CN104540963B - 用于分类和预后创伤的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分类和预后哺乳动物、特别是人中的创伤的方法和试剂盒。所述方法定义了使本领域技术人员能够表征病理创伤愈合，诸如慢性或不愈合创伤的分子标签。

Description

用于分类和预后创伤的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于分类和预后哺乳动物、特别是人中的创伤的方法和试剂盒。所述方法定义了使本领域技术人员能够表征病理创伤愈合，诸如慢性或不愈合创伤的分子标签。
发明背景
自然创伤愈合被分成三个连续的阶段；每个阶段通过特定的细胞活性来表征：炎症期、增殖期和重塑期。
第一阶段，称为炎症期，在损伤后数分钟开始。血管破裂诱导血块形成，其主要由纤维蛋白和纤连蛋白构成。血块部分填充病灶，并允许病灶内炎症细胞的迁移。炎症细胞被募集以清除创伤。血小板分泌因子，诸如生长因子或细胞因子，其诱导创伤愈合所涉及的细胞的募集(炎症细胞诸如中性粒细胞和巨噬细胞，成纤维细胞和内皮细胞)。
第二阶段被称为增殖期，且对应于肉芽组织的发展。成纤维细胞迁移到创伤区域中，增殖并通过分泌胞外基质(ECM)蛋白形成新的临时胞外基质。然后内皮细胞迁移以促进病灶的新血管形成或血管生成。在肉芽组织内，成纤维细胞活化并分化成肌成纤维细胞，由于它们表达α-平滑肌肌动蛋白而呈现收缩特性(类似于平滑肌细胞中)。肌成纤维细胞在创伤愈合中具有关键作用，因为它们提供了创伤的收缩。最后，角化细胞从创伤边缘迁移，增殖并分化以重建表皮。
创伤愈合过程的最后阶段在创伤闭合后出现。它对应于肉芽组织的重塑。肉芽组织被重组，III型胶原蛋白被I型胶原蛋白替换，因为正常真皮主要由I型胶原蛋白构成。在这个阶段期间，过量的肌成纤维细胞通过凋亡清除。创伤愈合的最后阶段是漫长的。损伤后一年，疤痕被重塑；它变得没有那么红，且更薄。
然而，该过程不仅复杂，而且脆弱；它易于中断或失败，导致慢性或不愈合创伤的形成或异常疤痕的形成。可能有助于此的因素包括疾病(诸如糖尿病，静脉或动脉疾病)、年龄、感染或组织定位。
慢性或不愈合创伤
慢性创伤是一个世界性的健康问题，部分是由于缺乏足够的治疗方法。在2010年，全世界超过700万人患有慢性创伤，并且预计每年增长至少10％。
慢性创伤有时是不愈合创伤。常见类型的慢性创伤包括但不限于，腿部静脉溃疡、糖尿病性足部溃疡、褥疮性溃疡、腿部动脉溃疡、混合病因(静脉和动脉)的那些或具有未知病因的那些。我们还可以发现由于不正确地愈合变成慢性的急性创伤。
不愈合创伤或慢性创伤是患者、健康护理专业人员和健康护理系统的挑战。它们显著损害数百万人的生活质量，并在丧失生产力和健康护理资金方面为社会形成了负担。
创伤愈合是动态途径，其导致了组织完整性和功能的恢复。当正常修复过程受到干扰时慢性创伤或不愈合创伤发展。通过理解创伤愈合的生物学，医师可以通过选择足够的治疗优化创伤愈合。
在慢性或不愈合创伤中，自然愈合过程被改变，因此治疗是延长的、不完整的，并且有时创伤从不闭合。当一些因素引起正常炎症和增殖阶段的破坏时，慢性创伤发生。因此，存在对于用于诊断不愈合或慢性创伤以适应最佳治疗以提供创伤闭合和愈合的可靠方法的需求。还存在对于创伤的更好护理和对于降低所述护理的最后期限的需求。
在一些病理疾病或特定解剖定位中，创伤的潜在发病的早期诊断可能有助于防止创伤的发展。在其中创伤已经发展的情况下，创伤的诊断或预后的知识可以使患者能够从治疗接受最大益处。因此，创伤的治疗特别适用于处于其早期阶段的创伤，如果它呈现不正确愈合的风险。
这将有益于知道哪些患者易于发展慢性或不愈合创伤，此外，如果慢性创伤确实发展，则患者如何可能响应特定治疗。因此，关键目标是鉴定用于慢性或不愈合创伤的诊断或预后方法，以便提供较早和改进的治疗选择。
尽管一些常见临床/病理因素可能有助于预先判断，如果创伤可能是“愈合的”或“不愈合的”，或者如果急性创伤可以变成慢性，则没有特定的实验室测试以在创伤类型中进行区分。由Systagenix商业化的Woundcheck使本领域技术人员能够测量蛋白酶活性，但还不特异性到足以在可以比无法愈合的其它慢性创伤更快和更好愈合的慢性创伤之间进行区分。
例如，本技术，诸如创伤临床观察，无法预测慢性或不愈合创伤发展，且不足以分类具有创伤的愈合结果的患者。如果处于发展慢性或不愈合创伤的风险的患者可以进行鉴定，则合适的预防措施或治疗可用于潜在巨大有效性的目标程序。
WO 2011/033249公开了用于基于分子标记物或基因分类和预后创伤的方法和试剂盒。
然而，本领域中仍然存在对于用于早期诊断或预后创伤命运的方法的需求。具体而言，存在对于用于诊断或预后慢性或不愈合创伤的灵敏且可靠的方法的需求，所述慢性或不愈合创伤诸如，但不限于，腿部静脉溃疡、糖尿病性足部溃疡、褥疮性溃疡、和腿部动脉溃疡、不愈合急性创伤。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供诊断或预后创伤的结果的方法。
在本发明的第一个方面，提供了诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法，所述方法包括测定来自哺乳动物的创伤中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中所述基因定义如下：
-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示增加的表达：
POU2F2、AMIGO2、CCL11、CDC45L、CSF2、CSF3、FOXS1、GOS2、IF44L、INHBA、KPRP、LCP1、LPAR3、MICAL2、MT1F、MT1M、POLQ、RRM2、SERPINA9、SOX9、STC1、TFIP2和UCN2，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少以下miRNA显示降低的表达：
AC084368.1，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示正常的表达：
CNN1和KRT16，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示降低的表达：
ACTC1、ADAMTS7、CFB、COMP、ECM2、EDIL3、EFHD1、FOLR1、ITGA11、KIT、LBH、LGR5、MED12L、MFAP5、NR4A3、OMD、PALM、PHACTR3、PI16、PPARG、PTH1R、PTX3、RCAN2、RSPO1、SPON2、TAGLN、TMEM37、TMSB4Y、TXNIP和WFDC1，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下miRNA显示增加的表达：
MIR147B和MIR1181。
在本发明的优选实施方案中，诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法还包括测定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中所述基因定义如下：
-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示降低的表达：
ACTC1、ADAMTS7、COMP、ECM2、EDIL3、EFHD1、FOLR1、ITGA11、LBH、LGR5、MED12L、MFAP5、OMD、PALM、PHACTR3、PI16、PTH1R、RSPO1、SPON2、TAGLN、TMEM37、TMSB4Y、TXNIP和WFDC1，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少以下miRNA显示降低的表达：
AC084368.1，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示正常的表达：
CNN1和KRT16，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示增加的表达：
CCL11、CDC45L、CSF2、CSF3、GOS2、IF44L、KPRP、LCP1、LPAR3、MT1F、MT1M、POLQ、RRM2、SERPINA9、STC1和TFIP2，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下miRNA显示增加的表达：
MIR147B和MIR1181。
在本发明的具体实施方案中，诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法还包括测定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中所述基因定义如下：
-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示降低的表达：
ACTA2、APOD、FGF9、ID4、POSTN和SMAD3，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示增加的表达：
CXCL1、CXCL5、CXCL6、MMP10、MMP3、SERPINB2、SPHK1、HALPN1和CTGF。
在本发明的另一个具体实施方案中，诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法还包括测定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中所述基因定义如下：
-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示降低的表达：
ACTA2、FGF9、ID4和POSTN，
-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因显示增加的表达：
CXCL1、CXCL5、CXCL6、MMP10、MMP3和SERPINB2。
“慢性创伤”或“慢性创伤组织”或“不愈合创伤”是指，例如，选自腿部静脉溃疡、糖尿病性足部溃疡、褥疮性溃疡、腿部动脉溃疡或不愈合急性创伤或者不愈合创伤的病症。
根据本发明的基因的完整身份可以在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，或者对于本领域技术人员是众所周知的。
在本发明的一个优选方面，创伤组织是人组织，并且正常真皮成纤维细胞是正常人真皮成纤维细胞(NHDF)。
在本发明的一个优选方面，正常真皮成纤维细胞产生自所述哺乳动物的健康皮肤，并且优选地，正常真皮成纤维细胞产生自相同动物或个体的健康皮肤。
如上所使用的术语“测定基因的表达水平”是指相对于对照的定性和/或定量检测(测量水平)。通常，基因表达水平的测定可以通过以下来测量：例如通过在样品上进行的RT-PCR或原位杂交或高通量测序，诸如Lynx Therapeutics的大规模平行信号测序(Massively Parallel Signature Sequencing)(MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子测序、单分子实时(RNAP)、单分子测序、纳米孔DNA测序、VisiGenBiotechnologies方法。
通常，所述测定包括使样品与选择性试剂诸如探针、引物或配体接触，并由此检测初始存在于样品中的目标核酸的存在，或测量初始存在于样品中的目标核酸的量。接触可以在任何合适的设备(诸如板、微量滴定皿、试管、孔、玻璃或柱)中进行。在具体实施方案中，接触在用试剂包被的基底(诸如核酸阵列或特异性配体阵列)上进行。基底可以是固体或半固体基底，诸如任何适合的支持物，包括玻璃、塑料、尼龙、纸张、金属、聚合物等。基底可以是各种形式和尺寸，诸如载玻片、膜、珠、柱或凝胶。接触可以在任何适于在试剂和样品的核酸之间形成可检测的复合物(诸如核酸杂合体)的条件下进行。
在一个具体实施方案中，基因表达水平的测定可以通过定量所述基因的RNA来测定。所述RNA优选选自mRNA和miRNA。优选地，所述RNA为mRNA。
用于测量mRNA的量的方法是本领域众所周知的。例如，首先根据标准方法，例如使用裂解酶或化学溶液提取或遵循制造商的说明书通过核酸结合树脂提取样品(例如，从患者制备的细胞或组织)中含有的核酸。然后可以通过杂交(例如，Northern印迹分析)检测提取的mRNA。
或者，可以使提取的mRNA进行结合逆转录(couple reverse transcription)和扩增，诸如逆转录和通过聚合酶链式反应(RT-PCR)的扩增，其使用实现靶基因中区域扩增的特异性寡核苷酸引物。优选地，使用定量或半定量RT-PCR。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。可以逆转录并扩增提取的mRNA，其后可以将扩增的序列通过与合适探针杂交或通过直接测序，或高通量测序或本领域中已知的任何其它适当方法来检测。
其它扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
本文的具有至少10个核苷酸且显示出与目标RNA的序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针或扩增引物。应理解，此类核酸不需要是相同的，但与相当大小的同源区域通常至少约80％相同，更优选至少85％相同，甚至更优选至少90％相同，优选至少95％相同。在某些实施方案中，使用核酸组合适当的方法，诸如用于检测杂交的可检测的标记将是有利的。各种各样的适当指示剂是本领域已知的，包括荧光、放射性、酶或其它配体(例如抗生物素蛋白/生物素)。
探针通常包含长度为10至1000个核苷酸、例如10至800、更优选15至700、通常20至500个核苷酸的单链核酸。引物通常是长度为10至25个核苷酸的较短的单链核酸，设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目标核酸。探针和引物对于它们杂交，即它们优选在高严谨杂交条件(对应于最高熔融温度Tm，例如，50％甲酰胺，3x、5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)下杂交的核酸是“特异性的”。
在本发明的方法中，在创伤组织的检查样品中测定RNA的存在，优选总RNA的存在，且更优选mRNA的量。可以使用所有可用于测量RNA含量的技术。所述技术可以包括Northern印迹、逆转录定量聚合酶链式反应、NanoString技术、微阵列技术或基因表达的系列分析(SAGE)。在本发明中，还可以使用高通量测序，诸如Lynx Therapeutics的大规模平行信号测序(MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子测序、单分子实时(RNAP)、单分子测序、纳米孔DNA测序、VisiGen Biotechnologies方法。
在本发明的一个可替代的实施方案中，还可以通过定量相应编码的蛋白进行样品中基因的表达水平的测定。可以使用所有可用于测量蛋白含量的技术。
此类方法包括将样品与能够与样品中存在的目标蛋白选择性相互作用的结合伴侣接触。结合伴侣通常是可为多克隆或单克隆，优选单克隆的抗体。
蛋白的存在可以使用标准的电泳和免疫诊断技术来检测，所述技术包括免疫测定法，诸如竞争、直接反应或夹心型测定法。此类测定法包括，但不限于，Western印迹；凝集测试；酶标记和介导的免疫测定法，诸如ELISA；生物素/抗生物素蛋白类型测定法；放射免疫测定法；免疫电泳；免疫沉淀等。反应通常包括揭示标记，诸如荧光、化学发光、放射性、酶标记或染料分子，或用于检测抗原和抗体或与其反应的抗体之间的复合物的形成的其它方法。
上述测定法通常包括将液相中未结合的蛋白与结合抗原-抗体复合物的固相支持物分离。可以在本发明的实践中使用的固体支持物包括基底，诸如硝酸纤维素(例如，以膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活化珠，磁性响应颗粒等。
更具体地，可以使用ELISA方法，其中用一组抗待测试蛋白的抗体包被微量滴定板的孔。然后将含有或疑似含有标志物蛋白的样品添加至包被的孔。在足以允许形成抗体-抗原复合物的一段时间孵育之后，可以洗涤所述板以去除未结合的部分并添加可检测标记的次级结合分子。允许次级结合分子与任何捕获的样品标志物蛋白反应，洗涤所述板并使用本领域中众所周知的方法检测次级结合分子的存在。
在本发明的另一个方面，提供了用于进行任何一种或多种前述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含检测和定量至少一种靶基因的表达水平的探针。
“探针”意指长度为10至1000个核苷酸、例如10至800、更优选15至700、通常20至500个核苷酸的单链核酸，其与靶基因在高严谨杂交条件(对应于最高熔融温度Tm，例如，50％甲酰胺，3x、5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)下杂交。
根据本发明进一步的方面，提供了用于进行任一种前述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
(1)用于检测和定量表1中指定的所有基因的表达水平的多个探针，
(2)任选地，适于使用所述探针的试剂和说明书。
在本发明的又一个进一步优选的方面，提供了用于测定哺乳动物创伤组织的预后的试剂盒，其包含：
(1)用于检测和定量表1的基因中每一种的至少一种RNA或蛋白的表达水平的多个探针，
(2)任选地，适于使用所述探针的试剂和说明书。
理想地，所述说明书描述了如何测定每一种所述基因的表达水平。
根据本发明进一步的方面，提供了包含前述探针组中任何一个或多个或由其组成的微阵列。根据本发明的试剂盒可以使用装置，诸如Life Technologies的Ion Proton测序仪。
在本发明的另一个方面，提供了用于确定患者的创伤类型的试剂盒，所述试剂盒包含至少两个微阵列，每个包含用于检测和定量上述方法之一中指定的所有基因的表达水平的多个探针。
在本发明进一步的方面，提供了用于治疗创伤的方法，其包括以下步骤：进行上述用于测定创伤组织的分类或预后的方法中任何一种或多种以鉴定所述创伤组织是否是慢性的或不愈合的，和基于创伤组织的分类或预后选择适当的治疗。
在本发明的另一个方面，提供了在于增加慢性或不愈合创伤中PI16的表达的治疗。所述治疗可以在于PI16激活剂用于治疗慢性或不愈合创伤的用途。
成纤维细胞在创伤愈合中的作用
成纤维细胞在创伤愈合过程中涉及，这包括从静态的成纤维细胞向活动的成纤维细胞分化的几个步骤，所述活动的成纤维细胞将转化为肌成纤维细胞，并最终进入凋亡。在慢性或不愈合创伤中，该过程是失调的，并且成纤维细胞无法进行肌成纤维细胞分化，并且在创伤中被发现为无功能的成纤维细胞，称为伪衰老成纤维细胞(Telgenhoff D,Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing.Cell DeathDiffer 12:695-698)。在全基因组规模，本发明的目的是绘制在该过程期间将被活化或失活，并因此提供慢性或不愈合创伤的分子标签的不同基因。
人成纤维细胞具有进入被称为衰老的生理过程的能力，其允许有限的复制型细胞周期，从而避免了遗传信息的丢失。它通常在细胞已经进行了几轮复制时发生(称为复制型衰老并取决于端粒长度)，但也可以响应于环境应激而发生(Muller M(2009)Cellularsenescence:molecular mechanisms,in vivo significance,and redoxconsiderations.Antioxid Redox Signal 11:59-98)。衰老细胞被阻滞在细胞周期中，但仍维持代谢活动(Telgenhoff D,Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms inchronic wound healing.Cell Death Differ 12:695-698)。
慢性创伤的成纤维细胞丧失了一些它们的功能性，并且更具体地，它们丧失了部分或者全部其复制功能(Telgenhoff D,Shroot B(2005)Cellular senescencemechanisms in chronic wound healing.Cell Death Differ 12:695-698)。在创伤中，人成纤维细胞也与APA-1(诱导基质重塑的蛋白)的上调相关，表明伪衰老成纤维细胞表型不受端粒损耗诱导(Benanti JA,Williams DK,Robinson KL,Ozer HL,Galloway DA(2002)Induction of extracellular matrix-remodeling genes by the senescence-associated protein APA-1.Mol Cell Biol 22:7385-7397)。因此，慢性创伤中的衰老成纤维细胞将特别由于慢性炎症而显得比端粒缩短更多(Telgenhoff D,Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing.Cell Death Differ 12:695-698)。
某些生物标志物，诸如TAGLN，描述于现有技术中(Thweatt R,Lumpkin CK,Jr.,Goldstein S(1992)A novel gene encoding a smooth muscle protein isoverexpressed in senescent human fibroblasts.Biochem Biophys Res Commun 187:1-7)。在该出版物中，基因表达在衰老细胞中增加，而在本发明人使用的慢性或不愈合创伤模型中，当与正常成纤维细胞基因表达相比时，TAGLN的基因表达降低。
在(Yoon IK,Kim HK,Kim YK,Song IH,Kim W,Kim S,Baek SH,Kim JH,Kim JR(2004)Exploration of replicative senescence-associated genes in human dermalfibroblasts by cDNA microarray technology.Exp Gerontol 39:1369-1378)中，GOS2被描述为在包皮成纤维细胞衰老细胞中过表达。然而，在这篇文章中，成纤维细胞是复制型衰老，在超过20倍增群体之后获得，而在本发明中，由于本发明人在慢性或不愈合创伤模型上进行工作，所以成纤维细胞是伪衰老的，而不是复制型衰老。
真皮成纤维细胞是一种良好的实验材料，因为人细胞可以从不同供体中获得。顺便提一下，成纤维细胞代表创伤愈合中的关键细胞，因为它们分泌ECM蛋白，并且在肌成纤维细胞中分化，这导致创伤收缩。
已经在来自不同组织的成纤维细胞上描述了一些生物标志物：例如，肺中的CCL11(Puxeddu I,Bader R,Piliponsky AM,Reich R,Levi-Schaffer F,Berkman N(2006),TheCC chemokine eotaxin/CCLll has a selective profibrogenic effect on human lungfibroblasts,J Allergy Clin Immunol 117:103-110)或滑膜成纤维细胞中的TFIP2(Scaife S,Brown R,Kellie S,Filer A,Martin S,Thomas AM,Bradfield PF,Amft N,Salmon M,Buckley CD(2004)Detection of differentially expressed genes insynovial fibroblasts by restriction fragment differentialdisplay.Rheumatology{Oxfor)43:1346-1352)。
附图说明
图1：用人正常真皮成纤维细胞进行的实验的示意图
图2：在不同实验中通过定量RT-PCR测定的αSMA mRNA的水平
图3：在不同实验中通过Western印迹测定的αSMA和微管蛋白的表达
图4：列表II、III的定义
图5A:PI16mRNA表达(模拟siRNA或PI16 siRNA)
图5B:αSMA mRNA表达(模拟siRNA或PI16 siRNA)
图6A:在T+E-条件下在不同时间点的PI 16 mRNA表达
图6B:在T-E+条件下在不同时间点的PI16 mRNA表达
图6C:在T+E+条件下在不同时间点的PI 16 mRNA表达
表1:对于不愈合或慢性创伤的基因标签列表
表2:在所有进行的实验中鉴定的所有基因转录物的列表(列表II和III)。
具体实施方式
响应于病变，成纤维细胞迁移进入创伤，在创伤中它们分化为可收缩的肌成纤维细胞，所述肌成纤维细胞在重塑阶段期间将最终进入细胞凋亡。这种分化过程可以在环境受控的组织培养条件中进行离体研究，并且因此可以解决不同基因表达模式的及时控制连续。
材料与方法
慢性创伤的离体模型的建立
通过在培养的成纤维细胞上添加来自慢性创伤的渗出液而建立慢性或不愈合创伤的离体模型，从而复制病理状态。然后，研究基因表达，以定义慢性或不愈合创伤的分子标签。
从人外植体分离的NHDF购自Promocell。将NHDF在补充有10％FCS(Invitrogen,5μg/ml胰岛素和1ng/mL b-FGF(PromoKine))的DMEM-F12(Invitrogen)中培养。
为了收集渗出液，招募四位具有混合性溃疡的患者(平均年龄，76岁；范围57-88岁)。对于患者选择，决定排除任何其它可能参与创伤病因的疾病因素：糖尿病、外周动脉疾病、营养不良。从负压治疗收集渗出液。将所有渗出液以1,500 x g离心3分钟以去除细胞碎片。将上清液过滤并储存在-80℃直至使用。根据BCA方法(Sigma)使用等分试样来测定蛋白浓度。
对于实验，在48小时期间将细胞剥夺胰岛素和b-FGF。然后，将细胞在胶原蛋白包被的培养板上在补充有10％FCS、10ng/mL TGF-β1(Promocell)的DMEM-F12中培养4天。测试四个点以理解渗出物对成纤维细胞分化的影响：未处理细胞(T-E-)、用TGF-β1处理的成纤维细胞(T+E-)、用渗出液处理的细胞(T-E+)和最后同时用TGF-β1和渗出液处理的细胞(T+E+)。
通过分析成肌纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达来评估成纤维细胞分化的效率。
通过RT-qPCR(mRNA水平)并通过Western印迹(蛋白)评价这种αSMA表达。
Western印迹测定
通过用裂解缓冲液(TRIS、NaCl、NP40、EDTA、IMDTT)刮擦细胞提取总蛋白并在冰中孵育30分钟。为了去除细胞碎片，将样品在4℃以13,000 x g离心10分钟，并储存在-20℃直至使用。根据BCA方法(Sigma)测定蛋白浓度。将等量总蛋白(20μg)装载至NuPAGE 10％BIS-Tris凝胶(Invitrogen)，通过在150V迁移分离，并在30V转移到硝酸纤维素膜(Whatman)1小时。然后，针对α-SMA(Abcam)和微管蛋白(Abcam)将膜染色。随后通过次级抗体，即分别用辣根过氧化物酶(HRP)(Promega)缀合的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG孵育。使用UptiLightHS WB基底(Uptima,Interchim)通过ECL化学发光法检测信号。用扫描仪将条带数字化，并通过软件(ImageJ 1.43u,64-bit)计算相同印迹的所有条带密度之间的比率。将相对α-SMA表达标准化至微管蛋白的相应值。
总RNA样品制备
四天实验后，将处理的成纤维细胞用TRIzol试剂(Invitrogen)裂解并储存于-80℃。然后使用氯仿纯化RNA，并通过异丙醇沉淀。将总RNA在NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)上进行定量。使用Superscript III RT(Invitrogen)和RNAse OUT(Invitrogen)用oligot dT(Invitrogen)进行500ng总RNA至cDNA的逆转录。将cDNA储存在-20℃。
定量实时RT-PCR
使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Fermentas)在LightCycler480系统(Roche)上使用5μL 1:20稀释的cDNA进行定量实时PCR(RT-qPCR)。正向和反向引物由Eurofins设计(MWG，αSMA正向：CTGTTTTCCCATCCATTGTG，αSMA反向：CCATGTTCTATCGGGTACTT)，并将100μΜ储液储存在-20℃。对于每个RT-qPCR反应使用正向和反向引物。循环条件如下：初始95℃持续10分钟，随后45个循环的95℃持续15秒，58℃持续30秒，72℃持续20秒。使用LightCycler 480 SW 1.5来评价TM曲线，以测定Cp并近似计算每个扩增反应的相对浓度。
表达时机
如之前所述，对于不同时间(1h至96h)，用TGFβ和/或渗出液处理NHDF(正常人真皮成纤维细胞)。处理后，提取mRNA并通过RTqPCR评价PI16mRNA的水平。
siRNA转染
通过用特异性小干扰RNA(Qiagen)瞬时转染人真皮成纤维细胞来敲低PI16的表达。测试两种不同的siRNA。对于转染，将成纤维细胞胰蛋白酶化并接种在胶原蛋白包被的6孔板中。如之前所述，将TGF-β1和/或渗出液添加至培养基中。然后，根据制造商的说明书用10nΜ siRNA和4μL INTERFERin试剂(PolyPlus)处理NHDF 6天。为了维持足够的敲低，在48h进行第二次转染。通过RT-qPCR证实目标mRNA的敲低。作为对照，使用模拟siRNA(针对外源性和非本GFP mRNA)来绕过siRNA转染进入细胞的可能作用。
结果
对于慢性或不愈合创伤模型，将慢性创伤渗出液添加至细胞培养物(500μg/mL的渗出液的总蛋白)。进行的实验描述在图1中：细胞或者不处理(T-E-)，或者用单独的TGFβ(T+E-)、单独的渗出液(T-E+)或TGFβ和渗出液(T+E+)处理4天。使用之前描述的测定法来评价分化的水平。慢性创伤渗出液降低αSMA(mRNA和蛋白，图2和图3)的表达。这表明，慢性创伤渗出液明确抑制成纤维细胞分化。这与以下事实相关：在慢性创伤中，我们可以发现无功能的成纤维细胞，也称为伪衰老成纤维细胞。
为了分析慢性或不愈合创伤模型中成纤维细胞的不同处理后表达的基因，实现mRNA深度测序。
通过TRIzol提取总RNA。将不同处理细胞的等量的总RNA(5至6μg)通过补充乙酸钠的无水乙醇沉淀，用于RNA测序。
通过FasterisSA(Switzerland)进行mRNA测序。将RNA作为总RNA递送，两轮polyA纯化后，进行逆转录和cDNA文库。在HiSeq2000(Illumina)上进行测序。
一种基因可以包含不同的异构体，并且一些异构体可以共有一个或多个外显子。不幸的是，当每种异构体中存在的阅读数被计数并在基因实体中融合时，有时相同阅读可以计数几次，因此使具有许多异构体的基因的分析发生偏差。为了解决这个问题，决定针对对应于外显子覆盖的最大部分的每个基因创建假想转录物，并计数这些实体中存在的阅读数。差异表达步骤的标准化和分析之后，仅保留显示与1.10-3或更小的调整p值相关的差异表达的基因。应用在logFC(倍数变化)上的补充过滤器来以研究完整列表(logFC的绝对值必须大于或等于2)。
病理创伤愈合分析：慢性或不愈合创伤
本发明的目的是了解基因在两种条件之间是否差异表达，从而确定该创伤是否是慢性或不愈合创伤。
比较两种条件之间的基因转录物的丰度，T-E-点(正常真皮成纤维细胞)作为参照。考虑2个列表(如图4中定义)：列表II比较T-E+和T-E-，且列表III比较T+E+和T-E-。列表II和III与正常真皮成纤维细胞的比较提供了在分化过程期间受慢性渗出液影响的基因列表，事实上是在慢性创伤愈合中发现的病理情况中受影响的基因。因此，列表II和III代表慢性或不愈合创伤情况。随着调整p-值和测定Log FC过滤器，在列表II中409个基因被鉴定为差异表达，在表III中1006个基因被鉴定为差异表达。
一些基因，由于它们的高度增加或降低的表达，是特别感兴趣的。例如，PI 16的表达在不愈合或慢性创伤中极大降低。
而PI16 mRNA通常在TGFβ处理后过表达，人们可以在这里注意到siRNA处理后PI16mRNA水平的有效敲低(图5A)。非常有趣的是，当PI16被下调时，我们可以注意到αSMA(图5B)mRNA的TGFβ诱导水平的总体(对于siRNA PI16_7)或部分(对于siRNA PI16_5)抑制。两种siRNA效果的这些差异可以与PI16mRNA敲低的效率相关。这些结果与TGFβ处理后PI16 mRNA的表达模式研究完全一致。事实上，PI16 mRNA主要在TGFβ处理后被上调，以及用渗出液处理被完全下调(以较慢的延伸)(图6)。
因此，我们表明，PI16的过表达与成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的增加相关。相反，PI16的下调与成纤维细胞的非分化行为(用渗出液处理或siRNA方法)相关。因此，PI 16是最感兴趣的治疗候选物。本发明还涉及在于增加它们在慢性或不愈合创伤病症中的表达的治疗。

Claims (9)

1.试剂在制备诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的药物中的用途，其中所述诊断或预后包括测定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，所述基因是下表1中限定的所有基因：
表1：
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述创伤组织是人创伤组织，并且正常真皮成纤维细胞是正常人真皮成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述正常真皮成纤维细胞产生自所述哺乳动物的健康皮肤。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述创伤组织和所述正常真皮成纤维细胞产生自相同动物或个体。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因表达水平通过定量相应RNA来测定。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述RNA是mRNA。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因表达水平通过定量相应编码的蛋白来测定。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述蛋白通过使用抗体来测量。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中它通过包含以下的试剂盒来进行：
(1)用于检测和定量表1中指定的所有基因的表达水平的多个探针，
(2)适于使用所述探针的试剂和说明书。
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Granted publication date: 20170725

Termination date: 20210329