CN1140257A

CN1140257A - 一种人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体体外检测剂盒

Info

Publication number: CN1140257A
Application number: CN 95108003
Authority: CN
Inventors: 陈晶晶; 张健中; 蒋秀高
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 1995-07-06
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 1997-01-15

Abstract

本发明涉及一种人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体(IgG)体外检测试剂盒，它由Hp尿素酶抗原包被酶标反应板，封闭液，血清样品稀释液，阴性血清对照，标准血清对照，洗涤液，酶标抗体，显色剂A液，显色剂B液，终止液及使用说明书等组成，其优点是：简便——仅需取血分离血清即可进行检测；适应性强——适合大量和小量样本的检测；稳定在4℃环境可保存半年以上；特异——临床应用特异性达98％；敏感——适合于检查多种Hp菌型的感染，敏感性达96％，是目前诊断Hp菌感染、抗菌治疗后疗效观察和进行Hp感染流行病学调查最简便可靠的定量性检查方法。

Description

一种人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体体外检测试剂盒

本发明涉及一种人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体(IgG)体外检测试剂盒。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)引起的慢性胃炎及消化性溃疡对我国人民身体健康造成了巨大危害。我国人群Hp菌感染率达50％左右。以往诊断Hp感染常用胃粘膜组织病理组织学检查、胃粘膜组织Hp菌培养和采用¹³C、¹⁴C呼吸试验及¹⁴N排泄试验。病理组织学检查及细菌培养除要求较高的试验条件外，尚要以接受胃镜检查为前提，不能被广泛应用，复查时更不易被病人接受；呼吸试验和尿素排泄试验虽具有灵敏和特异的特点，但因价格昂贵，不利于临床上推广普及。八十年代末，国内建立了Hp血清抗体检测方法，但因采用Hp全菌抗原、Hp全菌超声破碎抗原、酸提取抗原和高分子量相关抗原等，明显存在因交叉反应所造成的假阳性和因菌株间抗原性差异而造成的假阴性，可靠性较差，以至某些临床单位出现对胃炎及消化性溃疡病人不经进一步诊断而盲目开展抗Hp菌治疗的趋势。本发明旨在为临床诊断Hp感染、开展抗Hp感染治疗后的随访及Hp感染的流行病学调查提供一种简便、特意和敏感的试剂药盒。

本发明的设计是由封闭液，血清样品稀释液，阴性血清对照，标准血清对照，洗涤液，酶标抗体，显色剂A液，显色剂B液，终止液及使用说明书组成。

一.Hp尿素酶抗原包被酶标反应板由Hp尿素酶抗原和酶标反应板组成。

(一).Hp尿素酶抗原的制备：

1.菌株选择：选择国内外不同地区Hp分离株110余株，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察尿素酶抗原表达差异及应用免疫印迹分析(Western blots)方法观察抗原性差异，并结合酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选各地尿素酶抗原代表株10余株，供制备试剂盒用抗原用。

2、菌株选择及细菌培养：将选择出的幽门螺杆菌菌株，经过系统鉴定后分别接种于含10％脱纤维羊血的布氏琼脂平皿中，置混合气体(5％O₂，10％CO₂和85％N₂)环境，37℃培养三天后收菌。

3、细菌破碎及预处理：将收集的Hp菌用生理盐水洗涤一遍后，用凝胶过滤脱洗液(0.05aM Tris-HCl，pH8.0，含0.005％的硫柳汞)将菌稀释至适当浓度(约14亿菌/ml)，经超声破碎(在冰浴下进行)后，高速离心(12000rpm，30′)后取上清备用。

4、凝胶过滤过程及脱洗峰尿素酶活性检测：凝胶过滤介质选用Sephadex G200(粒度40-120um，由Pharmacia公司生产)，柱型为2.6×75cm，整个凝胶过滤过程在2201 COMBICOLDRAC II型凝胶过滤成套设备(LKB公司生产)中进行，每次抗原上柱量15-30ml，脱洗液采用0.05M Tris-HCl，pH8.0，脱洗速度为16滴/分，收集、检测及记录系统均为自动进行，每收集管收集50滴，每隔5管测定一次尿素酶活性，尿素酶试剂由本实验室配制。

5、尿素酶提纯效果分析：将凝胶过滤后尿素酶活性峰成分进行聚丙烯酰胺凝胶观察尿素酶提纯效果。SDS-PAGE按参考文献进行，浓缩胶采用5％浓度，分离胶采用11％浓度，电泳采用Tris-甘氨酸缓冲系统，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色，收集高纯度部分备用。

6、纯化尿素酶成分抗原性Western blot分析：将纯化的尿素酶成分，经SDS-PAGE后用电泳将各蛋白转移到硝酸纤维膜(简称NC膜)上，NC膜经5％脱脂奶粉封闭过夜后，放入1∶50稀释的兔抗Hp抗血清中，室温震荡2小时，用0.05％Tween20-TBS洗NC三次膜后，浸泡NC膜于1∶200稀释的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)中，室温震荡2小时，用Tween20-TBS洗NC三次膜后，用底物显色液(6mg 4-氯-1--萘酚溶于2ml冷甲醇，与含6ul 30％H₂O₂的10mlTBS混合)浸泡待检NC膜，室温震荡10-30分钟，观察其抗原性，将抗原性良好的尿素酶成分用于试剂盒用抗原。

7、抗原混合：将不同菌株来源的尿素酶抗原按相同比例混合使用。

(二)、酶标反应板的选择及规格：采用市售酶标反应板，规格包括40孔板，96孔板，8孔条和12孔条等。

(三)、包被工艺：每孔包被混合幽门螺杆菌尿素酶抗原10-50ug，经防腐处理后备用。二、封闭液：0.5％明胶溶液(用pH7.4的PBST溶液稀释)三、血清样品稀释液：为pH7.4的PBS溶液。四、阴性血清对照：为阴性血清原液。五、标准血清对照：为标准血清原液。六、洗涤液：每百毫升含NaCl29.22g，吐温-200.5ml七、酶标抗体：为HRP-SPA溶液。八、显色剂A液：每百毫升含Na₂HPO₄.12H₂O 3.682g

柠檬酸 1.02g

过氧化氢尿素 0.06g九、显色剂B液：每百毫升含柠檬酸 0.105g

EDTA 0.015g

TMB 25mg

二甲基亚砜 0.5ml十、终止液：为2N的硫酸溶液

其操作步骤：

1.包被板每孔加入封闭液200ul(或6滴)，置37℃30分钟后，用蒸馏水洗板3次，每次放置片刻。

2.用血清样品稀释液将待检血清、阴性血清对照和标准血清对照分别稀释至待检稀释度(可根据需要作1∶80-640稀释)，每孔加入100ul，置37℃30分钟后，用蒸馏水洗板3次，每次放置片刻。

3.每孔加入酶标抗体2滴，置37℃30分钟后，用蒸馏水洗板3次，每次放置片刻。

4.将显色剂A液和显色剂B液各50ul(或1滴)加至每反应孔中，室温避光显色10-20分钟。

5.每孔加入终止液50ul(或1滴)终止反应。

6.肉眼观察：颜色深于或等于标准阳性对照者为阳性，颜色浅于标准阳性对照者为阴性。仪器测定：以酶标仪450nm波长测定各孔OD值，OD值大于或等于标准阳性对照者为阳性，OD值小于标准阳性对照者为阴性。当标准阳性对照OD值大于或等于0.2时，若阴性对照OD值小于0.1则试剂盒有效。

本发明的优点和积极效果是：简便——仅需取血分离血清即可进行检测，无需特殊设备，无需接受胃镜检查；适应性强——适合大量和小量样本的检测；稳定—在4℃环境可保存半年以上；特异——与弯曲菌属细菌及常见细菌感染间无交叉反应，临床应用特异性达98％；敏感——适合于检查多种Hp菌型的感染，临床应用敏感性达96％。用本发明药盒临床诊断Hp菌相关性慢性胃炎和消化性溃疡的准确率达96-98％，高于目前其它血清Hp抗体检测方法。是目前诊断Hp菌相关性慢性胃炎和消化性溃疡、进行Hp感染抗菌治疗后疗效观察和进行Hp感染流行病学调查最简便可靠的定量性检查方法。

Claims

1.一种人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体(IgG)体外检测试剂盒，其特征是它由Hp尿素酶抗原包被酶标反应板，封闭液，血清样品稀释液，阴性血清对照，标准血清对照，洗涤液，酶标抗体，显色剂A液，显色剂B液，终止液及使用说明书组成。

2.按照权利要求1所说的试剂盒，其特征是Hp尿素酶抗原的制备包括以下步骤：

1).菌株选择：选择国内外不同地区Hp分离株110余株，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察尿素酶抗原表达差异及应用免疫印迹分析(Western blots)方法观察抗原性差异，并结合酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选各地尿素酶抗原代表株10余株，供制备试剂盒用抗原用。

2).菌株选择及细菌培养：将选择出的幽门螺杆菌菌株，经过系统鉴定后分别接种于含10％脱纤维羊血的布氏琼脂平皿中，置混合气体(5％O₂，10％CO₂和85％N₂)环境，37℃培养三天后收菌。

3).细菌破碎及预处理：将收集的Hp菌用生理盐水洗涤一遍后，用凝胶过滤脱洗液(0.05M Tris-HCl，pH8.0，含0.005％的硫柳汞)将菌稀释至适当浓度(约14亿菌/ml)，经超声破碎(在冰浴下进行)后，高速离心(12000rpm，30′)后取上清备用。

4).凝胶过滤过程及脱洗峰尿素酶活性检测：凝胶过滤介质选用Sephadex G200(粒度40-120um，由Pharmacia公司生产)，柱型为2.6×75cm，整个凝胶过滤过程在2201 COMBICOLDRAC II型凝胶过滤成套设备(LKB公司生产)中进行，每次抗原上柱量15-30ml，脱洗液采用0.05M Tris-HCl，pH8.0，脱洗速度为16滴/分，收集、检测及记录系统均为自动进行，每收集管收集50滴，每隔5管测定一次尿素酶活性，尿素酶试剂由本实验室配制。

5).尿素酶提纯效果分析：将凝胶过滤后尿素酶活性峰成分进行聚丙烯酰胺凝胶观察尿素酶提纯效果。SDS-PAGE按参考文献进行，浓缩胶采用5％浓度，分离胶采用11％浓度，电泳采用Tris-甘氨酸缓冲系统，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色，收集高纯度部分备用。

6).纯化尿素酶成分抗原性Western blot分析：将纯化的尿素酶成分，经SDS-PAGE后用电泳将各蛋白转移到硝酸纤维膜(简称NC膜)上，NC膜经5％脱脂奶粉封闭过夜后，放入1∶50稀释的兔抗Hp抗血清中，室温震荡2小时，用0.05％Tween20-TBS洗NC三次膜后，浸泡NC膜于1∶200稀释的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)中，室温震荡2小时，用Tween20-TBS洗NC三次膜后，用底物显色液(6mg 4-氯-1--萘酚溶于2ml冷甲醇，与含6ul 30％H₂O₂的10mlTBS混合)浸泡待检NC膜，室温震荡10-30分钟，观察其抗原性，将抗原性良好的尿素酶成分用于试剂盒用抗原。

7)抗原混合：将不同菌株来源的尿素酶抗原按相同比例混合使用。

3.按照权利要求1所说的试剂盒，其特征是Hp尿素酶抗原包被酶标反应板的包被工艺：每孔包被混合幽门螺杆菌尿素酶抗原10-50ug，经防腐处理后备用。

4.按照权利要求1所说的试剂盒，其特征是操作步骤包括：

1).包被板每孔加入封闭液200ul(或6滴)，置37℃30分钟后，用蒸馏水洗板3次，每次放置片刻。

2).用血清样品稀释液将待检血清、阴性血清对照和标准血清对照分别稀释至待检稀释度(可根据需要作1∶80-640稀释)，每孔加入100ul，置37℃30分钟后，用蒸馏水洗板3次，每次放置片刻。

3).每孔加入酶标抗体2滴，置37℃30分钟后，用蒸馏水洗板3次，每次放置片刻。

4).将显色剂A液和显色剂B液各50ul(或1滴)加至每反应孔中，室温避光显色10-20分钟。

5).每孔加入终止液50ul(或1滴)终止反应。

6).肉眼观察：颜色深于或等于标准阳性对照者为阳性，颜色浅于标准阳性对照者为阴性。仪器测定：以酶标仪450nm波长测定各孔OD值，OD值大于或等于标准阳性对照者为阳性，OD值小于标准阳性对照者为阴性。当标准阳性对照OD值大于或等于0.2时，若阴性对照OD值小于0.1则试剂盒有效。