CN104569389B - 一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒。本发明所述试剂盒包括转印有经电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白的印迹膜。本发明采用免疫印迹法检测幽门螺杆菌感染者血清中包括致病因子细胞毒(CagA)、空泡毒(VacA)和尿素酶亚单位A和B抗体等多种Hp抗体，依据HP抗体不同确定感染的HP是否产毒株，进而判断患者所感染Hp菌株血清学类型。本发明所述试剂盒仅需要待检者提供血清，属于非侵入性检查，患者依从性较好，而且检测快速，整个时间仅需2小时，样品需求量小，仅需10微升被检血清，特异性强，敏感性高，适用范围广，便于在各级医院、卫生部门推广使用。

Description

一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒
本申请为申请日为2012年11月26日，申请号为201210486563.7，发明创造名称为“一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori)，简称HP，1983年由澳大利亚学者Barry Marshall和Robin Warren首次从胃粘膜组织分离得到。经过各国学者多年的研究证实，Hp在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等消化道疾病致病中起重要作用。HP的发现是胃肠病学史上一个革命性进展，2005年Robin Warren和Barry Marshall因此获得诺贝尔医学奖。
HP与胃十二指肠疾病的关系，一直是各国学者研究的主要课题。大量的流行病学调查证实，自然人群中HP感染率相当高，HP在全球人群的感染率超过50％，而且随着年龄的增加有递增趋势，而且感染情况与致病性因地域不同有很大差异，不同国家和地区分离的HP菌株基因结构呈现人群或地区性差异，因此HP致病差异性已引起人们重视。较多的研究表明HP的致病性主要与菌型差异、感染的年龄及机体的反应性、地域性、饮食习惯等有关。
目前临床上按照是否表达致病因子细胞毒素蛋白(CagA)和空泡毒素蛋白(VacA)将HP分为两型：I型为产细胞毒素的HP，CagA和VacA均表达或有任一表达，其致病力强，易引起胃部疾病；II型为不产细胞毒素的HP，CagA和VacA均不表达，其毒性较弱，感染后一般无明显临床症状。所以临床上不能仅限于检出HP，进一步HP分型检测对临床消化道疾病的诊断和治疗具有重要的参考价值。
根据国际最新的Maastricht-III共识意见和我国幽门螺杆菌诊治共识意见(2007)，检测Hp感染的方法有侵入性和非侵入性两类。侵入性方法依赖胃镜活检，包括快速尿素酶试验(RUT)、胃黏膜直接涂片染色镜检、胃黏膜组织切片染色镜检(如WS银染、改良Giemsa染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色)、细菌培养、基因检测方法、免疫快速尿素酶试验(IRUT)。而非侵入性检测方法不依赖内镜检查，包括13C或14C-尿素呼气试验(UBT)、粪便Hp抗原(HpSA)检测(依检测抗体可分为单抗和多抗两类)、血清和分泌物(唾液、尿液等)抗体检测、基因芯片和蛋白芯片检测等。由于侵入性方法采样需借助胃镜检查，许多患者不愿接受，因而受限制，难以作为大样本进行流行病学调查。而非侵入性方法，患者依从性较好，因而有其实际意义。然而以上的检测方法仅限于检出是否有HP感染，均不能对HP分型。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中检测HP仅能检出是否有HP感染而不能对HP分型进行分型的缺陷，提供一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒，包括转印有经电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白的印迹膜。
患者感染幽门螺杆菌后血清中会产生相应抗体，而且由于所感染的幽门螺杆菌类型不同，因此所产生的抗体类型也不同。本发明采用免疫印迹法，将待检样品与本发明所述转印有经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白的印迹膜反应，待检样品中的抗体就会与印迹膜中蛋白抗原结合，然后经过酶联免疫反应出现显色区带，据此判断出待检样品中所含HP抗体类型，进而对患者所感染的HP进行分型。
其中，本发明所述印迹膜的制备方法为取HP全菌体蛋白用样品缓冲液稀释，利用SDS-聚丙稀酰胺凝胶梯度不连续电泳将各种蛋白组分按分子量大小分开，然后利用湿转法将HP全菌体蛋白由凝胶层中转移到硝酸纤维素膜上即得。
作为优选，本发明所述试剂盒还括酶标记抗体和酶底物。
在本发明中，所述酶标记抗体为酶标记的抗人IgG抗体。
作为优选，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
作为优选，本发明所述试剂盒还包括洗涤液、阳性对照、阴性对照、标准带中的一种或几种。
在本发明中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
在本发明中，所述阳性对照为HP细胞毒素蛋白抗体、HP空泡毒素蛋白抗体和尿素酶抗体的混合溶液。
在本发明中，所述阴性对照为正常人HP抗体阴性血清。
在本发明中，所述标准带为标示HP细胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始线的相对位置的条带。
从上述的技术方案可以看出，本发明所述幽门螺杆菌分型检测的试剂盒包括转印有经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白的印迹膜。本发明采用免疫印迹法检测幽门螺杆菌感染者血清中包括致病因子细胞毒(CagA)、空泡毒(VacA)和尿素酶亚单位A和B抗体等多种Hp抗体，依据HP抗体不同确定感染的HP是否产毒株，进而判断患者所感染Hp菌株血清学类型，确定感染的HP是否产毒株，进而根据不同类型HP与慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌的关系，实施对HP更合理的根治方法，对临床开展HP针对性治疗有重要的指导意义。本发明所述试剂盒仅需要待检者提供血清，属于非侵入性检查，患者依从性较好，而且检测快速，整个时间仅需2小时，样品需求量小，仅需10微升被检血清，特异性强，敏感性高，适用范围广，便于在各级医院、卫生部门推广使用。
附图说明
图1示本发明所述试剂盒标准带示意图；
图2示不同幽门螺杆菌感染型检测结果示意图；其中1号膜为无效实验，2号膜为阴性对照，3号膜为II型HP感染，4号膜为I型HP感染。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒，包括转印有经电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白的印迹膜。
患者感染幽门螺杆菌后血清中会产生相应抗体，而且由于所感染的幽门螺杆菌类型不同，因此所产生的抗体类型也不同。本发明采用免疫印迹法，将待检样品与本发明所述转印有经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白的印迹膜反应，待检样品中的抗体就会与印迹膜中蛋白抗原结合，然后经过酶联免疫反应出现显色区带，据此判断出待检样品中所含HP抗体类型，进而对患者所感染的HP进行分型。如CagA抗体仅见于I型HP感染，VacA抗体仅见于I型HP感染，UreA抗体I型HP感染和II型HP感染均可出现，UreB抗体I型HP感染和II型HP感染均可出现。因此只要观察印迹膜上是否存在CagA抗体或VacA抗体即可对患者所感染的HP进行分型。
本发明所述印迹膜是幽门螺杆菌全菌体蛋白经电泳分离后转印到固相支持物上。
本发明所述幽门螺杆菌全菌体蛋白可以为幽门螺杆菌全菌的粗提物，也可以为幽门螺杆菌全菌经过一定的分离纯化后的全菌蛋白。
电泳分离通常是根据目的蛋白的性质，如分子量、分子大小、电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离。其中为了提高转移的效率优选为SDS-聚丙稀酰胺凝胶梯度不连续电泳。不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品(即使是稀样品)在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度(或一定浓度梯度)的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。
其中，所述样品缓冲液是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的蛋白上样缓冲液，常用于常规的SDS-PAGE蛋白样品的上样。所述样品缓冲液具体配置方法可参照《蛋白质技术手册》。
经电泳分离后的蛋白往往需要再利用电泳方法将分离的蛋白质转移到固体载体上。常用的转移方法有半干转法和湿转法。半干转法是凝胶和固体载体被夹在用缓冲液浸湿的滤纸之间，通电时间为10分钟～30分钟。而湿转法是凝胶和固体载体夹心浸放在转移缓冲液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。作为优选，本发明所述转移方法为湿转法。
转印蛋白质的固相支持物可以为硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜。硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes，NC)是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法。NC膜的使用也很简便，不需要甲醛预处理，很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。PVDF膜(Polyvinylidene-Fluoride，聚偏二氟乙烯)在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能，而且PVDF膜更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的。然而PVDF膜需要100％甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡。尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹。尼龙膜结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高、无法直接染色。作为优选，本发明所述固相支持物为硝酸纤维素膜。
因此在一个具体实施方式中，所述印迹膜的制备方法为取HP全菌体蛋白用样品缓冲液稀释，利用SDS-聚丙稀酰胺凝胶梯度不连续电泳将各种蛋白组分按分子量大小分开，然后利用湿转法将HP全菌体蛋白由凝胶层中转移到硝酸纤维素膜上即得。
在进行幽门螺杆菌分型检测时，将待检样品与印迹膜反应后，待检样品中的抗体就会与印迹膜中蛋白抗原结合。在本发明中，所述待检样品可以为血清或全血。为了识别待检样品中的抗体，需要能够识别待检样品中抗体的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如酶标记抗体。酶标记抗体是酶与抗体在交联剂作用下联结的产物，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用。同时为了保证酶促反应的发生还需要标记抗体的酶底物，其与第二抗体标记的酶反应后有特定的颜色且固定在固体支持物上，通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出待检样品中的抗体的位置。因此，本发明所述试剂盒还包括酶标记抗体和酶底物。
其中，在本发明中，所述酶标记抗体为酶标记的抗人IgG抗体。其中，所述酶优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在本发明中，所述酶底物为标记抗人IgG抗体的酶的底物。
不同的酶选用不同的底物。如碱性磷酸酶的底物为对硝基苯磷酸二钠(PNPP-NA2)；辣根过氧化物酶的底物为鲁米诺或其衍生物，所述鲁米诺衍生物包括但不限于异鲁米诺、4—氨基已基-N一乙基异鲁诺、及N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺(AHEI)和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
作为优选，本发明所述试剂盒还可以包括洗涤液、阳性对照、阴性对照、标准带中的一种或几种。
在本发明中，洗涤液为能够去掉抗原抗体间非特异性结合的液体，例如磷酸盐缓冲液(PBS溶液)或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。作为优选，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。进一步的，为了更好的洗涤，所述洗涤液还可以同时还含有吐温-20，吐温-20的浓度优选为0.1-1％，更选为0.5％。
在本发明中，所述阳性对照为HP细胞毒素蛋白抗体、HP空泡毒素蛋白抗体和尿素酶抗体的混合溶液。
在本发明中，所述阴性对照为正常人HP抗体阴性血清。
在本发明中，所述标准带为标示HP细胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始线的相对位置的条带。依据标准带可以快速判断印迹膜上显色区带，据此判断出待检样品中所含HP抗体类型，进而对患者所感染的HP进行分型。标准带的制备方法为根据幽门螺杆菌全菌体蛋白各阳性区带、质控带距起始线的距离用电脑模拟出标准带，用A6铜版纸彩色打印或印刷即得。如图1所示。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒进行详细说明。
实施例1：幽门螺杆菌(HP)印迹膜制备
一、HP全菌体蛋白电泳分离
1、配置样品缓冲液：用加样枪吸取0.05M pH7.4 Tris-HCL 10mL，2-巯基乙醇0.5mL，甘油2mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，10％十二烷基硫酸钠2mL，混合均匀即得。
2、将HP全菌体蛋白用样品缓冲液稀到0.04±0.005mg/mL，经100℃、3分钟处理后，置4℃冷却备用。
3、梯度不连续电泳
3.1、制备分离胶：量取40％丙烯酰胺4mL、40％甲叉－双丙烯酰胺0.1mL、pH9.2 0.5M Tris-HCL 5mL、DW 5mL、TEMED(四甲基乙二胺)50μL、1％过硫酸铵5mL、H2O 12.5mL。
3.2灌胶:用量筒量取30±0.5mL，移液液器吸取1mL正丁醇，加到胶液上面密闭待凝固。
3.3待分离胶凝固后(20±2分钟)，用纯净水冲去正丁醇加入浓缩胶。
3.4制备浓缩胶：量取40％丙烯酰胺1mL、40％甲叉-双丙烯酰胺0.1mLpH9.2 0.5M Tris-HCL 2mL、DW 3mL、TEMED 20μL、1％过硫酸铵0.5mL混合均匀。
3.5灌胶:用移液器吸取4±0.1mL，吸取1mL正丁醇，加到胶液上面密闭待凝固。
3.6待浓缩胶凝固后(20±2分钟)，用纯净水冲去正丁醇。
3.7电泳：将浓缩胶置入垂直电泳槽，注入电泳缓冲液(pH9.2 0.5MTris-HCL)，用微量移液器加入用样品缓冲液稀释的HP抗原样品液1mL，在4±0.1mA/cm的电流下电泳，时间为180±10分钟。
二、HP全菌体蛋白转印
1、硝酸纤维膜的处理：将硝酸纤维膜放在蒸馏水中浸泡30±5分钟，然后将硝酸纤维膜放在转印缓冲液(pH8.4 0.2M Tris-甘氨酸)中浸泡，浸泡时间：60±5分钟。
2、铺膜：先铺阳极滤纸3±1层，然后将硝酸纤维膜与滤纸上沿对齐，保证误差在±2mm，之后铺分离胶，分离胶与硝酸纤维膜上沿距离5±1mm，最后再铺阴极滤纸3±1层。
3、转印：加入转印缓冲液500±10mL，在500±50mA的电流下，转印60±5分钟。
4、印迹膜制备与贮存：专用切膜机切割印迹膜长98±2mm，宽150±5mm，在2-8℃贮存。
实施例2：本发明所述试剂盒
一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒，包括实施例1制得的印迹膜，每张长98±2mm，宽150±5mm。
实施例3：本发明所述试剂盒
一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒，包括实施例1制得的印迹膜、酶标记抗体和酶底物，具体如表1所示。
表1幽门螺杆菌分型检测的试剂盒
实施例4：本发明所述试剂盒
一种幽门螺杆菌分型检测的试剂盒，包括实施例1制得的印迹膜、酶标记抗体、酶底物、浓缩洗涤液、阳性对照、阴性对照、标准带和说明书，具体如表2所示。
表2幽门螺杆菌分型检测的试剂盒
实施例5：本发明所述试剂盒检测幽门螺杆菌
实验材料：待测血清或全血10μL。待测样品宜用新鲜血清或全血，血清一般可用静脉取血，待凝固后离心取得。即时检测可手指采血，用全血检测。采得的血清或全血如当天不检测，应置4℃保存；超过七天以上，需置-20℃以下保存。
实验方法：
1、使用镊子将所需数量的印迹膜放到反应槽中，加入1×洗涤液1mL和待检样品10μL，置摇床上室温(20～37℃)摇动30min或置37℃温箱30min；
2、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入1×洗涤液1mL，洗涤1min弃去反应槽液体，反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干液体；
3、在反应槽中加入1×洗涤液0.5mL和酶标记抗体10μL，置摇床上室温(20～37℃)摇动30min或置37℃温箱30min；
4、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入1×洗涤液1mL，洗涤1min弃去反应槽液体，反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干液体；
5、在反应槽中加入酶底物0.5mL，在摇床上摇动5±2min，显色；
6、待质控带和阳性区带显色清晰后，倒掉槽中液体，用流水(自来水或蒸馏水)冲洗3次以终止反应，取出印迹膜条，置吸水纸上，待干后与标准带对照判断结果，不同抗体位置大小见表3；
表3不同抗体位置大小
7、结果判断：将印迹膜上起始线与标准带起始线对齐，观察阳性显色区带与对应的标准带位置即可判断显色区带是何种抗体。不同幽门螺杆菌感染型检测结果如图2所示。
实施例6：本发明所述幽门螺杆菌分型检测试剂盒准确性
评价本发明所述幽门螺杆菌分型检测试剂盒检测Hp菌株特性，并与Genelabs安速TMHp快速检测试剂盒比较其检测Hp的准确性。
实验方法：研究对象为2012年5月-7月就诊于北京大学第一医院、卫生部北京医院、上海仁济医院、沈阳盛京医院、北京军区总医院及南昌大学第一附属医院的患者，既往1年内接受过胃镜检查的十二指肠溃疡和慢性胃炎的患者，13C-尿素呼气试验阳性即认为存在Hp现症感染者，同时进行Genelabs安速TMHp快速检测试剂盒及本发明实施例4所述试剂盒检测，并以13C-尿素呼气试验阴性者作为阴性对照。检测结果见表4。
表4不同检测方法的检测Hp菌株感染的结果
进一步应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。以13C-尿素呼气试验作为诊断的金标准，计算本发明所述试剂盒和胶体金法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确度，结果见表5。
表5：本发明所述试剂盒和13C-尿素呼气试验检测371例患者Hp结果比较
13C-尿素呼气试验(+) 13C-尿素呼气试验(－) 合计
免疫印迹法(+) 257 9 266
免疫印迹法(－) 5 100 105
合计 262 109 371
本发明所述幽门螺杆菌分型检测试剂盒检测Hp感染的敏感度为98.1％，特异度为91.7％，阳性预测值为96.6％，阴性预测值为95.2％，准确度为96.2％。Genelabs安速TMHp快速检测试剂盒敏感度87.0％，特异度96.3％，阳性预测值98.2％，阴性预测值75.5％，准确度89.7％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种幽门螺杆菌分型检测的方法，其特征在于，待测样品与印迹膜进行酶联免疫反应，然后与阳性对照、阴性对照及标准带比较；其中所述印迹膜转印有经电泳分离的幽门螺杆菌全菌体蛋白；所述酶联免疫反应中的酶为辣根过氧化物酶，酶底物为3,3`,5,5`-四甲基联苯胺。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述印迹膜的制备方法为取HP全菌体蛋白用样品缓冲液稀释，利用SDS-聚丙稀酰胺凝胶梯度不连续电泳将各种蛋白组分按分子量大小分开，然后利用湿转法将HP全菌体蛋白由凝胶层中转移到固体支持物上即得。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述酶联免疫反应具体包括如下步骤：
步骤a、待测样品与洗涤液混合后滴加到印迹膜上孵育；
步骤b、洗涤液洗涤印迹膜；
步骤c、酶标记抗体与洗涤液混合后滴加到印迹膜上孵育；
步骤d、洗涤液洗涤印迹膜；
步骤e、将酶底物滴加到印迹膜上显色，水洗终止反应。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述酶标记抗体为酶标记的抗人IgG抗体。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述阳性对照为HP细胞毒素蛋白抗体、HP空泡毒素蛋白抗体和尿素酶抗体的混合溶液。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述阴性对照为正常人HP抗体阴性血清。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述标准带为标示HP细胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始线的相对位置的条带。
9.根据权利要求1任意一项所述方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
步骤1、使用镊子将所需数量的印迹膜放到反应槽中，加入1×洗涤液1mL和待检样品10μL，置摇床上室温摇动30min或置37℃温箱30min；
步骤2、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入1×洗涤液1mL，洗涤1min弃去反应槽液体，反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干液体；
步骤3、在反应槽中加入1×洗涤液0.5mL和酶标记抗体10μL，置摇床上室温摇动30min或置37℃温箱30min；
步骤4、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入1×洗涤液1mL，洗涤1min弃去反应槽液体，反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干液体；
步骤5、在反应槽中加入酶底物0.5mL，在摇床上摇动5±2min，显色；
步骤6、待质控带和阳性区带显色清晰后，倒掉槽中液体，用自来水或蒸馏水冲洗3次以终止反应，取出印迹膜条，置吸水纸上，待干后与标准带对照判断结果。
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