一个或多个氢。

在各种实施方案中，式(I)的化合物显示IC₅₀为1×10^-3或更低，5×10^-3或更低，1×10^-4或更低，5×10^-4或更低，1×10^-5或更低，5×10^-5或更低，或1×10^-6或更低，或1×10^-7或更低，或1×10^-8或更低，或1×10^-9或更低，或1×10^-10或更低，或1×10^-11或更低，或1×10^-12或更低，或1×10^-9和1×10^-3之间，或1×10^-12和1×10^-9之间，或1×10^-9和1×10^-6之间，或1×10^-8和1×10^-6之间，或1×10^-6和1×10^-3之间，1×10^-6和1×10^-4之间，1×10^-6和1×10^-5之间，1×10^-5和1×10^-3之间，或1×10^-4和1×10^-3之间，或1.7×10^-11和1×10^-7之间，(观察到50％抑制由胆碱向TMA(或TMAO)的形成；mol/L)，在实施例2或实施例5中所述的测定中。在各种实施方案中，式(I)的化合物显示IC₅₀为1×10^-11和1×10^-7之间，或1×10^-8至1×10^-3之间，或1.2×10^-6至2×10^-3之间，或1×10^-6至1×10^-4之间，(观察到50％抑制由胆碱向TMA的形成；mol/L)，如在实施例2或实施例5中所述的测定中测量的。

在各种实施方案中，式(I)的化合物显示EC₅₀为1×10^-3或更低，5×10^-3或更低，1×10^-4或更低，5×10^-4或更低，1×10^-5或更低，5×10^-5或更低，或1×10^-6或更低，或1×10^-7或更低，或1×10^-8或更低，或1×10^-9或更低，或1×10^-10或更低，或1×10^-11或更低，或1×10^-12或更低，或1×10^-9和1×10^-3之间，或1×10^-12和1×10^-9之间，或1×10^-9和1×10^-6之间，或1×10^-8和1×10^-6之间，或1×10^-6和1×10^-3之间，1×10^-6和1×10^-4之间，1×10^-6和1×10^-5之间，1×10^-5和1×10^-3之间，或1×10^-4和1×10^-3之间，或1.7×10^-11和1×10^-7之间，(观察到50％抑制由胆碱向TMA(或TMAO)的形成；mg/kg)，在实施例6所述的测定中。在各种实施方案中，式(I)的化合物显示IC₅₀为1×10^-11和1×10^-7之间，或1×10^-8至1×10^-3之间，或1.2×10^-6至2×10^-3之间，或1×10^-6至1×10^-4之间，(观察到50％抑制由胆碱向TMA的形成；mg/kg)，如在实施例6所述的测定中测量的。

本发明包括抑制个体中胆碱向TMA的转化的方法，该方法可包括向个体施用如前所述的包含式(I)所示的化合物的组合物。在某些实施方案中，如本文所述，个体可能需要降低的TMA水平、改善心血管健康等。个体可在施用之前表现出升高水平的TMA或其代谢物(例如，TMAO、二甲胺(DMA)或单甲胺(MMA))。在各种实施方案中，个体患有心血管疾病，摄入高胆碱饮食，或表现出一种或多种CVD风险因素(例如，吸烟、压力、高总胆固醇、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、年龄、高血压、CVD家族史、肥胖症、前驱糖尿病、糖尿病等)。

还预期在体外抑制胆碱向TMA的转化的方法。例如，方法可包括使细菌诸如肠道微生物群中表现的细菌或代谢胆碱以产生TMA的细菌溶胞产物与如前所述的式(I)的化合物接触。在各种实施方案中，细菌可选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、脱硫孤菌(Desulfovibrio alaskensis)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、闪烁梭菌(C.scindens)、aldenense梭菌(C.aldenense)、氨基丁酸梭菌(C.aminobutyricum)、tanakaei柯林斯菌(Collinsella tanakaei)、阴道厌氧球菌(Anaerococcus vaginalis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、哈式溃疡菌(Desultitobacteriumhafniense)、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、克雷伯氏杆菌(K.pneumonia)、彭氏变形杆菌(P.penneri)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗格森埃希菌(E.fergussonii)、或它们的组合。在某些实施方案中，细菌可为表达cutC/D基因簇的细菌。本公开还提供鉴定抑制TMA产生的化合物的方法。该方法包括使细菌(诸如，作为肠道微生物群的一部分的细菌)或代谢胆碱以产生TMA的细菌溶胞产物与候选化合物(诸如，式(I)的化合物)接触以及检测TMA(或其代谢物)。在某些实施方案中，将由与候选化合物接触的细菌产生的TMA(或其代谢物)水平与(a)未与候选化合物或已知TMA抑制剂接触的细菌或溶胞产物产生的TMA水平或(b)与候选化合物接触之前由细菌产生的TMA水平相比较。由细菌或溶胞产物产生的TMA水平的降低指示候选化合物抑制胆碱向TMA的转化。

还预期在体外抑制胆碱向TMA的转化的方法。该方法包括使细菌或细菌溶胞产物与式(I)的一种或多种化合物接触。在各种实施方案中，细菌包括单一细菌物种或菌株，或者包括两种或更多种(例如，三种、四种、五种或更多种)不同细菌物种或细菌菌株的混合物。类似地，细菌溶胞产物可由单一细菌物种或菌株或者两种或更多种(例如，三种、四种、五种或更多种)不同细菌物种或细菌菌株的混合物产生。

应该理解，“抑制胆碱向TMA的转化”不需要经由胆碱代谢完全消除TMA的产生。预期由胆碱或胆碱相关代谢物作为前体形成TMA方面的任何降低，例如降低至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％；并且还包括约1％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、以及它们的任何组合。

在各种实施方案中，式(I)的化合物对胆碱向TMA的转化的抑制不是由抗生素作用机制引起的，例如，它不是由抗菌作用机制引起的，或者不是由与载体对照相比可将细胞活力降低至10％或更低的作用机制引起的。

在本发明的某些实施方案中，与载体对照相比，提供50％的胆碱向TMA的转化的抑制所需的化合物的量小于将细胞活力降低至10％或更低的化合物的量。

用于在体外或体内测量TMA的任何合适的方法可以用于本发明的上下文中。可以定量或定性地评估TMA、TMA的代谢物(包括TMAO、DMA或MMA)、TMA的稳定同位素(诸如氘标记的TMA，诸如d3-TMA、d6-TMA或d9-TMA)、TMAO的稳定同位素(诸如氘标记的TMAO，诸如d3-TMAO、d6-TMAO或d9-TMAO)、DMA的稳定同位素(诸如氘标记的DMA，诸如d3-DMA或d6-DMA)、MMA的稳定同位素(诸如氘标记的MMA，诸如d3-MMA)或胆碱(包括胆碱的稳定同位素，例如d9-胆碱)。检测和定量TMA的示例性方法描述于例如美国公布2010/00285517，其公开内容全文以引用方式并入本文。例如，TMA(或三甲胺N-氧化物(TMAO)、DMA或MMA)或胆碱的水平任选地经由质谱法、紫外光谱法或核磁共振光谱法测量。质谱仪包括电离源(诸如电喷雾电离)、根据质荷(m/z)比分离电离源中形成的离子的分析仪、以及用于带电离子的检测器。在串联质谱法中，包括两个或更多个分析仪。此类方法在本领域中是标准的并且包括例如具有在线电喷雾电离(ESI)和串联质谱的HPLC。

在各种实施方案中，在来自个体的生物样品中测量TMA或TMAO。生物样品包括但不限于全血、血浆、血清、尿液、粪便、唾液、汗液、阴道液、龈沟液或组织。样品可以使用任何临床上可接受的实践来收集，并且如果需要，则在适当的缓冲溶液中稀释，肝素化，浓缩或分馏。可以使用许多生理学pH下的许多水性缓冲溶液中的任一种，诸如磷酸盐、Tris等。也可以使用酸化的缓冲液。例如，向样品中加入缓冲液后的最终pH可任选地在pH 1和pH 6之间，或者在pH 1.5和pH 3.0之间。

此外，可将生物样品中的TMA(或其代谢物或稳定同位素)或胆碱的水平与对照值相比较。所用的对照值将取决于本发明的实施方案。在某些实施方案中，对照值可以是在施用或暴露于式(I)的化合物之前在个体中(或由细菌)产生的TMA或TMAO的水平。此外，对照值可基于从参考群体(诸如，来自普通人群的一组个体、诊断患有CVD或其它TMA相关病况的个体、先前未诊断患有TMA相关病况的个体、非吸烟者等，其未暴露于式(I)的化合物)获得的可相比的样品中测量的水平。TMA或TMAO或胆碱的水平可与单个对照值或一系列对照值相比较。通过将来自个体的生物样品中的TMA的量与对照值相比较，任选地将个体鉴定为在施用之前具有增强的TMA水平。

本发明还提供改善个体的心血管健康的方法。该方法包括向个体施用组合物，该组合物包含以有效改善心血管健康的量的如上文在子标题“化合物”下所述的式(I)所示的化合物。通过测试动脉弹性、血压、踝/臂指数、心电图、心室超声、血小板功能(例如，血小板聚集)和血/尿测试来评估心血管健康，以测量例如胆固醇、白蛋白排泄、C反应蛋白或血浆B型肽(BNP)浓度。在本发明的各种方面，式(I)的化合物的施用改善或维持测定结果中的一种或多种在正常范围内。每个测试的结果的正常范围在本领域中是已知的。在一些实施方案中，心血管健康的改善以循环总胆固醇水平降低、循环低密度脂蛋白(LDL)降低、循环甘油三酯降低或血压降低为特征。

本发明还包括改善对其有需要的个体中与胆碱向TMA的转化相关的病况的方法。该方法包括向个体施用组合物，该组合物包含以有效改善病况的量的式(I)的化合物。“改善病况”是指在与至少部分地由TMA引起的病症相关的症状的严重程度或发作方面的任何降低。本领域普通技术人员将理解，TMA有关的病症或与其相关的症状的任何程度的保护或改善对诸如人类的个体是有益的。通过降低个体中症状的任何严重程度或延迟症状出现来改善个体的生活质量。因此，一方面，在确定个体处于发展TMA有关的病症的风险中之后或在检测到TMA有关的病症之后尽可能尽快地执行的一种方法。

在本发明的各种方面，与胆碱向三甲胺的转化相关的病况是心血管疾病、三甲基氨基尿、肾功能降低或受损、肾病、慢性肾病、终末期肾病、三甲基胺尿症、肥胖症或糖尿病。术语“心血管疾病”(CVD)在本领域中用于提到影响身体的心脏、心脏瓣膜和脉管系统(诸如，动脉和静脉)的病况，并且涵盖包括但不限于下列的疾病和病况：动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌梗塞、急性冠脉综合征、心绞痛、充血性心力衰竭、主动脉瘤、主动脉夹层、髂动脉或股动脉瘤、肺动脉栓塞、原发性高血压、心房颤动、中风、短暂性脑缺血发作、收缩功能障碍、舒张功能障碍、心肌炎、房性心动过速、心室纤颤、心内膜炎、动脉病、血管炎、动脉粥样硬化斑块、易损斑块、急性冠脉综合征、急性缺血发作、心脏性猝死、外周血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病(PAD)、脑血管疾病、不良心室重构、心室收缩功能障碍、心室舒张功能障碍、心功能障碍、室性心律失常等。

病况可能是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化涉及动脉粥样硬化斑块的形成，其导致脉管系统狭窄(narrowing)(“狭窄(stenosis)”)，这最终可能导致血管的部分或完全闭塞或破裂(动脉瘤)、心力衰竭、主动脉夹层和缺血事件诸如心肌梗塞和中风。在各种非限制性实施方案中，本发明的方法抑制、降低或逆转(全部或部分地)动脉粥样硬化的发作或进展(例如，降低或防止动脉硬化或增厚、斑块形成、内皮损伤或动脉炎症)。

病况可能是三甲基胺尿症。三甲基胺尿症(TMAU)是一种病况，其特征在于个体不能将TMA转化为TMAO，其中受影响的个体可能在其尿液、汗液或呼吸中存在鱼状体臭。(Yamazaki等人，Life Sciences(2004)74:2739-2747)。此类个体可受益于由肠道中的细菌将底物(包括但不限于胆碱)代谢成TMA的减少。具有TMAU的个体或希望降低其TMA和TMAO水平的个体也可消耗活性炭或叶绿素铜，其充当多价螯合剂，例如使TMA不能转移到个体的血流中。此类多价螯合剂可吸附TMA，然后TMA与多价螯合剂一起从消化道排出。

本发明还提供式(I)的化合物，其用于在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持与胆碱向TMA的转化相关的病况；以及式(I)的化合物在体内或体外抑制胆碱向TMA的转化，以改善或维持与胆碱向TMA的转化相关的病况的用途。如前所述，本发明至少部分地基于以下发现：式(I)的化合物抑制肠道微生物群的胆碱代谢，从而引起TMA和三甲胺N-氧化物(TMAO)的形成降低。本公开提供用于例如在体外和体内抑制胆碱向TMA的转化以改善或维持心血管、脑血管和外周血管健康并改善或预防与TMA和TMAO相关的病况的组合物和方法。

在各种实施方案中，式(I)的化合物的施用导致TMA或TMAO水平降低、总胆固醇水平降低、LDL水平降低、HDL水平升高、甘油三酯水平降低或与CVD相关的其它生物标志物(例如，排泄的白蛋白、C反应蛋白或血浆B型肽(BNP))的水平正常化。在一些实施方案中，当施用给个体时，式(I)的化合物降低心血管疾病、三甲基胺尿症、肾功能降低或受损、肾病、慢性肾病、终末期肾病、三甲基胺尿症、肥胖症或糖尿病的风险。

施用方案和组合物

施用给个体的化合物的量足以抑制(全部或部分地)由胆碱形成TMA。在本公开的各种方面，该量改善心血管健康或相对于与TMA相关的不希望的病况实现有益的生物应答(例如，该量足以改善、减缓进展或预防病况(诸如CVD))。有益效果可以通过例如临床病况的改善、症状的减轻或通过本文所述的任何测定或临床诊断测试来检测。个体的确切有效量可以取决于个体的体重、身材和健康；病况的性质和程度；以及选择施用的化合物或试剂组合。在各种方面，施用给个体的化合物的量为约0.001mg/kg至约1000mg/kg。以mg/kg计的特定剂量范围包括约0.1mg/kg至约500mg/kg、约0.5mg/kg至约200mg/kg、约1mg/kg至约100mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg、以及约5mg/kg至约30mg/kg。有效量可作为化合物的单次施用或作为分次剂量(诸如，同时或在接近的时间以多个亚单位施用的单剂量)施用给个体。一定量的化合物可每天递送一次、两次或三次；每周一次、两次或三次；或者每月一次、两次、三次或四次。化合物可作为在体外或体内转化成活性药物的前药递送。

包含化合物的组合物通过允许抑制胆碱向TMA的转化的任何途径来施用。在本发明的各种方面，将包含化合物的组合物肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、肺内、皮下或肌内)、鞘内、局部、透皮、直肠、口服、舌下、鼻内或通过吸入递送至个体。在各种实施方案中，化合物或包含化合物的组合物经由诸如通过摄取被施用到胃肠道。当与胃肠道中的体液接触时，也可以采用持续释放制剂来实现化合物的受控释放。持续释放制剂在本领域中是已知的，并且通常包含生物可降解聚合物的聚合物基质、水溶性聚合物或两者的混合物，任选地还有合适的表面活性剂。

本发明提供包含用一种或多种生理学上可接受的赋形剂、载体、稳定剂、片剂或稀释剂配制以在本文所述的方法中使用的式(I)的化合物的组合物。赋形剂包括但不限于载体分子，该载体分子包括大的缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、螯合剂(例如，EDTA)、碳水化合物(例如，糊精、羟烷基纤维素或羟烷基甲基纤维素)、脂质体、硬脂酸、液体(例如，油、水、盐水、甘油或乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

诸如用于肠胃外或口服施用的组合物通常为固体(例如，冻干粉末或块状物)、液体溶液、乳剂或悬浮液，而用于肺部施用的可吸入组合物通常为液体或粉末。示例性剂型包括但不限于片剂、糖锭剂、锭剂、水或油悬浮液、非水溶液、粉末、可分散粉末或颗粒剂(包括微粒化粒子或纳米粒子)、乳剂、硬或软胶囊、硬或软液体填充的胶囊、胶囊锭、糖浆剂和酏剂。固体剂量组合物例如片剂或液体填充的胶囊可以是未包衣的，或者可以通过包括微胶囊的已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸附。固体剂量组合物可以被包衣以靶向递送至消化道的特定区域。例如，组合物可被肠溶包衣以将组合物靶向递送至小肠、大肠或结肠。附加的示例性剂型可以包含悬浮液或液体基体中的包衣的微胶囊或包衣的微珠。在一些实施方案中，式(I)的化合物作为饮食(例如，食物或饮品)补充剂提供。饮食补充剂是口服给药的，并且通常包含维生素、矿物质、草药或其它植物成分、氨基酸、酶、器官组织、来自腺体的组织或代谢物。例如，式(I)的化合物可作为条形式的食物提供。

在一些实施方案中，本文所述的化合物在适用于低溶解度化合物的基于脂质的组合物中可被配制成口服。基于脂质的组合物通常可增强此类化合物的口服生物利用度。因此，在一些方面，组合物包含一定量的本文所述的化合物以及至少一种选自中链脂肪酸及其丙二醇酯的赋形剂(例如，可食用脂肪酸的丙二醇酯，诸如辛酸和癸酸脂肪酸)和生理学上可接受的表面活性剂诸如聚氧乙烯40氢化蓖麻油。

在一些实施方案中，本文所述的化合物可以延迟释放组合物的形式提供，并且任选地在个体的消化道的特定区域中释放。例如，可提供组合物，使得化合物在消化道的远侧部分诸如回肠或结肠中自口服组合物释放。在某些实施方案中，延迟释放组合物在特定pH下或在一定pH范围内释放化合物，以在个体的消化道内靶向递送。化合物可以例如在pH6.0和pH 9.0之间、pH 6.5和pH 8.0之间、pH 6.5和pH 7.5之间、pH 7.0和pH7.5之间、或者pH 7.0和pH 8.0之间释放。

本发明的方法可包括向个体施用第二试剂。术语“第二试剂”仅用于将所述试剂与式(I)的化合物加以区分，并不意味着限制在方法中使用的另外试剂的数量或表示施用顺序。将一种或多种第二试剂任选地掺入具有同时施用但以分开的剂型或者在时间上分开施用的式(I)的化合物的组合物中。

示例性第二试剂包括但不限于抗微生物剂(诸如杀死肠道中的细菌的抗生素)；改善肠道蠕动的试剂(诸如纤维或洋车前子)；进一步降低肠道中TMA水平的试剂，包括多价螯合剂(诸如活性炭或叶绿素铜)；进一步降低TMA水平或产生TMA代谢物的试剂；改善心血管健康的一个或多个方面的试剂，诸如使血压正常化、减少血管炎症、减少血小板活化、使脂质异常正常化的试剂；促进体内TMA排泄的试剂；或结合TMA使得它不能转换为TMAO的试剂。在各种实施方案中，第二试剂选自Omega 3油、水杨酸(阿司匹林)、二甲基丁醇、大蒜油、大蒜提取物、橄榄油、磷虾油、Co酶Q-10、益生菌、益生元、饮食纤维、洋车前子壳、铋盐、植物甾醇、葡萄籽油、绿茶提取物、维生素D、抗氧化剂(诸如维生素C和维生素E)、姜黄、姜黄素、白藜芦醇、活性木炭或叶绿素铜。在某些实施方案中，组合物包含二甲基丁醇或由除胆碱之外的前体(例如甜菜碱、磷脂酰胆碱、巴豆甜菜碱或肉碱)形成TMA的抑制剂。在US 2017/0151208、US 2017/0151250、US 2017/0152222或US 2018/0000754中描述了附加的示例性第二试剂，这些专利通过引用并入本文。

本公开的方法还可包括施用一种或多种心血管疾病疗法。疗法的示例包括但不限于他汀类(例如，Lipitor^TM(阿托伐他汀)、Pravachol^TM(普伐他汀)、Zocor^TM(辛伐他汀)、Mevacor^TM(洛伐他汀)和Lescol^TM(氟伐他汀))或干扰HMGCoA还原酶的活性的其它试剂；烟酸(尼克酸，其降低LDL胆固醇水平)；贝特类(其降低血液甘油三酯水平并且包括例如苯扎贝特(诸如

)、环丙贝特(诸如

)、氯贝丁酯、吉非贝齐(诸如，

)和非诺贝特(诸如，

))；胆汁酸树脂(诸如考来烯胺、考来替泊(Colestipol)(考来替泊(Colestid))和Cholsevelam(Welchol))；胆固醇吸收抑制剂(诸如依替米贝(

))；植物甾醇(诸如谷甾醇(Take Control(Lipton))；谷甾烷醇(Benechol)或豆甾烷醇)；藻酸盐和果胶；卵磷脂和营养制品(诸如绿茶提取物和其它提取物，包括多酚，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、Cholest-Arrest^TM(500mg大蒜和200mg卵磷脂)。Cholestaway^TM(700mg碳酸钙、170mg氧化镁、50μg吡啶甲酸铬)、Cholest-Off^TM(900mg植物甾醇/甾烷醇)、Guggul Bolic(750mg古古脂(印度穆库尔没药胶树脂)和

(600mg老龄大蒜提取物和380mg卵磷脂))。

在前述实施方案的相关变体中，包含单独或与一种或多种第二试剂组合的本文所述的式(I)的化合物的组合物可任选地被布置成试剂盒或包装或单位剂量，诸如容许共同施用多种试剂的试剂盒或包装或单位剂量。另一方面，包含式(I)的化合物和一种或多种第二试剂的组合物是混合物。在各种实施方案中，试剂盒或包装或单位剂量的一种或多种组分与关于施用这一种或多种组分到个体的说明书一起包装。

本发明的其它方面和优点将在考虑以下例示性实施例后理解，该例示性实施例并非旨在以任何方式进行限制。

式(I)的代表性化合物的结构列于表1中。药学上可接受的抗衡离子可包括但不限于氯离子、溴离子或碘离子，以及其盐和溶剂化物。

表1

实施例

实施例1：化合物的合成

除非另有说明，否则所有合成程序均在室温(RT)和大气压下进行。

以下是代表性的式(I)的化合物：

实施例1.1：N-(氯甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物的合成。

在配备有搅拌棒，油浴和回流冷凝器的250mL圆底烧瓶中，加入10g2-氟乙胺盐酸盐(CAS 460-08-2)。在10分钟内，通过玻璃吸管滴加30mL甲醛溶液(CAS 50-00-0,37％水溶液)。在10分钟内，通过玻璃吸管滴加40mL甲酸((CAS 64-18-6)。将该反应混合物在110℃下回流10小时。在将反应混合物冷却至室温后，加入20mL浓盐酸(CAS 7647-01-0,36.5-38.0％)。旋转蒸发后，将粗产物(2-氟-N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐)在2-丙醇/乙醚中重结晶。LC/MS:(ESI+)92。

在配备有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中，加入1g 2-氟-N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐、0.6g氢氧化钠(CAS 1310-73-2)和40mL乙醇/乙腈(1/1)。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。使用Chemrus一次性过滤漏斗除去氯化钠。向滤液溶液中加入1.5g四氟硼酸银(CAS14104-20-2)和2mL氯碘甲烷(CAS 593-71-5)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。使混合物通过预填充的Amberlite IRA Cl-型柱(50mL树脂)。用甲醇(100mL)进一步洗涤树脂。旋转蒸发组合的流出物后，将油状产物进一步用乙醚(3×100mL)洗涤，然后在室内真空下(5-10mm Hg)干燥过夜，得到1.5g最终产物。LC/MS:(ESI+)140。

实施例1.2：2-氟-N-(碘甲基)-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物的合成。

在配备有搅拌棒，油浴和回流冷凝器的250mL圆底烧瓶中，加入10g2-氟乙胺盐酸盐(CAS 460-08-2)。在10分钟内，通过玻璃吸管滴加30mL甲醛溶液(CAS 50-00-0,37％水溶液)。在10分钟内，通过玻璃吸管滴加40mL甲酸((CAS 64-18-6)。将反应混合物在110℃下回流10小时。在将反应混合物冷却至室温后，加入20mL浓盐酸(CAS 7647-01-0,36.5-38.0％)。旋转蒸发后，将粗产物(2-氟-N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐)在2-丙醇/乙醚中重结晶。LC/MS:(ESI+)92。

在配备有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中，加入1g 2-氟-N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐、0.6g氢氧化钠(CAS 1310-73-2)和40mL乙醇/乙腈(1/1)。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。使用Chemrus一次性过滤漏斗除去氯化钠。向滤液溶液中加入1.5g四氟硼酸银(CAS14104-20-2)和0.76mL二碘甲烷(CAS 75-11-6)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。使混合物通过预填充的Amberlite IRA Cl-型柱(50mL树脂)。用甲醇(100mL)进一步洗涤树脂。旋转蒸发组合的流出物后，将油状产物在2-丙醇/乙醚中重结晶，然后在室内真空下(5-10mm Hg)干燥过夜，得到1g最终产物。LC/MS:(ESI+)232。

实施例1.3：2-氟-N-(氟甲基)-N,N-二甲基乙-l-铵氯化物的合成。

在配备有搅拌棒，油浴和回流冷凝器的250mL圆底烧瓶中，加入10g2-氟乙胺盐酸盐(CAS 460-08-2)。在10分钟内，通过玻璃吸管滴加30mL甲醛溶液(CAS 50-00-0,37％水溶液)。在10分钟内，通过玻璃吸管滴加40mL甲酸((CAS 64-18-6)。将反应混合物在110℃下回流10小时。在将反应混合物冷却至室温后，加入20mL浓盐酸(CAS 7647-01-0,36.5-38.0％)。旋转蒸发后，将粗产物(2-氟-N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐)在2-丙醇/乙醚中重结晶。LC/MS:(ESI+)92。

在配备有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中，加入0.5g 2-氟-N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐、0.2g氢氧化钠(CAS 1310-73-2)和40mL乙醇/乙腈(1/1)。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。使用Chemrus一次性过滤漏斗除去氯化钠。向滤液溶液中加入1g四氟硼酸银(CAS14104-20-2)和0.3mL氟(碘)甲烷(CAS 373-53-5)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。使混合物通过预填充的Amberlite IRA Cl-型柱(50mL树脂)。用甲醇(100mL)进一步洗涤树脂。旋转蒸发组合的流出物后，将油状产物在2-丙醇/乙醚中重结晶，然后在室内真空下(5-10mm Hg)干燥过夜，得到0.5g最终产物。LC/MS:(ESI+)124。

实施例2：用于鉴定和表征抑制由胆碱形成TMA的化合物的测定。

该实施例提供用于鉴定和表征抑制由胆碱形成TMA的化合物的示例性测定。

使奇异变形杆菌29906(Pm)菌株在500ml营养肉汤培养基

(3g/L牛肉提取物，5g/L蛋白胨；Difco#234000)中在37℃下以250rpm振荡有氧生长过夜。生物质通过在4℃以6000×g离心12分钟而沉淀。使细胞丸粒在240mL冰冷的1X磷酸盐缓冲盐水(不含Ca²⁺和Mg²⁺)中悬浮。加入90微克溶菌酶(Sigma#L6876，批号#SLBG8654V；Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)并在4℃下以320rpm振荡温育30分钟。溶胞是经由具有预冷却到4℃的直径为1"的腔室的法式滤压壶(Frenchpress)在1000psi(高比率；内部PSI相当于约16000)实现。将溶胞产物在4℃下以6,000×g离心12分钟以使额外的碎片粒化。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce#23225；Thermo Fisher Scientific Co.，Waltham，MA)测定离心的溶胞产物上清液的蛋白质浓度，并用1×杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)将蛋白质浓度调节至3mg/ml。将离心的上清液溶胞产物等分成20mL体积并在-80℃下冷冻储存。

奇异变形杆菌29906(Pm)溶胞产物用1×DPBS稀释至1.5mg/mL蛋白质。加入氯化胆碱(CC)(1M储备液)以达到2.5mM氯化胆碱的最终浓度。混合物使用涡旋混合器混合约15秒，并在37℃下温育22小时。温育后，将150μL的CC处理的Pm溶胞产物分配到深孔板(聚丙烯，2mL体积，Corning Axygen目录#P-DW-20-C)中。以1:100稀释度加入来自表1的候选IC₅₀化合物和载体对照物(DMSO或水的相应载体对照物)或对照化合物(IC50对照，8-喹啉半硫酸盐(Sigma目录#55100))(例如，每孔1.5μL)。将平板在平板振荡器上搅拌1分钟。向所有孔中加入d9-氯化胆碱(1.5μL，5mM)以达到50μM的最终d9-氯化胆碱浓度。

再次将平板在平板振荡器上搅拌1分钟，并在37℃下温育2小时。温育后，向每个孔中加入1.5μL甲酸(最终浓度＝1％甲酸)。将平板在平板振荡器上搅拌1分钟并置于冰上。将细胞溶胞产物样品掺杂稳定同位素标记的内标(向每个样品中加入22.5μL的6μg/mL的13C3-三甲胺(13C3-TMA))，然后在如下所述的蛋白质沉淀之后从溶胞产物中分离d9-三甲胺(d9-TMA)、三甲胺(TMA)和13C3-TMA。将用0.1％甲酸酸化的乙腈(600μL)加入到每个样品中，然后将其离心(2100g，20分钟)以使蛋白质和其它沉淀物粒化。如下所述移出并分析上清液。分离的上清液样品中的TMA、d9-TMA和13C3-TMA在具有来自Waters Corp.,Milford,Mass.的Atlantis Silica HILIC Sentry保护管柱(

3μm,2.1mm×10mm)的来自Waters Corp.,Milford,Mass.的Waters Atlantis HILIC Silica柱(2.1mm×50mm，3μm粒子)上进行梯度高效液相色谱(HPLC)，其中具有0.1％甲酸的10mM甲酸铵水溶液作为流动相A且0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B。检测和定量通过在多反应监测(MRM)MS/MS条件下操作的串联质谱法实现(TMA，m/z 60.1→44.1；d9-TMA，m/z 69.1→49.1；13C3-TMA，m/z63.0→46.1)。使用在80％/20％/0.1％乙腈/水/甲酸中制备的TMA和d9-TMA校准标准物(STD)通过绘制每种标准物的应答(峰面积TMA/峰面积13C3-TMA)对浓度构建回归曲线。通过二次(1/x2)回归曲线插值确定细胞溶胞产物中TMA和d9-TMA的浓度。

实施例2提供鉴定和定量样品中的TMA以及筛选候选抑制化合物的示例性方法。

对于代表性的式(I)的化合物，如实施例2所述，用于抑制胆碱向TMA的转化的IC₅₀测量值列于表2中。

表2

实施例3：多微生物筛选方法

用氘标记的胆碱化合物进行人类粪便多微生物培养的筛选方法，包括细胞活力测定。在用于实验之前，将所有材料在无氧室中预还原24小时，并在无氧条件下(用85％氮气、5％氢气、10％二氧化碳吹扫室)进行实验程序。

从没有慢性病、血源性疾病或活动性感染的健康男性志愿者收集人类粪便样品。志愿者在捐赠前两个月内未接受抗生素治疗，并提供了书面知情同意书。通过将粪便重悬在含有3％(w/v)胰蛋白酶大豆肉汤、1％(w/v)海藻糖、pH 7.3的培养基中，将样品稀释以制成20％(w/v)的粪便浆液。将粪便浆液均质化，并使用带有集成170μm膜的抽油烟袋手动过滤。将DMSO(5％(w/v))加入到经过滤的浆液中，并将等分试样储存在-80℃的低温小瓶中直至使用。用M9培养基(Na₂HPO₄(6g/L)、KH₂PO₄(3g/L)、NaCl(0.5g/L)，添加0.1mM CaCl₂和1mMMgSO₄)将冷冻的粪便浆液稀释至0.2％(w/v))并分配(1mL)到96孔深孔板中。将含有50μMd9-胆碱氯化物和剂量范围为500μM至3.81nM的化合物的稀释粪便浆液密封，并在37℃摇动下温育。20小时后，如下所述使用PrestoBlue细胞活力试剂(Thermo Fisher Scientific，USA)分析粪便多微生物群落的等分试样的活力。随后将反应板离心(在4℃下以4000×g的速度离心12分钟)以沉淀粪便，然后转移150μl等分试样，并加入甲酸至1％(v/v)进行淬灭。所有粪便处理和多微生物测定步骤均在无氧环境中进行。通过LC/MS/MS确定产物，并如先前在实施例2中对TMA和d9-TMA的检测和分析所述计算IC₅₀值。将胆碱转化为TMA的抑制计算为IC₅₀(mol/升)

对于PrestoBlue细胞活力测定，将6μL粪便多微生物群落测定的等分试样添加到黑色透明底96孔板中的84μL M9培养基中。向其中加入10μLPrestoBlue试剂，盖上盖子，以800rpm的转速摇动1分钟。将板在37℃下温育30分钟，并按照制造商的说明读取荧光。与载体对照(例如1％DMSO)相比，将细胞活力计算为荧光百分比。

实施例3提供了筛选候选抑制化合物的示例性方法，候选抑制化合物用于将胆碱转化为TMA并计算细胞活力。

实施例4：临床前筛选方法

从第0天开始，小鼠(C57bl/6，约19g，10周龄；n＝5/组)根据NIH指南在12:12小时光照:黑暗循环中维持并随意提供有1％胆碱加入饮食(制备的Envigo定制制剂，类似于Teklad Global Rodent Diet 2018)。在引入饮食的同时，使用1.5″22G球尖弯曲喂食针对小鼠每天口服灌服一次，以剂量0、1.0、3.1、10、31、100或310mg/kg/天中的一个或多个给予200μl或更少水中的化合物。每天早上收集一次尿液。用手约束动物，并且通过盆腔区域的轻微触诊表达膀胱。将l-5μl尿液的等分试样在具有按扣顶部的1.5mL锥形底管中以1,300×g离心5min，以沉淀任何潜在的细胞碎片，并将上清液转移至具有o形环密封的干净螺旋盖管中并储存在-80℃直至分析。在管饲后20小时收集60微升或更少的血液到肝素化毛细管中。将血液保持在4℃，然后使用离心机(在被设计成毛细管的离心机中5min)旋转以在收集后4小时内分离血浆和血细胞比容。将血浆样品储存在-80℃下。

胆碱代谢物的测量：

为了测量血浆中的TMA，在-80℃下储存之前将样品酸化(最终10mM HCl)。使用稳定的同位素稀释HPLC和在线电喷雾电离串联质谱(LC/EST/MS/MS)方法定量TMAO和三甲胺(TMA)及其d9-同位素异构体，如(Wang Z，Klipfell E，Bennett BJ等人，(2011)磷脂酰胆碱的肠道菌群代谢促进心血管疾病，Nature 472：57-63)使用d4(1,1,2,2)-胆碱、d3(甲基)-TMAO和d3(甲基)-TMA作为内标。通过分析尿肌酸酐浓度调整尿液中TMAO的浓度以进行尿稀释。在研究期间的不同天采集样品，并且施用不同剂量以避免在较高剂量的化合物中的一些下的副作用。

实施例4提供了筛选用于将胆碱转化为TMA的候选抑制化合物的示例性方法。将抑制计算为剩余血浆TMAO作为同一天载体对照中血浆TMAO的百分比。

实施例5：用于鉴定和表征抑制由胆碱形成TMA的化合物的另外的体外测定。

使用如Wang，Z，Roberts，AB，Buffa JA等人，(2015)非致命性抑制肠道微生物三甲胺产生产以治疗动脉粥样硬化，细胞163：1585-1595中所述的方法，测定化合物抑制细胞溶胞产物或全细胞中胆碱向TMA转化的能力。简而言之，通过抑制由重组P.mirabilis Cut C/D溶胞产物、重组D.alaskensis Cut C/D溶胞产物或全细胞野生型P.mirabilis代谢的胆碱向TMA的转化，以IC50(nM)衡量有效性。

对于代表性的式(I)的化合物，如实施例5所述，用于抑制胆碱向TMA的转化的IC₅₀测量值列于表3中。

表3

实施例5提供鉴定和定量样品中的TMA以及筛选候选抑制化合物的示例性方法。发现表3中的所有化合物均抑制胆碱向TMA的转化。

实施例6：快速临床前方法以确定化合物功效。

挑战：按照NIH指南，将C57bl/6雌性小鼠(8周龄，体重约20gBW)在正常食物的条件下以12:12hr的光:暗周期保持放置在无食物干净的笼子中，直到灌服前约1小时。使用1.5″22G球尖弯曲喂食针通过口服灌服法，给小鼠2mg d9-胆碱+x mg/kg抑制剂(其中x＝0至310mg/kg)在水中，以200μl水中的化合物给药。禁食2小时后(灌服给药后1小时)返回食物。灌服后2、3和4小时，将血液(30μL)收集到肝素化的毛细管中。将血液保持在4℃，然后使用离心机(在被设计成毛细管的离心机中5min)旋转以在收集后4小时内分离血浆和血细胞比容。将血浆样品储存在-80℃下。通过LC-MS/MS测量d9胆碱、d9TMA和d9TMAO的浓度。

菌群标准化：将灌服后二十四小时的小鼠置于干净的笼子中，并且将常规小鼠的粪便散布在所有笼子中。

实施例6提供了筛选用于将胆碱转化为TMA的候选抑制化合物的示例性方法。

对于代表性的式(I)的化合物，如实施例6所述，用于抑制胆碱向TMA的转化的EC₅₀测量值列于表4中。

表4：如实施例6中所述，与载体对照相比，计算的EC₅₀(mg/kg)。

ID	化合物名称	EC<sub>50</sub>(mg/kg)	时间
				1	N-(氯甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物	3.10	3小时
2	2-氟-N-(碘甲基)-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物	15.40	3小时
				3	(2-氟乙基)(氟甲基)二甲基-l4-氮烷氯化物	1.10	3小时

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。

虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出多个其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims (8)

1.一种组合物，所述组合物包含生理学上可接受的载体和式（I）的化合物：

式（I），

其中：

W选自F、Cl、Br或I；

X^-是药学上可接受的阴离子。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述化合物选自N-(氯甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物、2-氟-N-(碘甲基)-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物、2-氟-N-(氟甲基)-N,N-二甲基乙-l-铵氯化物和N-(溴甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中W为F，X^-选自Cl^-、Br^-或I^-。

4.包含式（I）所示化合物的组合物在药物制造中的用途，所述药物用于在个体中抑制胆碱向三甲胺(TMA)的转化并降低TMAO水平：

式（I），

其中：

W选自F、Cl、Br或I；

X^-是药学上可接受的阴离子。

5.根据权利要求4所述的用途，其中

W为F，X^-选自Cl^-、Br^-或I^-。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述化合物选自N-(氯甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物、2-氟-N-(碘甲基)-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物、2-氟-N-(氟甲基)-N,N-二甲基乙-l-铵氯化物和N-(溴甲基)-2-氟-N,N-二甲基乙-1-铵氯化物。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述组合物与选自以下的第二试剂组合：Omega 3油、水杨酸、二甲基丁醇、大蒜油、橄榄油、磷虾油、Co酶Q-10、益生菌、益生元、饮食纤维、洋车前子壳、铋盐、植物甾醇、葡萄籽油、绿茶提取物、维生素D、抗氧化剂、姜黄、姜黄素和白藜芦醇。

8.根据权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述个体的血液、血浆、血清或尿液以及它们的组合中TMAO水平升高。