CN104535693B

CN104535693B - 一种加米霉素含量检测方法

Info

Publication number: CN104535693B
Application number: CN201510027705.7A
Authority: CN
Inventors: 张立会; 李艳萍; 姜淋洁; 王建; 程雪娇; 王勇; 余贵菊; 甄盼盼; 杨雪
Original assignee: TIANJIN ZHONGSHENG TIAOZHAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN ZHONGSHENG TIAOZHAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: CN104535693A

Abstract

本发明提供了一种加米霉素含量检测方法，该技术方案利用HPLC法测定加米霉素含量，选用蒸发光散射检测器，其灵敏度高，对温度变化不敏感，基线较稳定。蒸发光散射检测器的响应不依赖于样品的光学特性，不受官能团的影响，不受流动相组成的干扰，不要求被测主要成分有特定的化学结构，它的响应值与样品的质量成正比。加米霉素的吸收波长较低，是紫外末端吸收。因此，蒸发光散射检测器对加米霉素的检测较紫外检测器有极大的优越性。此外，选定的色谱柱及色谱条件密切围绕检测器特性设计，整体实现了较好的分离效果，该方法经过精密度试验、线性关系试验和加样回收试验等方法进行了验证，结果表明其准确性高、检测范围大，并具有较好的灵敏性。

Description

一种加米霉素含量检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种加米霉素含量检测方法。

背景技术

加米霉素，英文名：Gamithromycin，CAS号为145435-72-9，分子式为C₄₀H₇₆N₂O₁₂，分子量777.04，白色至米黄色晶体，溶于甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，不溶于水。

加米霉素是半合成的大环内酯类兽用抗生素，只有一种稳定构型。加米霉素通过抑制细菌蛋白质的合成，具有抑菌和杀菌的活性，主要用于治疗溶血性巴斯德菌、出血败血性巴斯德菌、嗜组织菌等细菌病原体导致的牛感染性疾病。加米霉素可以用于食用动物，具有吸收快、体内分布广泛、体内残留低、安全性高等优点，暂无不良反应报道。加米霉素是一种明确可以使用的兽用抗生素，在兽医临床具有广阔的应用前景。

然而作为一种药物，除了应当具有较好疗效之外，能否实现精准、便捷的定量分析也是其获得广泛应用的重要技术前提。现有技术中，对加米霉素含量的测定方法鲜有报道，CN103713080A公开了一种针对加米霉素含量的检测方法，该方法选用DAD检测器并以乙腈和磷酸氢二钾混合物作为流动相，该技术方案虽然在一定程度上填补了加米霉素定量检测的技术空白但是其在灵敏度、准确性等方面还有待提高。

此外，值得提到的是，虽然部分现有技术涉及大环内脂类抗生素的定量检测方法，但是，具体到各个大环内酯类抗生素品种，由于其相互之间在结构和性质上均存在一定的特殊性，因此难以进行简单的技术转用。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种加米霉素含量检测方法，以解决现有技术中，利用高效液相色谱法定量检测加米霉素时，灵敏度、精密度不高以及分离效果不佳的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种加米霉素含量检测方法，该方法为高效液相色谱法，利用C18色谱柱实施分离，并利用蒸发光散射检测器实施检测。

优选的，该方法具有以下色谱条件：流动相由pH8.0、浓度0.1mol/L的乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的60～80％(v/v)；流速为0.6～1mL/min；柱温为20～40℃。在此基础上可以进一步进行以下优选：乙腈占流动相总量的70％(v/v)；所述流速为0.8mL/min；所述柱温为35℃。

优选的，具有以下操作条件：蒸发光散射检测器的飘移管温度60℃，气体流速20psi，自动进样器进样量20μL。

优选的，所述C18柱的长度规格为150mm；在此基础上可以进一步优选的，所述C18柱的规格为：长度150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。

优选的，实施检测后利用外标法对加米霉素进行定量。

本发明利用HPLC法测定加米霉素含量，选用蒸发光散射检测器，其灵敏度高，对温度变化不敏感，基线较稳定。蒸发光散射检测器的响应不依赖于样品的光学特性，不受官能团的影响，不受流动相组成的干扰，不要求被测主要成分有特定的化学结构，它的响应值与样品的质量成正比。加米霉素的吸收波长较低，是紫外末端吸收。因此，蒸发光散射检测器对加米霉素的检测较紫外检测器以及DAD检测器有极大的优越性。

在优选技术方案中：

选用C18柱(4.6*150mm，5μm)具有更好的分离效果和较短的保留时间。

选定的色谱柱及色谱条件密切围绕检测器特性设计，整体实现了较好的分离效果，该方法经过精密度试验、线性关系试验和加样回收试验等方法进行了验证，结果表明其准确性高、检测范围大，并具有较好的灵敏性。此外，本发明操作方法较为简便，后期通过外标法定量即可获得较好的重现性。

附图说明

图1是加米霉素分子结构图；

图2是本发明实施例1加米霉素对照品的HPLC检测图谱

图3是本发明实施例1加米霉素含量与色谱图峰面积的线性关系图；

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

(1)色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为色谱柱，选用Agilent C18柱(4.6*150mm，5μm)，流动相是0.1mol/L乙酸铵溶液(pH 8.0)-乙腈(30:70，V/V)，流速是0.8ml/min，柱温为35℃，蒸发光散射检测器的飘移管温度60℃，气体流速20psi。自动进样器进样量为20μL。

(2)标准曲线的绘制

精密称量对照品50mg，置于50ml棕色容量瓶中，用色谱乙腈溶解、定容至刻度做为加米霉素标准溶液储备液，逐级稀释制成加米霉素含量为5、10、20、50、100、200、500μg/ml的标准溶液，分别注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱20μl，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度的对数log10(C)为横坐标x，以峰面积的对数log10(A)为纵坐标y，做出标准曲线方程y＝0.9924x+3.9502,R²＝0.9999，结果表明加米霉素在5-500μg/ml范围内，峰面积和浓度成以上关系。

(3)检测待测加米霉素注射液的含量：

精密取待测加米霉素注射液，用色谱乙腈溶解，制成适当浓度，摇匀，用0.45μm有机滤头过滤。注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱20μl，计算同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出上机待测加米霉素样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出加米霉素的含量。加米霉素含量的计算方法如下：

根据上式，计算出加米霉素为标示量含量的99.99％。

(4)精密度考察

对同一加米霉素注射液样品，连续6次进样，峰面积如表1所示：

表1加米霉素6次重复进样的面积

次数	1	2	3	4	5	6
							峰面积	86629.5	86543	86345.9	86112.4	86716	86897

峰面积RSD为0.32％，结果表明，本HPLC法检测加米霉素含量精密度高，重现性好。

(5)加样回收试验

准确取已知含量的上述加米霉素样品适量，平行取9份分为3组，再分别精密加入加米霉素标准品适量，加米霉素标准品按照80％、100％、120％加入3组加米霉素样品中，作为供试品。使供试品溶液中的加米霉素浓度分别在加米霉素标准曲线的低、中、高区域，按本发明项下的操作，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99.84％，RSD为0.66％，表明该方法加样回收率好。

实施例2

(1)实施检测

一种加米霉素含量检测方法，该方法为高效液相色谱法、利用C18色谱柱，并具有以下色谱条件：流动相由0.1mol/L乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的70％(v/v)；流速为0.8mL/min；柱温为40℃。

在以上技术方案的基础上：

所述C18柱的规格为：长度150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。

该方法利用蒸发光散射检测器实施检测并具有以下操作条件：飘移管温度60℃，气体流速20psi，进样量20μL。

(2)标准曲线绘制

精密称量对照品适量，置于一定容积棕色容量瓶中，用色谱乙腈溶解、定容至刻度做为加米霉素标准溶液储备液，逐级稀释制成加米霉素含量为5、10、20、50、100、200、500μg/ml的溶液，分别注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱20μl，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度的对数log10(C)为横坐标x，以峰面积的对数log10(A)为纵坐标y，做出标准曲线方程y＝f(x)，含量在5-500μg/ml范围。

(3)样品处理

精密取供试品适量，用色谱乙腈稀释制成适当浓度的溶液，摇匀，用0.45μm有机滤头过滤。

(4)检测待测加米霉素样品中加米霉素的含量

将步骤(3)中经过处理的待测加米霉素样品注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱20μl，计算同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出上机待测加米霉素样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出加米霉素的含量。加米霉素含量的计算方法如下：

实施例3

一种加米霉素含量检测方法，该方法为高效液相色谱法、利用C18色谱柱，并具有以下色谱条件：流动相由0.1mol/L乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的60％(v/v)；流速为1mL/min；柱温为20℃。

在以上技术方案的基础上：

所述C18柱的规格为：长度250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。

该方法利用蒸发光散射检测器实施检测。

实施例4

一种加米霉素含量检测方法，该方法为高效液相色谱法，该方法利用C18色谱柱实施分离，并利用蒸发光散射检测器实施检测，同时具有以下操作条件：飘移管温度60℃，气体流速20psi，进样量20μL。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种加米霉素含量检测方法，该方法为高效液相色谱法，其特征在于利用C18色谱柱实施分离，并利用蒸发光散射检测器实施检测；所述C18色谱柱的规格为：长度150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm；

流动相由pH8.0、浓度0.1mol/L的乙酸铵溶液与乙腈组成，其中乙腈占流动相总量的60～80％v/v；流速为0.6～1mL/min；柱温为20～40℃；

蒸发光散射检测器的漂移管温度60℃，气体流速20psi，自动进样器进样量20μL。

2.根据权利要求1所述的一种加米霉素含量检测方法，其特征在于乙腈占流动相总量的70％v/v。

3.根据权利要求1所述的一种加米霉素含量检测方法，其特征在于所述流速为0.8mL/min。

4.根据权利要求1所述的一种加米霉素含量检测方法，其特征在于所述柱温为35℃。

5.根据权利要求1所述的一种加米霉素含量检测方法，其特征在于实施检测后利用外标法对加米霉素进行定量。