CN104561252A - 鉴定虫草的环介导等温扩增方法和试剂盒 - Google Patents

鉴定虫草的环介导等温扩增方法和试剂盒 Download PDF

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CN104561252A CN201310516361.7A CN201310516361A CN104561252A CN 104561252 A CN104561252 A CN 104561252A CN 201310516361 A CN201310516361 A CN 201310516361A CN 104561252 A CN104561252 A CN 104561252A
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Abstract

本申请涉及鉴定虫草的环介导等温扩增方法、试剂盒及其应用。特别涉及利用针对欲鉴定虫草样品的特异DNA所设计的引物来鉴定该虫草样品是真冬虫夏草还是假冬虫夏草。

Description

鉴定虫草的环介导等温扩增方法和试剂盒
技术领域
本申请涉及虫草的鉴定方法和试剂盒及其应用，尤其涉及冬虫夏草的鉴定方法与试剂盒及其应用。
背景技术
冬虫夏草（Cordyceps sinensis），又名中华虫草，是中国传统的名贵中药材，是由肉座菌目、麦角菌科、虫草属的冬虫夏草菌，寄生于高山草甸土中的蝠蛾幼虫，使幼虫身躯僵化直至其死亡。经过一个冬天，到第二年春天来临，霉菌菌丝开始生长，到夏天时长出地面，由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成，即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核（幼虫尸体）构成的复合体。冬虫夏草主要产于中国青海、西藏、四川、云南、甘肃和贵州等省及自治区的高寒地带和雪山草原。
真正的冬虫夏草均为野生，生长在海拔3000米至5000米的高山草地灌木带上面的雪线附近的草坡上。由于冬虫夏草具有极高的药用和营养价值，而真正野生的冬虫夏草产量小，供不应求，其商业价值不断增长。为确保真正的冬虫夏草药用品质和商业价值，对真正的冬虫夏草的鉴定是非常重要的。
冬虫夏草通常含有虫草酸约7%，碳水化合物约28.9%，脂肪约8.4%，蛋白质约25%，脂肪中82.2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、生物碱等。目前还没有发现冬虫夏草中含有特异的化合物能够作为特异化学标志物来对其进行鉴定，因此至今未发现可以采用化学的方法来鉴定冬虫夏草。基于多聚酶链式反应(PCR)开发的鉴定方法因需要热循环仪和电泳仪等设备而使得鉴定成本提高，同时实验过程费时耗力，也有待进一步改进。
发明内容
第一方面，本申请提供一种鉴定虫草的环介导等温扩增（LAMP）方法，包括，
提取欲鉴定虫草样品的DNA，作为DNA模板，
提供用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis或C.sinensis）的特异序列而设计的，
将所述引物与DNA模板与接触，在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增，
确定所述扩增产物或副产物的存在，例如通过肉眼或荧光或紫外光照射观察所述产物或副产物，或通过核酸染料溴化乙錠、SYBR Green、EvaGreen、GelRed等在自然光线下和(或)紫外光线下观察所述扩增产物。如果存在所述的产物或副产物，所鉴定的虫草样品即为冬虫夏草。
在一些实施方案中，如果所述方法得到的产物或副产物不存在，所述方法则进一步包括将所述DNA模板与针对假冬虫夏草的特异序列的引物接触，从而鉴定所述虫草样品为假冬虫夏草，在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii或C.gunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris或C.militaris）。
第二方面，提供一种利用环介导等温扩增方法鉴定虫草的试剂盒，其包含用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis或）的特异序列而设计的。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括针对假冬虫夏草的特异序列的引物。在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordycepsgunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris）。在一些实施方案中，所述试剂盒用于实施第一方面所述的方法。
附图说明
图1显示了利用内部控制引物对冬虫夏草（C.sinensis）、古尼虫草（C.gunnii）和蛹虫草（C.militaris）DNA样品进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。
图2显示了利用针对冬虫夏草特异序列所设计的引物对冬虫夏草样品(T2973,T2975和T2996)、古尼虫草样品(T2983和T2984)和蛹虫草样品(T3004)DNA进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。
图3显示了利用针对古尼虫草特异序列所设计的引物对古尼虫草样品(T2983和T2984)、冬虫夏草样品(T2973,T2975和T2996)和蛹虫草样品(T3004)DNA进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。
图4显示了利用针对蛹虫草特异序列所设计的引物对蛹虫草样品(T3004)、冬虫夏草样品(T2973,T2975和T2996)和古尼虫草样品(T2983和T2984)DNA进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。
图5显示利用内部控制引物对冬虫夏草(T2973,T2975和T2996)、古尼虫草(T2983和T2984)和蛹虫草(T3004)样品DNA进行环介导等温扩增（LAMP）、以及利用针对冬虫夏草特异序列所设计的引物对冬虫夏草(T2973,T2975和T2996)DNA样品进行环介导等温扩增后得到的DNA，通过用溴乙非啶标记的1%凝胶电泳的结果。其中M为100bp的DNA梯状分子标志，并指示了800bp所处的位置。
图6显示显示了利用针对古尼虫草特异序列所设计的引物对古尼虫草(T2983和T2984)DNA样品进行环介导等温扩增、以及利用针对蛹虫草特异序列所设计的引物对蛹虫草(T3004)DNA样品进行环介导等温扩增后得到的DNA，通过用溴乙非啶标记的1%凝胶电泳的结果。其中M为100bp的DNA梯状分子标志，并指示了800bp所处的位置。
图7显示了上述环介导等温扩增增后，通过核酸染料在自然光线下和紫外光线下所观察到的结果。
图1-7中所示“neg”为阴性对照。
图8为LAMP引物设计的示意图。
具体实施方式
第一方面，本申请提供一种鉴定虫草的环介导等温扩增方法，包括，
提取欲鉴定虫草样品的DNA，作为DNA模板，
提供用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的特异序列而设计的，
将所述引物与DNA模板与接触，在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增，
确定所述扩增产物或副产物的存在，例如通过肉眼或荧光或紫外光照射观察所述产物或副产物，如果存在，所鉴定的虫草样品即为冬虫夏草。在一些实施方案中，所述副产物为焦磷酸镁沉淀，或者是通过核酸染料溴化乙錠、SYBR Green、EvaGreen、GelRed等在自然光线下和(或)紫外光线下观察所述扩增产物。
在一些实施方案中，如果所述方法得到的产物或副产物不存在，所述方法则进一步包括将所述DNA模板与针对假冬虫夏草的特异序列的引物接触，从而鉴定所述虫草样品为假冬虫夏草，在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii）或蛹虫草（Cordycepsmilitaris）。
在一些实施方案中，所述环介导等温扩增环介导等温扩增LAMP的引物是针对预鉴定的虫草特异序列中6个不同区域设计的4个引物，例如，如图8所示，针对所述特异序列3’端的F3、F2、B3、B2以及5’端的F1C、B1C、B2、B3等6个不同区域或位点设计4种引物。所述4种引物包括：（1）FIP：上游内部引物，由F1C区和F2区组成，F2区能与虫草特异序列的F2C互补或严紧杂交，F1C区与特异序列的F1C区序列相同；（2）F3引物：上游外部引物,由F3区组成，并能与虫草特异序列的F3C区互补或严紧杂交；（3）BIP：下游内部引物，由B1C区和B2区组成，B2区能与虫草特异序列的B2C互补或严紧杂交，B1C区与特异序列的B1C区序列相同；（4）B3引物：下游外部引物,由B3区组成，并与虫草特异序列的B3C区互补或严紧杂交。在一些实施方案中，还可以在环介导等温扩增反应体系中添加两条环状引物LF和LB，它们能够与反应中形成的茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。
在一些实施方案中，所述严紧杂交是高严紧杂交或极高严紧杂交。
当两个互补核酸分子相互间产生许多氢键时，发生核酸分子的杂交。杂交的严紧性能根据核酸所处的环境条件、杂交方法的特点及所用的核酸分子的成分和长度而变化。Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(分子克隆：试验手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,2001)和Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I,Chapter2(生物化学和分子生物学试验技术—核酸探针杂交，第一部分，第二章)(Elsevier,New York,1993)讨论了为达到特定程度的严紧性，所要求的杂交条件的计算。Tm是核酸分子的一条链的50%与其互补链杂交的温度。下文是一组示例性但非限制性的杂交条件：
极高严紧性(允许至少90%相同的序列杂交)
杂交：       5×SSC于65℃达16小时
洗涤两次：   2×SSC每次在室温(RT)达15分钟
洗涤两次：   0.5×SSC每次于65℃达20分钟
高严紧性(允许至少80%相同的序列杂交)
杂交：       5×-6×SSC于65℃-70℃16-20小时
洗涤两次：   2×SSC每次在室温(RT)达5-20分钟
洗涤两次：  1×SSC每次于55℃-70℃30分钟。
在一些实施方案中个，本申请公开的方法或试剂盒中的引物是在环介导等温扩增分析中允许扩增预鉴定虫草的特异核苷酸序列的适宜长度的寡核苷酸引物。单个引物通常包含约15bp至约70bp，更特别是约20bp至约60bp，或者20bp至约50bp，例如约20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、55bp或60bp。在一些实施方案中，所述的引物长度是SEQ ID NO:1-9中所列出的序列的长度。
术语“多核苷酸”和“核酸”指多重的由磷酸二酯键连接的核苷酸单位(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关的结构上的变体)组成的聚合物。多核苷酸和核酸包括RNA、DNA、合成形式和混合的聚合物、有义链和反义链、双链或单链，也可以是化学或生物学修饰的或者能包含非天然或衍生的核苷酸碱基，所述技术人员会容易认同这一点。这些修饰包括：例如，标记；甲基化；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；诸如不带电连接(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧基部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂、和修饰的连接(例如，α异头核酸等)的核苷酸间的修饰。还包括在通过氢键和其他化学相互作用结合指定序列的这一能力上模拟多核苷酸的合成分子。
本文所述虫草的“特异序列”指本申请公开的环介导等温扩增方法或试剂盒中所特异扩增的靶序列，或者是环介导的等温扩增方法或试剂盒中引物所针对的序列，或者说是指导引物设计的序列。在一些实施方案中，环介导等温扩增方法或试剂盒中的引物针对6个特异区域，即所述特异序列包含了这6个特异区域或由这6个特异区域组成。
在一些实施方案中，所述虫草的特异序列为虫草各自的延伸因子1（elongation factor1）序列、28S核糖体RNA序列或者rpb1序列。
在一些实施方案中，所述冬虫夏草的特异序列为SEQ ID NO:10(冬虫夏草的延伸因子)。
在一些实施方案中，针对冬虫夏草的特异序列引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，其中SEQ ID NO:1和SEQID NO:2为正向（上游）和反向（下游）外引物，SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6为正向（上游）内引物和反向（下游）内引物。
在一些实施方案中，古尼虫草的特异序列为SEQ ID NO:11(古尼虫草的延伸因子)。
在一些实施方案中，蛹虫草的特异序列为SEQ ID NO:12(蛹虫草的延伸因子)。
在一些实施方案中，针对古尼虫草的特异序列的引物为为SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为正向（上游）和反向（下游）外引物，SEQ ID NO:7和SEQID NO:8为正向（上游）内引物和反向（下游）内引物。
在一些实施方案中，针对蛹虫草的特异序列的引物为为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9，其中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2为正向（上游）和反向（下游）外引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9为正向（上游）内引物和反向（下游）内引物。
在一些实施方案中，所述扩增中的恒温为60-70℃，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70℃，或例如65、66、67、68℃
在一些实施方案中，所述方法中的恒温扩增进行至少10分钟，或至少20分钟、或至少30分钟、或至少40分钟、或至少50分钟，例如进行10-50分钟，进行10-40分钟、10-30分钟、10-20分钟，或者例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或80分钟。
在一些实施方案中，所述引物为针对冬虫夏草的特异序列的引物时，在所述方法中，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为65℃；或者，所述引物为针对古尼虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为68℃或者，所述引物为针对蛹虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为68℃。
在一些实施方案中，所述引物为针对冬虫夏草的特异序列的引物时，在所述方法中，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的时间为10-20分钟；或者，所述引物为针对古尼虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的时间为25-50分钟；或者，所述引物为针对蛹虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的时间为25-50分钟。
在一些实施方案中，所述引物为针对冬虫夏草的特异序列的引物时，在所述方法中，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为65℃，扩增的时间为10-20分钟；或者，所述引物为针对古尼虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为68℃，扩增的时间为25-50分钟；或者，所述引物为针对蛹虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为68℃，扩增的时间为25-50分钟。
优选地，上述恒温扩增时间为反应开始或反应产物达到饱和的时间。所述产物“饱和”是指，产物随反应时间的延长不再出现明显增加的现象。
在一些实施方案中，所述方法还包含对所提取的DNA样品进行质量控制的的步骤，所述步骤包括将DNA样品与虫草通用内部控制引物接触，并在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增。
在一些实施方案中，所述虫草通用内部控制引物为SEQ ID NO:1,SEQID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别为正向（上游）和反向（下游）外引物，SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4分别为为正向（上游）内引物和反向（下游）内引物。
在一些实施方案中，所述引物为虫草通用内部控制引物时，在所述方法中，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为67℃。
在一些实施方案中，所述引物为虫草通用内部控制引物时，在所述方法中，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的时间为15-55分钟或者20-50分钟。
在一些实施方案中，所述引物为虫草通用内部控制引物时，在所述方法中，所述引物与DNA模板接触、恒温扩增的温度为67℃，扩增的时间为20-50分钟。
第二方面，提供一种利用环介导等温扩增方法鉴定虫草的试剂盒，其包含用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草的特异序列而设计的。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括针对假冬虫夏草的特异序列的引物。在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordycepsgunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris）。
在一些实施方案中，所述冬虫夏草的特异序列为SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中，针对冬虫夏草的特异序列引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，古尼虫草的特异序列为SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中，针对古尼虫草的特异序列的引物为为SEQ IDNO:1, SEQ ID NO:2，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8。
在一些实施方案中，蛹虫草的特异序列为SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，针对蛹虫草的特异序列的引物为为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，所述试剂盒被设计用于实施第一方面所述的方法。
在本申请所公开的方法和试剂盒的一些实施方案中，根据本申请公开的冬虫夏草的特异序列、古尼虫草的特异序列以及蛹虫草的特异序列而设计的鉴定这些特异序列的引物还如下表1所示：
在本说明书的全部的描述和权利要求书中，除非上下文要求，单数形式包括复数形式。具体地，当使用不定冠词和定冠词时，术语“a”、“an”、“the”包括复数以及单数所指物，除非上下文另已清楚指明。
在本发明具体的方面、实施方案或实施例中描述的特性、整体、特征、化合物、序列或其片段应理解为应用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例
1.环介导的等温扩增（LAMP）
利用等温Mastermix扩增试剂盒（Isothermal Mastermixamplification kit，OptiGene公司,UK)并按照试剂盒说明书进行以下实施例中的环介导等温扩增实验。环介导等温扩增的结果通过荧光分析仪II检测仪(OptiGene公司,UK)进行实时分析。
2.虫草样品DNA提取
取虫草样品，利用DNA提取试剂盒(广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒,北京博迈德科技发展有限公司)提取DNA。从中随机挑选冬虫夏草(T2973,T2975和T2996)，古尼虫草(T2983和T2984)和蛹虫草(T3004)样品进行以下实施例1-5的实验。
3.实验中所用引物
检测冬虫夏草（C.sinensis）、古尼虫草（C.gunnii）和蛹虫草（C.militaris）的特异引物如表2所示：
其中，L10-F3-d（SEQ ID NO:1）、L10-B3-d（SEQ ID NO:2）分别为通用的正向（上游）和反向（下游）外引物，其不仅能够用于内部控制的分析中，而且还能够用于冬虫夏草（C.sinensis）、古尼虫草（C.gunnii）和蛹虫草(C.militaris)的特异检测中；L10-FIP-d（SEQ IDNO:3）和L10-BIP-d（SEQ ID NO:4）分别为通用的正向（上游）和反向（下游）内引物，仅用于内部控制的分析中；L10-FIP-S-sinensis-d（SEQ ID NO:5）和L10-BIP-S-sinensis-d（SEQ ID NO:6）是用于冬虫夏草特异检测的正向（上游）内引物和反向（下游）内引物；L10-FIP-S-假虫草-a（SEQ ID NO:7）为假冬虫夏草通用的正向（上游）内引物，可用于古尼虫草和蛹虫草的特异检测中；L10-BIP-S-gunnii-a（SEQ ID NO:8）是用于古尼虫草特异检测的反向（下游）内引物，L10-BIP-S-militaris-a（SEQ ID NO:9）是用于蛹虫草特异检测的反向（下游）内引物。
实施例1内部控制实验
通过LAMP，利用内部控制引物（internal control）对C.sinensis、C.gunnii和C.militaris进行检测以确定所提取的DNA样品的质量是否满足LAMP分析的要求。
具体而言，依据等温Mastermix扩增试剂盒（Isothermal Mastermixamplification kit，OptiGene公司,UK)，取2μl DNA样品，加入内部控制引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、在67℃进行20min至50min的反应。
检测结果如图1以及图5左半部分内部控制的泳道所示。可见，样品最早在20分钟开始反应，并在几分钟之内反应达到饱和，反应最慢的也在50分钟左右达到饱和。由此证明，DNA样品可以用于LAMP的分析。
实施例2冬虫夏草的LAMP鉴定
依据等温Mastermix扩增试剂盒（Isothermal Mastermixamplification kit，OptiGene公司,UK)，取2μl DNA样品，加入引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、在65℃进行10min至20min的反应。检测结果如图2以及图5右半部分“特异性LAMP:冬虫夏草”内的三个泳道所示。可见，样品最早在10分钟开始反应，并在几分钟之内反应达到饱和，反应最慢的也在15-20分钟左右达到饱和。
实施例3古尼虫草的LAMP鉴定
依据等温Mastermix扩增试剂盒（Isothermal Mastermixamplification kit，OptiGene公司,UK)，取2μl DNA样品，加入引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8，在68℃进行25min至50min的反应。检测结果如图3以及图6左半部分“特异LAMP：古尼虫草”泳道所示。可见，样品最早在25分钟开始反应，并在几分钟之内反应达到饱和，反应最慢的也在50分钟左右达到饱和。
实施例4蛹虫草的LAMP鉴定
依据等温Mastermix扩增试剂盒（Isothermal Mastermixamplification kit，OptiGene公司,UK)，取2μl DNA样品，加入引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9，在68℃进行40min至50min的反应。检测结果如图4以及图6右半部分“特异LAMP：蛹虫草”泳道所示。可见，样品最早在40分钟开始反应，并在几分钟之内反应达到饱和。
实施例5普通光线和紫外光下的观察结果
将上述实施例1-4的反应物加入核酸染料(溴化乙錠、SYBRGreen I、EvaGreen、GelRed)放在普通光线和紫外光（Gel DocumentationSystem,Biorad）下，所观察的到的结果如图7所示。
实施例6
选取随机挑选其它的冬虫夏草、古尼虫草和蛹虫草样品重复进行以上实施例1-5的实验，得到了类似的实验结果，其中针对冬虫夏草的反应时间大致相同，而对于古尼虫草和蛹虫草，其反应时间和达到饱和的时间有一定的缩短。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的任何变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种鉴定虫草的环介导等温扩增方法，包括，
提取欲鉴定虫草样品的DNA，作为DNA模板，
提供用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的特异序列而设计的，
将所述引物与DNA模板与接触，在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增，
确定所述扩增产物或副产物的存在，例如通过肉眼或荧光或紫外光照射观察所述产物或副产物，所述副产物例如是焦磷酸镁沉淀;或通过核酸染料溴化乙錠、SYBR Green、EvaGreen、GelRed等在自然光线下和(或)紫外光线下所观察所述扩增产物,其中如果存在所述产物或副产物，所鉴定的虫草样品即为冬虫夏草。
2.权利要求1所述的方法，其中如果所述产物或副产物为阴性，所述方法则进一步包括将所述DNA模板与针对假冬虫夏草的特异序列的引物接触，从而鉴定所述虫草样品为假冬虫夏草，所述假冬虫夏草例如，古尼虫草（Cordyceps gunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris）。
3.权利要求1所述的方法，其中所述冬虫夏草的特异序列为SEQID NO:10。
4.权利要求1所述的方法，其中针对冬虫夏草的特异序列的引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
5.权利要求2所述的方法，其中古尼虫草的特异序列为SEQ IDNO:11；蛹虫草的特异序列为SEQ ID NO:12。
6.权利要求2所述的方法，其中针对古尼虫草的特异序列的引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；可选择地，针对蛹虫草的特异序列的引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQID NO:7和SEQ ID NO:9。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，所述恒温为60-70℃，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70℃，或例如65、66、67、68℃。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，所述恒温扩增进行至少10分钟，或至少20分钟、或至少30分钟、或至少40分钟、或至少50分钟，例如进行10-50分钟，进行10-40分钟、10-30分钟、10-20分钟，或者例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或80分钟。
9.权利要求7所述的方法，其中所述引物为针对冬虫夏草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板与接触恒温扩增的温度为65℃；或者
所述引物为针对古尼虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板与接触恒温扩增的温度为68℃；或者
所述引物为针对蛹虫草的特异序列的引物时，所述引物与DNA模板与接触恒温扩增的温度为68℃。
10.权利要求1-9任一项所述的方法，还包含对所提取的DNA样品进行质量控制的步骤，所述步骤包括将DNA样品与虫草通用内部控制引物接触，并在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增。
11.权利要求1-10所述的方法，其中所述虫草通用内部控制引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
12.一种利用环介导等温扩增方法鉴定虫草的试剂盒，包含
用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草的特异序列而设计的。
13.权利要求12所述的试剂盒，还包括针对假冬虫夏草的特异序列的引物，所述假冬虫夏草例如，古尼虫草（Cordyceps gunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris）。
14.权利要求12所述的试剂盒，其中所述冬虫夏草的特异序列为SEQ ID NO:10。
15.权利要求12所述的试剂盒，其中针对冬虫夏草特异序列的引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
16.权利要求13所述的试剂盒，其中古尼虫草的特异序列为SEQID NO:11；蛹虫草的特异序列为SEQ ID NO:12。
17.权利要求13所述的试剂盒，其中针对古尼虫草的特异序列的引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；针对蛹虫草的特异序列的引物为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:9。
18.权利要求12所述的试剂盒，其用于实施权利要求1-11任一项所述的方法。
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