CN104547016A - 麻花秦艽醇提物抗缺氧的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麻花秦艽醇提物抗缺氧的新用途，通过观察小鼠在常压缺氧、亚硝酸钠中毒性化学缺氧、心肌缺氧和急性脑缺血性缺氧等多种缺氧模型中的存活时间，测定常压缺氧小鼠肝脏过氧化氢(CAT)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)含量，研究麻花秦艽醇提物的抗缺氧作用。结果表明,麻花秦艽醇提物具有能明显延长小鼠在各种缺氧条件下的存活时间，提高常压缺氧小鼠肝脏抗氧化酶活力，从而保护缺氧诱导的肝脏氧化应激损伤的作用，这说明麻花秦艽醇提物具有抗缺氧的作用。本发明提出了麻花秦艽醇提物在制备抗缺氧药物中的新用途，并且显示具有良好的临床应用前景。

Description

麻花秦艽醇提物抗缺氧的新用途

技术领域

本发明涉及常用藏药麻花秦艽的新用途，具体涉及麻花秦艽醇提物在制备抗缺氧药物中的应用。

背景技术

氧是人类及许多生物赖以生存的重要条件，当维持机体生命活动所需的氧气不能得到充足的供给或用氧障碍时，会导致机体的代谢、功能甚至形态结构发生异常改变。临床上很多疾病如心脏病、严重哮喘、一氧化碳中毒、窒息、麻醉和中毒等情况下都会引起机体缺氧或供氧不足；剧烈运动和超限量劳动时，氧消耗量超过了生理动员能力，也可造成相对氧供给不足；高原、潜水和航空等特殊环境更易发生缺氧。严重或长期缺氧会给机体带来严重危害，最终可导致机体心、脑等重要脏器由于能量供应不足而死亡。

长期缺氧是危害人体健康的重要隐患，因此，如何防止缺氧损伤一直以来都是急待解决的主要医学问题之一。目前防止缺氧损伤主要是通过药物来改善，可临床上有效的抗缺氧药物严重不足，具有抗缺氧的西药主要有乙酰唑胺、盐酸可乐定、地塞米松等，他们主要是通过改善缺氧造成的各种症状，如肺水肿、脑水肿等来治疗缺氧损伤，且都存在许多不同程度的副作用。近年来中药在抗缺氧方面的作用被人们所关注，具有良好的应用和开发前景。目前使用的中药有的分布局限、资源少、价格贵，有的效果不明显。

因此对于中药及其有效成分进行深层次的研究具有很大潜力。深入挖掘和研究具有抗缺氧活性的特色中药既有助于阐明中药抗缺氧作用的物质基础及作用机制，也有助于发现新型的具有抗缺氧作用的物质，进而挖掘、研发出具有真正抗缺氧作用的新型药物，将会产生重大的社会意义和社会价值。

并且近年来随着青藏铁路的通车，进藏游客的数量不断攀升，急性高原反应成为旅游业的一大障碍。同时，随着藏区经济建设的不断推进，越来越多的进藏工作的人群需要高原习服。此外，还有大量戎边的军人，常年生活在高海拔地区，迫切需要抗缺氧药物，辅助其尽快适应高原恶劣的极端气候。所以，以藏区特有的高原植物资源为依托，开发优质、高效的抗缺氧药物具有十分广阔的市场前景。

高原缺氧、寒冷和干旱的特殊环境为多种中药材的生长创造了特有环境，尤其是那些生长在海拔3000米以上的青藏高原植物，通过千百万年的进化选择，应具有特殊的基因支持，使其适应了高原缺氧、寒冷和干燥的气候环境，这种大自然生物进化的特殊产物可能对人体 耐缺氧、抗疲劳和寒冷有重要的医用价值，可望从中筛选出抗缺氧新药。基于上述思想，本发明人采用小鼠密闭缺氧模型从青藏高原特色植物中筛选具有抗缺氧活性的高原植物麻花秦艽，并通过4种不同的缺氧模型最后确定麻花秦艽醇提物具有显著抗缺氧作用，可应用于制备抗高原缺氧药物。

麻花秦艽(Gentiana straminea Maxim.)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属多年生草本植物，藏医称“解吉嘎保”，是我国重要的常用中藏药材资源之一，已有2000年的药用历史。主要分布于我国的西藏、四川、青海、甘肃、宁夏等地；生于山坡草地、河滩、灌丛、林缘、高山草甸，分布在海拔2000～5000m。以根和花入药，具有清热利胆、舒筋止痛之功效，用于治疗风湿性关节炎、肺结核、低热盗汗、黄疸型肝炎、二便不通、麻风、毒热、各种出血，外敷消肿。

现代研究亦表明，藏药麻花秦艽具有多种药理作用和临床应用价值，目前其药理活性研究主要在抗炎、保肝和保护胃黏膜等作用，尚未见关于其抗缺氧活性的研究报导。本发明涉及麻花秦艽醇提取物的抗缺氧新用途，和其在抗缺氧药物方面的应用，国内外尚没有报道，属于首创。

附图说明

图1为本发明所述的麻花秦艽醇提物获得方法的流程示意图。

发明内容

本发明为解决上述存在的问题提出了麻花秦艽醇提物抗缺氧的新用途。

为达到上述目的，本发明的采用如下技术方案：

制备麻花秦艽醇提物，包括以下步骤：首先将麻花秦艽根洗净晾干，粉碎；其次将95％的乙醇加入500ml浸泡1天，取上清液；取上清液后再将95％的乙醇加入500ml浸泡1天；最后加热回流1小时，抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩、干燥即为麻花秦艽醇提取物。

用上述技术方案制备的麻花秦艽醇提物应用在小鼠缺氧的实验环境下，能够延长小鼠的存活时间，说明麻花秦艽醇提物具有抗缺氧的作用，正是由于麻花秦艽醇提物的这个作用，它将在医药领域具有很好的应用前景。

具体实施方式

一、实验材料 

实验动物 昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄各半(西安交通大学动物实验中心提供)

试验药物 藏产麻花秦艽    购自藏医学院藏药厂

         盐酸普萘洛尔    山西省临汾健民制药厂

         亚硝酸钠                西安化学试剂厂(GB1266-77)

         盐酸异丙肾上腺素注射液 上海禾丰制药有限公司

实验仪器 722s可见分光光度计       上海精密科学仪器有限公司

         ZDQ-2121A微型漩涡混合仪 金坛市盛蓝仪器制造有限公司

         T-214电子天平 北京冀多利斯仪器系统有限公司

         移液枪 大龙医疗设备(上海)有限公司

         减压旋转蒸发仪Hei-VAPAdvantage.ML 德国海道尔夫(HeidolpH)

         数显鼓风干燥箱GZX-9030MBE    上海博迅实业有限公司医疗设备厂

         紫外分光光度计TU-1810DSPC    北京普析通用仪器有限责任公司

         摇摆式高速万能粉碎机DFY-200  温岭市林大机械有限公司

         台式离心机 上海安亭仪器厂制造

试剂 考马斯亮蓝蛋白定量测定参考试剂盒，过氧化氢酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA，总抗氧化能力(T-AOC)活力测定参考试剂盒(南京建成生物技术公司)

二、实验内容 

一)、麻花秦艽抗缺氧有效部位的筛选

1.实验目的：应用常压密闭缺氧模型筛选麻花秦艽抗缺氧有效部位。

2.麻花秦艽实验药物的制备：将麻花秦艽根洗净晾干，粉碎备用。

1)麻花秦艽水煎液的制备：按中药传统方法水煎，100g麻花秦艽粉碎物加蒸馏水1000ml(按照1:10)的比例浸泡1d，煎煮三次，每次加水1000ml，每次30分钟，收集水煎液，浓缩定容为100ml(1g/ml)，冷藏备用。

2)麻花秦艽水提醇沉液制备：100g麻花秦艽粉碎物加蒸馏水1000ml(按照1:10)的比例浸泡1d，煎煮三次，每次加水1000ml，每次30分钟，收集水煎液，，以2500～3000转/分钟离心20～30分钟，弃沉淀，浓缩定容为100ml，加95％乙醇静置24小时，抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇，定容100ml水提醇沉液(1g/ml)，冷藏备用。

3)麻花秦艽乙醇提取物制备：100g麻花秦艽粉碎物加500ml95％乙醇浸泡1天，取上清液再加入500ml95％乙醇浸泡1天，加热回流1小时，抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇，定容至100ml，得乙醇提取物(1g/ml)，冷藏备用。

3.方法将昆明种小鼠50只按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为麻花秦艽水煎剂组、水提醇沉组和醇提物组、缺氧对照组(0.5％的CMC-Na溶媒)，普萘洛尔(30mg/kg)阳性对照组，每只0.1ml/10g灌胃给药，连续给药14天，末次给药30min后，将小鼠称重，放入含有15g钠石灰的250ml广口瓶中(每瓶只放1只小鼠)，并用凡士林涂抹瓶口， 塞紧瓶塞，外口加以保鲜膜密闭，立即计时，直到小鼠停止呼吸，记录小鼠的存活时间，结果见表1。

4.结果：实验结果见表1，麻花秦艽各提取部位都可延长小鼠常压密闭缺氧的存活时间，与缺氧对照组相比，秦艽醇提物组能明显延长小鼠的存活时间，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1麻花秦艽抗缺氧有效部位对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响                                                  

组别	剂量(g/kg)	存活时间(min)
			缺氧对照组	-	30.33±4.79
普萘洛尔组	0.03	35.57±3.91*
			秦艽水煎	10	33.10±4.43
秦艽水提	10	31.75±8.04
			秦艽醇提	10	37.90±8.64*

与缺氧对照组比较：^*P<0.05

二)不同剂量麻花秦艽醇提部位对常压密闭小鼠存活时间的影响和抗氧化作用

1.实验目的：应用常压密闭缺氧模型考察麻花秦艽醇提部位抗缺氧的量效关系及探讨其抗氧化应激作用。

2.方法:将昆明种小鼠60只按体重随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为麻花秦艽醇提物大、中、小剂量(10、5、2.5g/kg)组，正常(常氧)对照组，缺氧对照组，普萘洛尔(30mg/kg)阳性对照组，各组的灌胃剂量为0.1ml/10g，正常和缺氧对照组分别给常水和0.5％的CMC-Na溶媒，连续给药14天，末次给药30min后，将小鼠称重，除正常常氧对照组外其它各组小鼠放入含有15g的钠石灰的250ml的广口瓶，用凡士林涂抹瓶口使其密封，再加以保鲜膜密闭，记录小鼠的存活时间，死后立即取出剖开腹腔取其肝，用冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重将肝组织匀浆(全过程应在冰浴中进行)，测定丙二醛(MAD)的含量，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，总抗氧化能力(T-AOC)的活力，其测定参照南京建成生物试剂盒说明书方法，结果见表2、3、4。

3.结果：

1)麻花秦艽醇提物对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响：

实验结果表2可见，麻花秦艽醇提部位的不同剂量都可延长小鼠常压密闭缺氧的存活时间，与空白对照组相比，醇提大剂量(10g/kg)组能明显延长小鼠的存活时间，使小鼠在常压密闭条件下的存活时间延长了59.72％，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表2麻花秦艽醇提物对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响   

组别	剂量(g/kg)	存活时间(min)	存活延长率(％)
				缺氧对照组	-	14.4±4.24	-
普萘洛尔组	0.03	21.00±4.71**	45.83
				秦艽醇提大剂量	10	23.1±8.45**	59.72
秦艽醇提中剂量	5	16.90±3.66	17.36
				秦艽醇提小剂量	2.5	15.30±3.97	6.25

与缺氧对照组比较：^**P<0.01

2)麻花秦艽醇提物对小鼠肝脏氧化酶的影响：

实验结果表3可见，与正常(常氧)对照组相比，缺氧模型组小鼠肝脏超氧化物歧化酶SOD活性显著降低(P<0.01)，脂质过氧化物MDA含量增加(P<0.01)，麻花秦艽醇提物各剂量组均能明显提高缺氧小鼠肝脏SOD活力，与缺氧模型组相比，中剂量和大剂量组差异有明显的统计学意义(P<0.01、P<0.05)。麻花秦艽醇提物组能剂量依赖地使缺氧小鼠肝脏MDA含量减少，但与缺氧模型组相比差异无明显统计学意义(P＞0.05)。

实验结果表4可见，与正常(常氧)对照组相比，缺氧模型组小鼠肝脏总抗氧化T-AOC活力降低，而各麻花秦艽药物组的肝脏T-AOC活力较缺氧模型组提高，但无明显的统计学意义(P＞0.05)。缺氧对照组小鼠肝脏过氧化氢酶CAT活性较常氧对照组降低，有明显统计学意义(P<0.01)，与缺氧模型组比较，麻花秦艽醇提物大剂量组提高了小鼠肝脏CAT活力，且有明显的统计学意义(P<0.01)。

表3麻花秦艽醇提物对小鼠肝脏中SOD活力和MDA含量的影响   

组别	剂量(g/kg)	SOD(U/mgprot)	MDA(nmol/ml)
				正常对照组	-	323.60±33.75**	1.10±1.47**
缺氧模型组	-	127.69±72.49	3.58±1.13
				普萘洛尔组	0.03	271.17±127.5*	4.88±2.59
秦艽大剂量组	10	204.29±63.79*	2.81±0.82
				秦艽中剂量组	5	216.76±50.63**	2.83±0.86
秦艽小剂量组	2.5	153.49±86.07	2.91±1.06

与缺氧模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

表4藏产秦艽醇提物对小鼠肝脏中T-AOC和CAT活力的影响   

组别	剂量(g/kg)	T-AOC(U/mgprot)	CAT(U/mgprot)
				正常对照组	-	0.089±0.038	75.23±6.54**
缺氧模型组	-	0.073±0.021	52.19±7.59

普萘洛尔组	0.03	0.053±0.023	113.11±40.94**
				秦艽大剂量组	10	0.091±0.016	78.08±13.14**
秦艽中剂量组	5	0.085±0.016	72.53±28.77
				秦艽小剂量组	2.5	0.087±0.037	62.28±16.15

与缺氧模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

三)麻花秦艽醇提物对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响

1.实验目的：应用亚硝酸钠中毒造成化学性缺氧模型考察麻花秦艽醇提部位抗缺氧作用。

2.方法：将昆明种小鼠50只按体重随机分为5组，每组10只，分别为麻花秦艽醇提大、中、小剂量组，缺氧对照组，普萘洛尔阳性对照组，小鼠分组情况，给药同上，连续给14天，末次给药30min后，将小鼠称重,各组进行腹腔注射亚硝酸钠400mg/kg，记录小鼠的存活时间，计算存活延长率，结果见表5。

3.结果：实验结果见表5，麻花秦艽醇提物各剂量组均能不同程度地延长小鼠亚硝酸钠中毒存活时间，尤其大剂量组可使小鼠存活率延长67.6％，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5麻花秦艽醇提物对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响   

组别	剂量(g/kg)	存活时间(min)	存活延长率(％)
				缺氧对照组	-	16.11±3.48	-
普萘洛尔组	0.03	19.35±3.05*	20.11
				秦艽醇提大剂量	10	27.0±12.48*	67.60
秦艽醇提中剂量	5	19.69±7.90	22.22
				秦艽醇提小剂量	2.5	16.60±2.79	3.04

与缺氧对照组比较：^*P<0.05

四)麻花秦艽醇提物对小鼠异丙肾上腺素常压缺氧存活时间的影响

1.实验目的：应用异丙肾上腺素造成心肌缺氧模型考察麻花秦艽醇提部位抗缺氧作用。

2.方法：将昆明种小鼠50只按体重随机分为5组，每组10只，小鼠分组情况，给药同上，连续给药14天，末次给药30min后，将小鼠称重，各组腹腔注射异丙肾15mg/kg，15min后放入含有钠石灰的250ml的广口瓶，用凡士林涂抹瓶口，使其密封，在加以保鲜膜密闭，记录小鼠的存活时间。结果见表6。

3.结果：实验结果见表6，麻花秦艽醇提物各剂量组均能不同程度地延长异丙肾加常压缺氧小鼠存活时间，尤其大剂量组可使小鼠存活率延长33.08％，与缺氧对照组相比，差异有明显的统计学意义(P<0.01)。

表6麻花秦艽醇提物对小鼠异丙肾常压耐缺氧存活时间的影响   

组别	剂量(g/kg)	存活时间(min)	存活延长率(％)
				缺氧对照组	-	14.75±1.98	-
普萘洛尔组	0.03	19.88±5.99*	34.78
				秦艽醇提大剂量	10	19.63±2.82**	33.08
秦艽醇提中剂量	5	19.00±6.67	28.82
				秦艽醇提小剂量	2.5	16.63±3.15	12.75

与缺氧对照组比较：^*P<0.05，^**P<0.01

五)麻花秦艽醇提物对小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间的影响

1.实验目的：应用断头造成小鼠急性脑缺血缺氧模型考察麻花秦艽醇提部位抗缺氧作用。

2.方法：将昆明种小鼠50只按体重随机分为5组，每组10只，小鼠分组情况同前，分别为醇提组大，中，小剂量，空白对照组和普萘洛尔阳性对照组，各组的灌胃剂量为0.1ml/10g，连续给药14天，末次给药30min后，断头同时按秒表记录断头后至喘息停止的时间。实验结果见表7。

3.结果：实验结果表7可见，麻花秦艽醇提物各剂量组均能延长小鼠急性脑缺血缺氧张口喘息时间，中剂量组喘息延长率为15％，与缺氧对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表7麻花秦艽醇提物对小鼠急性脑缺血缺氧存活时间的影响   

组别	剂量(g/kg)	喘息时间(s)	喘息延长率(％)
				缺氧对照组	-	14.20±1.47	-
普萘洛尔组	0.03	15.22±2.68	7.18
				秦艽醇提大剂量	10	15.66±0.57	10.28
秦艽醇提中剂量	5	16.33±2.06*	15
				秦艽醇提小剂量	2.5	14.25±2.96	0.35

与缺氧对照组比较：^*P<0.05

三、实验总结 

本专利首先通过常压密闭缺氧实验验证了麻花秦艽不同提取物抗小鼠缺氧的生物活性，然后筛选出醇提部位为其抗缺氧活性部位。动物实验表明，麻花秦艽具有明显抗缺氧作用，尤其是其醇提部位是其耐缺氧的活性部位：

(1)延长密闭缺氧小鼠的存活时间，有抗常压缺氧的作用。

(2)显著延长亚硝酸钠中毒小鼠的存活时间，有保护亚硝酸钠中毒性缺氧损伤的作用。

(3)延长小鼠异丙肾上腺素常压缺氧存活时间，对心肌缺血性缺氧有一定保护作用。

(4)延长小鼠断头后张口呼吸时间，对脑急性缺血性缺氧有一定保护作用。

(5)增加常压性缺氧小鼠肝组织的SOD活性、抗氧化酶CAT活性及总抗氧化T-AOC活力，降低肝脏MDA含量，具有抗常压性缺氧和提高小鼠的抗氧化应激能力，从而保护缺氧诱导的肝脏氧化应激损伤的作用，这些都说明麻花秦艽醇提物具有抗缺氧的作用。

本发明专利为麻花秦艽醇提物抗缺氧制剂的开发和利用提供了一定的实验依据。但本发明不限于上述具体实施例的限制，根据本发明的技术方案做出的技术变形和对麻花秦艽醇提物在抗缺氧中的相近应用，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.麻花秦艽醇提物抗缺氧的新用途，其特征在于：所述麻花秦艽醇提物的制备方法如下：将麻花秦艽根洗净晾干，粉碎，将95％的乙醇加入500ml浸泡1天，取上清液后再将95％的乙醇加入500ml浸泡1天，加热回流1小时，抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩、干燥即为麻花秦艽醇提取物。

2.根据权利要求1所述方法获取麻花秦艽醇提物。

3.根据权利要求1和2所述麻花秦艽醇提物，其特征在于：麻花秦艽醇提物能制备出具有抗缺氧的药物。