CN104548101A - 一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其特征在于，所述免疫增强剂为溶液，包括溶质和溶剂，其中，所述溶液为氯化钠水溶液；所述溶质为Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的混合物。发明还提供该免疫增强剂的制备方法和应用。发明所述的免疫增强剂能够诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA，提高哺乳动物的乳汁中所含IgA的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫增强剂，尤其涉及一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂及其制备方法和应用。
背景技术
哺乳动物的乳汁是未成年哺乳动物主要的能量来源及营养来源，乳汁中含有的各种免疫球蛋白是未成年动物在免疫系统成熟前抵御各种病原微生物侵害的主要物质，如果母源免疫球蛋白不足或低下，则未成年哺乳动物尤其是出生后1-20天内的幼畜抵抗外界病原微生物的能力会急剧下降，幼畜为了抵御外界病原侵染致使其未成熟的免疫器官负担加重，同时也会造成其他器官发育迟缓，最终导致发育不良。经济养殖类哺乳动物如猪、牛、鹿等其幼崽在断奶前抵御病原的能力主要由母乳提供，而母乳产生的免疫球蛋白主要来源于家畜养殖过程中疫苗免疫接种。对于可以造成系统性疾病的病原来讲，当幼崽哺乳母乳后，乳汁中所含的IgG可以随血液游走至全身各器官以抵御病原微生物的侵害；对于专门损害胃肠道的病原则需要乳汁中IgA的介入才能有效抵御病原的侵入。
黏膜免疫与系统免疫属于免疫系统的不同应答方式，这种应答方式的不同最终导致了免疫系统产生免疫球蛋白种类的不同，如通过肌肉注射既可以引起系统免疫也可以引起黏膜免疫，但通过肌肉注射方式产生的系统免疫要强于黏膜免疫，表现在血液或乳汁中的IgG含量远高于IgA，而通过黏膜免疫产生的效果则反之。这是由于通过不同的免疫方式导致活化淋巴细胞归巢的部位不同所决定的。
因此，急需研究一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，以达到提高哺乳动物的乳汁中所含IgA的含量的目的。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，该免疫增强剂能够诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA，提高哺乳动物的乳汁中所含IgA的含量。
本发明的目的之二在于提供一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂的应用。
实现本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到：
一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其特征在于，所述免疫增强剂为溶液，包括溶质和溶剂，其中，所述溶液为质量百分数为0.7-1％的氯化钠水溶液；所述溶质为Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的混合物；
所述Toll样受体激动剂为TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR10激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂和TLR13激动剂中的一种或者两种以上的组合，所述Toll样受体激动剂的浓度为2-20ug/ml；
所述细胞粘附剂为PEG、卡波姆、PVP、环糊精、琼脂中的一种或者两种以上的组合，所述细胞粘附剂的浓度为0.01-1克/100毫升；
所述上皮细胞粘附因子为ICAM-1、ICAM-2中的一种或者两种的组合，所述上皮细胞粘附因子的浓度为0.001-0.01ug/ml；
所述促淋巴细胞归巢因子为CCL1至CCL25(即CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25)中的一种或两种以上的组合，所述促淋巴细胞归巢因子的浓度为0.001-0.01ug/ml。
作为优选，所述Toll样受体激动剂为TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7的组合，浓度为10-20ug/ml；所述细胞粘附剂为海藻酸钠、PVP的组合，浓度为0.5-1g/100ml；所述上皮细胞粘附因子为ICAM-2，浓度为0.005-0.01ug/ml；所述促淋巴细胞归巢因子为CCL9、CCL10的组合，浓度为0.003-0.01ug/ml。
作为优选，所述Toll样受体激动剂为TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7的组合，浓度为10ug/ml；所述细胞粘附剂为海藻酸钠、PVP的组合，浓度为0.5g/100ml；所述上皮细胞粘附因子为ICAM-2，浓度为0.005ug/ml；所述促淋巴细胞归巢因子为CCL9、CCL10的组合，浓度为0.003ug/ml。
作为优选，所述氯化钠水溶液为质量百分数为0.9％的无菌氯化钠水溶液。
一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂的制备方法,其特征在于，按照以下步骤进行：按照配方量秤取好氯化钠水溶液，往氯化钠水溶液中加入配方量的细胞粘附剂，待细胞粘附剂溶解后，再加入配方量的Toll样受体激动剂、上皮细胞粘附因子、促淋巴细胞归巢因子，搅拌至溶解，即得产品。
作为优选，所述搅拌的转速为100-500r/min。
一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂在制备疫苗中的应用。
作为优选，所述疫苗的制备方法为：将免疫增强剂加入至抗原溶液内，免疫增强剂与抗原溶液的体积比为1:1，磁力搅拌器进行搅拌，形成均匀的悬浊液，即得。
作为优选，所述抗原溶液中的抗原为多肽、蛋白或病毒粒子。
作为优选，所述抗原溶液中的抗原为猪流行性腹泻病毒。
本发明的有益效果在于：
本发明以Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的混合物作为溶质，通过对它们的组合及用量的优化，得到一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，该免疫增强剂能够诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA，大大的提高哺乳动物的乳汁中所含IgA的含量。此外，该免疫增强剂的制备方法简单、易操作。
具体实施方式
下面通过具体实施例和较佳实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不局限于以下的实施例。
本发明的所有实施例中，所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂的制备方法,按照以下步骤进行：按照配方量秤取好质量百分数为0.9％的氯化钠水溶液，往氯化钠水溶液中加入配方量的细胞粘附剂，待细胞粘附剂溶解后，再加入配方量的Toll样受体激动剂、上皮细胞粘附因子、促淋巴细胞归巢因子，搅拌至溶解,即得产品。所述搅拌的转速为200r/min。
所述免疫增强剂为溶液，包括溶质和溶剂，其中，所述溶液为氯化钠水溶液；所述溶质为Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的混合物；
所述Toll样受体激动剂为TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR10激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂和TLR13激动剂中的一种或者两种以上的组合，所述Toll样受体激动剂的浓度为2-20ug/ml；
所述细胞粘附剂为PEG、卡波姆、PVP、环糊精、琼脂中的一种或者两种以上的组合，所述细胞粘附剂的浓度为0.01-1克/100毫升；
所述上皮细胞粘附因子为ICAM-1、ICAM-2中的一种或者两种的组合，所述上皮细胞粘附因子的浓度为0.001-0.01ug/ml；
所述促淋巴细胞归巢因子为CCL1至CCL25(即CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25)中的一种或两种以上的组合，所述促淋巴细胞归巢因子的浓度为0.001-0.01ug/ml。
实施例1-6：
所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其溶质中的Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的具体组分及用量见表1(其中Toll样受体激动剂、上皮细胞粘附因子、促淋巴细胞归巢因子的单位为μg/ml，细胞粘附剂的单位为克/100毫升，“--”表示不添加)：
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| TLR1 | -- | -- | -- | 5 | -- | -- |
| TLR2 | 2 | 0.5 | 5 | -- | -- | -- |
| TLR3 | 2 | 0.5 | 5 | -- | -- | -- |
| TLR4 | 3 | 0.5 | 5 | -- | -- | -- |
| TLR5 | -- | -- | -- | 4 | -- | -- |
| TLR6 | -- | -- | -- | 6 | -- | -- |
| TLR7 | 3 | 0.5 | 5 | -- | -- | -- |
| TLR8 | -- | -- | -- | -- | 2 | -- |
| TLR9 | -- | -- | -- | -- | 1 | -- |
| TLR10 | -- | -- | -- | -- | 1 | |
| TLR11 | -- | -- | -- | -- | -- | 0.6 |
| TLR12 | -- | -- | -- | -- | -- | 3 |
| TLR13 | -- | -- | -- | -- | -- | 0.4 |
| 海藻酸钠 | 0.2 | 0.3 | 0.5 | -- | -- | -- |
| PEG | -- | -- | -- | 0.1 | -- | -- |
| 卡波姆 | -- | -- | -- | -- | 0.1 | -- |
| PVP | 0.3 | 0.2 | 0.5 | -- | -- | -- |
| 环糊精 | -- | -- | -- | -- | 0.2 | -- |
| 琼脂 | -- | -- | -- | -- | -- | 0.3 |
| ICAM-1 | -- | -- | -- | 0.002 | 0.003 | 0.008 |
| ICAM-2 | 0.005 | 0.001 | 0.01 | 0.003 | -- | -- |
| CCL1 | -- | -- | -- | 0.002 | -- | -- |
| CCL2 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL3 | -- | -- | -- | 0.005 | -- | -- |
| CCL4 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL5 | -- | -- | -- | 0.003 | -- | -- |
| CCL6 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL7 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL8 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL9 | 0.001 | 0.0005 | 0.003 | -- | -- | -- |
| CCL10 | 0.002 | 0.0005 | 0.004 | -- | -- | -- |
| CCL11 | -- | -- | -- | -- | 0.007 | -- |
| CCL12 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL13 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL14 | -- | -- | -- | -- | 0.003 | -- |
| CCL15 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL16 | -- | -- | -- | -- | -- | 0.002 |
| CCL17 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL18 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL19 | -- | -- | -- | -- | -- | 0.003 |
| CCL20 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL21 | -- | -- | -- | -- | -- | 0.003 |
| CCL22 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL23 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL24 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| CCL25 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
实施例7-12：
所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其溶质中的Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的具体组分及用量见表2(其中Toll样受体激动剂、上皮细胞粘附因子、促淋巴细胞归巢因子的单位为μg/ml，细胞粘附剂的单位为克/100毫升，“--”表示不添加)：
表2
试验例：
猪流行性腹泻病毒免疫效果试验。试验用疫苗制作：抗原采用猪流行性腹泻病毒，该病毒采用专利申请号为“201410111066.8”的发明专利所公开的一种猪流行性腹泻病毒。
滴鼻组：将病毒滴度调整为TCID50＝107/ml，分别采用实施例1-12所得到的免疫增强剂，按照1:1的体积比将免疫增强剂加入至抗原溶液内，采用磁力搅拌器进行低速搅拌，形成均匀悬浊液即得疫苗。分别记为：滴鼻组1-12。
对照组：对照组包括对照滴鼻组和对照注射组，其中，对照滴鼻组的疫苗包括按体积比为1:1的白油佐剂与抗原溶液的混合液，每毫升病毒含量与滴鼻组相同。对照注射组包括按体积比为1:1的白油佐剂与抗原溶液的混合液，每毫升病毒含量与滴鼻组相同。
空白组：空白组为不做任何免疫处理的同期怀孕母猪。
疫苗免疫母猪及乳汁中IgA含量测定：
步骤A：动物选择：选择同期分娩的怀孕母猪60头，分为3组，每组20头；
步骤B：免疫时间：在产前40天和20天对怀孕母猪进行首次免疫及二次免疫；
步骤C：免疫方式：含有黏膜免疫增强剂的疫苗进行滴鼻免疫，含有白油佐剂的疫苗进行肌肉注射免疫，空白对照组不做任何免疫；
步骤D：母乳采集：母猪分娩后当天进行乳汁采样并保存，连续采集7天后对乳汁中IgA进行测定。
步骤E：IgA的测定：IgA的测定采用商品化的ELISA试剂盒测定，所用试剂盒为同一公司同一批次。
步骤F：结果分析见表3：
表3
从表3可以看出，经实施例1-12所得到的免疫增强剂制备的疫苗免疫乳汁中的IgA的含量明显高于对照组及空白组。其中，实施例1中疫苗免疫乳汁中的IgA的含量最高，效果最明显。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。12 -->
Claims (10)
1.一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其特征在于，所述免疫增强剂为溶液，包括溶质和溶剂，其中，所述溶液为质量百分数为0.7-1％的氯化钠水溶液；所述溶质为Toll样受体激动剂、细胞粘附剂、上皮细胞粘附因子和促淋巴细胞归巢因子的混合物；
所述Toll样受体激动剂为TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR10激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂和TLR13激动剂中的一种或者两种以上的组合，所述Toll样受体激动剂的浓度为2-20ug/ml；
所述细胞粘附剂为PEG、卡波姆、PVP、环糊精、琼脂中的一种或者两种以上的组合，所述细胞粘附剂的浓度为0.01-1克/100毫升；
所述上皮细胞粘附因子为ICAM-1、ICAM-2中的一种或者两种的组合，所述上皮细胞粘附因子的浓度为0.001-0.01ug/ml；
所述促淋巴细胞归巢因子为CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25中的一种或两种以上的组合，所述促淋巴细胞归巢因子的浓度为0.001-0.01ug/ml。
2.根据权利要求1所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其特征在于:所述Toll样受体激动剂为TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7的组合，浓度为10-20ug/ml；所述细胞粘附剂为海藻酸钠、PVP的组合，浓度为0.5-1g/100ml；所述上皮细胞粘附因子为ICAM-2，浓度为0.005-0.01ug/ml；所述促淋巴细胞归巢因子为CCL9、CCL10的组合，浓度为0.003-0.01ug/ml。
3.根据权利要求2所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其特征在于:所述Toll样受体激动剂为TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7的组合，浓度为10ug/ml；所述细胞粘附剂为海藻酸钠、PVP的组合，浓度为0.5g/100ml；所述上皮细胞粘附因子为ICAM-2，浓度为0.005ug/ml；所述促淋巴细胞归巢因子为CCL9、CCL10的组合，浓度为0.003ug/ml。
4.根据权利要求1所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂，其特征在于:所述氯化钠水溶液为质量百分数为0.9％的无菌氯化钠水溶液。
5.一种根据权利要求1所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂的制备方法,其特征在于，按照以下步骤进行：按照配方量秤取好氯化钠水溶液，往氯化钠水溶液中加入配方量的细胞粘附剂，待细胞粘附剂溶解后，再加入配方量的Toll样受体激动剂、上皮细胞粘附因子、促淋巴细胞归巢因子，搅拌至溶解，即得产品。
6.根据权利要求5所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂的制备方法，其特征在于:所述搅拌的转速为100-500r/min。
7.一种根据权利要求1所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂在制备疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂在制备疫苗中的应用，其特征在于：所述疫苗的制备方法为：将免疫增强剂加入至抗原溶液内，免疫增强剂与抗原溶液的体积比为1:1，进行搅拌，形成均匀的悬浊液，即得。
9.根据权利要求8所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂在制备疫苗中的应用，其特征在于：所述抗原溶液中的抗原为多肽、蛋白或病毒粒子。
10.根据权利要求9所述的诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂在制备疫苗中的应用，其特征在于：所述抗原溶液中的抗原为猪流行性腹泻病毒。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |