SU1767435A1 - Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области медицины , предназначено дл  серологической диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза) в иммуноферментном анализе. Цель - упрощение способа за счет экспресс-диагностики. В исследуемой сыворотке крови определ ют антитела к общему дл  рода протеиновому антигену роде Gersinia и при значении реакции, превышающем средние значени  обследовани  практически здоровых лиц на удвоенное среднее квадратичное отклонение, диагностируют заболевание. За положительные принимают значени  реакции в ЕД ИФА более 235,4. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к медицине, предназначено дл  серологической диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза ) в иммуноферментном анализе.

Целью изобретени   вл етс  упрощение диагностики за счет экспресс-диагностики .

Способ осуществл ют следующим образом .

Дл  получени  протеинового антигена, свободно секретируемого в культуральную среду, используют любую культуру патогенных иерсиний, в частности y.pseudotu- berculorls 01. Вирулентность возбудител  контролируют в тесте аутоагглютинабельнс- сти или по плазмидному спектру (наличие Са -зависимой плазмиды вирулентности). Суточную культуру с агара Хоттингера (рН 7,0-7,4) пересевают в бульон Хоттингера в соотношении 1:40, содержащий 20 мМ/л хлорида магни . Дл  создани  оптимальных условий синтеза протеинового антигена, ассоциированного с плазмидой вирулентности , предварительно бульон Хоттингера обрабатывают оксалатом натри  (20 мМ/л) с целью удалени  ионов Са . Через 12-16 ч бактериальные клетки удал ют центрифугированием (7000 д, 4°С , 20 мин). Дл  осаждени  продуцируемого в среду протеинового антигена в супернатант добавл ют сульфат аммони  из расчета 40 гр на 10 мл. Далее, через 8-12 ч инкубации при температуре 4°С, центрифугированием собирают коричнево-желтый осадок протеинового антигена . Полученный антиген диализуют в течение 2 сут против водопроводной воды и сутки против дистиллированной воды.

Постановку ИФА осуществл ют в стандартном непр мом варианте. Первоначально готов т рабочее разведение протеинового антигена - 12,5-25,0 мкг/мл (по белку) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере (рН 8,0-9,0). Сенсибилизацию полистироловых планшет протеиновым антигеном провод т в течение 16 часов при 4°С. После инкубации планшеты тщательно отсл

с

х|

О

XJ

N

СО СЯ

мывают от несв завшегос  антигена забу- ференным физиологическим раствором (ЗФР) с 0,05% твином-20. Затем в парные лунки полистироловых планшет внос т исследуемые образцы сыворотки крови в раз- ведении 1:400 (скрининг-титр) в ЗФР с 0,05% твином-20 по 100 мкл. Инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч. После отмывки несв завшихс  нтител ЗФР-ром с твином в л чки внос т конЗюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченных пе- роксидазой в рабочем разведении и оставл ют при 37°С еще на 1 ч. После отмывки планшет в лунки внос т субстратную смесь, состо щую из 10 мг орто-фенилендиамина, 0,35 мл 3% перекиси водорода на 25 мл цитратного буфера (ph 5,0). Через 10 минут ферментативную реакцию останавливают добавлением 10% раствора серной кислоты по 50 мкл в лунку. Учет реакции провод т на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм, предварит ел ьно выставив бланк на приборе. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА), рассчитываемых по формуле (Бюлл. ВОЗ, 1985):

ЕД ИФА - , иДо

где ОДх - средн   оптическа  плотность лунок с исследуемы: i образцом;

ОД0- средн   оптическа  плотность лунок с пулом донорских сывороток.

Дл  учета уровн  попул ционного иммунитета , при выработке контрольных показателей , предварительно провод т обследование не менее 30 практически здоровых лиц, проживающих на территории, где проводитс  исследование.

При анализе сывороток крови больных за положительные принимаютс  показате- ли (в ЕД ИФА), превышающие значени  контрол  на удвоенное среднее квадра- тическое отклонение (И.В.Пол ков и соавт. Практическое пособие по медицинской статистике , Л., 1975).

Поскольку протеиновый антиген впервые использовали дл  определени  специфических антител в иммуноферментном анализе, предварительно был проведен р д модельных опытов по оптимизации условий реакции. Дозу сенсибилизации полистирола подбирали экспериментально в диапазоне концентраций протеинового антигена 100,0-50,0-25,0-12,5-6,25-3,12 мкг(по белку ) на 1 мл буфера. В качестве комплексую- щих буферов испытаны карбонат-бикар- бонатный (рН 8,0-9,0-10,0) и фосфатный (рН 7,0). Первоначальное разведение протеинового антигена (100 мкг/мл) титровали в 2-х

кратном интервале до конечной концентрации 3,12 мкг/мл комплексующего о/фера. Сенсибилизацию полистирола проводили протеиновым антигеном в концентрации от 3,12 до 100,0 мкг/мл в течение 16 часов при 4°С и при значении рН буфера 7,0-8,0- 9,0-10,0. После инкубации планшеты тщательно отмывали и в каждую лунку вносили по 100 мкл кроличьей антисыворотки к в разведении 1:400 (скрининг-титр). После добавлени  конъюгата и про влени  реакцию учитывали на вертикальном фотометре МР- 590 Dynatech, Результаты выражали в единицах ИФА по отношению оптической плотности лучок с гипериммунной сывороткой к оптической плотности пула 10 кроличьих неиммунных сывороток. Дл  учета возможных погрешностей измерени  дл  каждой концентрации протеинового антигена и рН буфера проводились исследовани  по 8 лункам, рассчитывалась средн   арифметическа  и ее ошибка.

Показано, что увеличение сенсибилизирующей концентрации протеинового антигена от 3,12 до 12,5 мкг/мл буфера приводило к повышению чувствительности тест-системы, котора  в последующем оставалась примерно на одном уровне независимо от роста концентрации антигена.

Изучение зависимости чувствительности тест-системы от рН комплексующего буфера вы вило, что наиболее высокие результаты соответствуют рН 8,0-9,0 (808- 898), что достоверно выше, чем при значени х рН 7,0 и 10,0, при одинаковой сенсибилизирующей концентрации антигена .

Таким образом, наилучшие услови , обеспечивающие максимальную чувствительность тест-системы на основе протеинового антигена наблюдались при дозе сенсибилизации 12,5 и более мкг/мл карбо- нат-бикарбонатного буфера рН 8,0-9,0.

Все дальнейшие исследовани  и клинические испытани  диагностической системы проводили с учетом выбранных оптимальных условий сенсибилизации, т.е. концентрации антигена 12,5 мкг/мл на кар- бонат-бикарбонатном комплексующем буфере , рН 8,0.

Специфичность и чувствительность тест-системы в отношении антител к иерси- ни м других серотипов, оценивали путем исследовани  комерческих агглютинирующих сывороток против бруцели, сальмонелл , шигелл, нормальной кроличьей сыворотки, а также кроличьих антисывороток к Y.pseudotuberculorls I, III, IV; lenterocolltica 0,3,05.27,09. Антииерсиниоз- j-fbie сыворотки были получены в лаборатории сапронозоь ЦНЙИ Э Ш СССР после трехкратной и,,.,низации животных культурами иерсиний, инактивированными 50% раствором спирта. Активность полученных сывороток контролировали в реакции имму- нодиффузии в геле.

За диагностически значимь-е принимали показатели оптической плотности лунок с антисывороткой, превышающие не менее чем в 2 раза значени  оптической плотное л лунок с нормальной кроличьей сывороткой в одинаковых разведени х. Из представленных данных видно, что диагностическа  система вы вл ла антитела по всех антисыворотках к иерсини м, независимо от вида и серотипа иерсиний в титрах 1:6400 - 1:25600. Положительных результатов при испытании антисывороток к другим энтеро- бактери м в разведении 1:200 (минимальное разведение) и выше обнаружено не было.

Таким образом, в предварительных опытах было показано что при выбранных услови х сенсибилизации антигена на твердой фазе тест-система обладает специфичностью по отношению к антииерсиниозным антителам и достаточно чувствительна (1:6400-1:25600).

Клинические испытани  предложенного способа проводились на базе серологиче- ской лаборатории и диагностического отделени  инфекционной больницы Ns 1 г. Иркутска с сент бр  1989 г по май 1990 г. За это врем  были исследованы сыворотки крови 256 больных, направленных на обследование и лечение в ГИБ № 1 с подозрением на иерсиниоз и псевдотуберкулез. Возраст больных варьировал на иерсиниоз и псевдотуберкулез . Возраст больных варьировал от 15 до 69 лет, из них женщин было 148, мужчин - 108. Диагноз иерсиниоза или псевдотуберкулеза был подтвержден у 78 из 256 обследуемых больных на основании кли- нико-эпидемиологических данных и результатов бактериологического исследовани , Причем, псевдотуберкулез, вызванный 1 се- ротипом возбудител , вы влен у 49 больных , иерсиниоз, вызванный 03 серотипом - у 5,05.27серотипом-у4и09-у 12 человек. У остальных 178 больных (втора  группа) оказались инфекционные заболевани  неи- ерсиниозной этилогии (вирусный гепатит А - 54 человека, вирусный гепатит В - 24, сальмонеллез - 14, трихинеллез - 12, пищевые токсико-инфекции -11, бруцеллез - 11, остра  дизентери  - 10, острые респира- торно-вирусные инфекции - 10, ангина - 7, клещевой сыпной тиф Северной Азии № 6, брюшной тиф - 6, корь - 4, клещевой энце-, фалит - 4, хронический гепатит - 3, серозный менингит- 1, лекарственна  болезнь - 1). Исследовани  сывороток на антитела к иерсини м проводились п обеих группах на 2-4 неделе заболевани  как с использованием прототипа, так и предлагаемого способа (табл 1).

Сравнительна  оценка эффективности прототипа и разработанного способа диагностики иерсиниозов показаны в таблице .

Как видно из приведенных данных, пу тем известного способа диагностики (прото- тип) специфические антитела были обнаружены в диагностическом уровне у 62

из 78 больных иерсиниозами (79,5±4,6%) и у 18 больных с другими заболевани ми (10,1 ±2,2%) втом числе у 5 больных бруцеллезом . Положительные результаты реакции с сывороткой крови больных бруцеллезом

служат подтверждением известного факта существовани  в высокой степени тождественных детерминант полиполисахаридов иерсиний серотипа 09 и различных видов бруцелл, что определ ет ложноположительные реакции.

При использовании разработанного способа эффективность диагностики, т.е. процент подтверждени  диагноза в группе больных иерсиниозами был несколько выше (84,б±4,2%), хот  статистически разли- чи  недостоверны, р 0,1. Положительные реакции в группе больных с другими инфек- ционными заболевани ми составили 7,9±2,0% (р 0,1), в том числе только у

одного больного бруцеллезом. Таким образом, предлагаемый способ диагностики иерсиниозов не уступает rtdэффективности прототипу и позвол ет ТлоД- твердить диагноз у 84,6% больных

иерсиниозами (иерсиниозом и псевдотуберкулезом )., Пример 1. Готов т рабочее разведе- ние протеинового антигена - 12,5 кмг/мп (по белку) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном

буфере, рН 8,0. Сенсибилизацию планшет, протеиновым антигеном провод т в течение 16 ч при 4°С. После инкубации планшеты тщательно отмывают от несв завшегос  антигена забуференным физиологическим

раствором с твином-20. Затем в 8 лунок полистироловых планшет внос т гипериммунную кроличью сыворотку к 1. Сыворотку получают путем внутривенной 3-х кратной иммунизацией животных спиртовым антигеном . Сыворотку внос т в разведении 1:400 по 100 мкл в лунку. В качестве контрол  в парные лунки внос т пул из 10 нормаль- ных кроличьих сывороток в том же разведении. Инкубируют в течение 1 часа

при температуре 37°С. После отмывки не- св  завшихс  антител в лунки внос т конъю- гат антител к иммуноглобулинам человека, меченных пероксидазой в рабочем разведении и оставл ют при 37°С еще на час. После отмывки планшет в лунки внос т субстратную смесь, состо щую из 10 мг ортофени- лендиамина, 0,35 мл 3% перекиси водорода и 25 мл цитратного буфера (рН 5,0), Через 10 минут реакцию останавливают добавлением 10% раствора серной кислоты по 50 мкл в лунку. Учет реакции провод т на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА, которые рассчитываютс  как отношение оптической плотности лунки с гипериммунной кроличьей сывороткой к средней (по двум лункам) оптической плотности лунок с пулом неиммунной кроличьей сыворотки, умноженное на 100. Поданным 8 измерений вычисл ют среднюю арифметическую и ее ошибку, которые составл ют ЕД ИФА. Это достоверно выше, чем при дозе сенсибилизации 6,25 мкг/мл (530±36) и при рН комплексующегос  буфера 7,0 (537 ±46) и 10,0 (644±47).

Основное преимущество разработанного способа заключаетс  в уменьшении трудоемкости исследовани . Так, при использовании традиционного способа диагностики иерсиниозов (прототипа) 256 исследуемых сывороток последовательно анализировали на наличие антител к типо- специфическим антигенам каждого из 8 известных возбудителей заболевани . Всего было проведено 2048 исследований с общей затратой времени 16-20 ч. Проведение работы потребовало использова0

5

0

5

0

5

ни  45 планшет дл  иммунологических реакций (одноразовых), 224 мг хромогена - ортофенилендиамина и 560 мл конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулинам человека .

Применение предлагаемого способа с использованием одной тест-системы, вы вл ющей антитела к иерсини м независимо от вида и серотипа возбудител , позвол ет сократить в 8 раз объем исследований, врем  анализа, расход реактивов и полистироловых планшет без ущерба дл  эффективности диагностики. Кроме этого, сокращение времени проведени  анализа уменьшает длительность контактировани  с хромогеном-ортофенилендиамином, который  вл етс  потенциальным канцерогеном , что также  вл етс  положительной стороной предлагаемого способа.

Изобретение может найти применение в производстве диагностических препаратов , в лабораторной диагностике иерсиниозов , в научно-исследовательской работе.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов путем иммобилизации антигена на полистирол микрокамер дл  иммунологических реакций с последующим вы влением антител с помощью ферментной метки, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  способа, дл  иммобилизации на полистирол используют протеиновый антиген микробов рода Gersinia в концентрации 12,5 мкг/мл на карбонатном буфере рН 8,0-9,0 и при повышении специфических антител по сравнению со здоровыми лицами диагностируют иерсиниоз.