CN104531829B - 一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法。该检测方法为将盘式蚊香前处理后，将染菌平板直接感染盘式蚊香，共同培养至阴性对照样上长满成熟孢子，采用目视法评价盘式蚊香的防霉效果。该前处理方法为：对盘式蚊香进行重量法计量分样，每次分样时将盘式蚊香裁剪成一定重量的条段；将条段进行灭菌处理和将灭菌后的条段进行干燥处理。该方法操作简单，实用性强，结果具有很高的重复性和可信度。

Description

一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法

技术领域

本发明属于防霉测试技术领域，具体涉及一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法。

背景技术

霉菌是丝状真菌的一个通俗名称，意即“发霉的真菌”，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。霉菌在我们的生活中无处不在，在潮湿的环境下可大量生长繁殖，对人们的日常生活和工农业生产均有较大的危害。防霉已经成为各行各业发展的一种趋势。

盘式蚊香主要由驱蚊药剂、供热材料(包括各类炭粉、各类植物粉，如中草药物、竹粉等)、粘性材料(粘性植物粉、水溶性粘合剂，如淀粉与变性淀粉、高分子聚合物等)、填充材料以及其它添加剂等组成。因木粉、玉米淀粉等原材料中均有可能带有霉菌孢子且是霉菌的营养源，而整个工艺过程没有除菌步骤，导致盘式蚊香包装成型后遇潮湿的环境就会有霉菌在表面生长并附着在包装的透明薄膜上，这些霉菌的生长会对盘式蚊香的外观及环境产生一些影响：

1、霉菌产生的色素在盘式蚊香上沉积形成色斑；

2、霉菌产生的菌丝会向盘式蚊香内部和外部延伸形成毛绒状；

3、霉菌生长成熟后产生大量的孢子，在盘式蚊香使用过程中会飘散到周围的环境，造成微生物再次传播，继而危害人的家居环境。因此，为了保证产品在存储、货架和消费者使用期间盘式蚊香外观的美观性，以及不对消费者的居家环境带来次生污染，盘式蚊香也需要进行防霉处理。

目前国内外防霉测试的方法主要集中在塑料、纺织品、皮革等材料制品。值得注意的是，盘式蚊香在材质、生霉原因、使用情况等方面都与塑料、纺织品、皮革材料制品不同。盘式蚊香本身不但含有促进霉菌生长的营养成分，且结构疏松多孔，易吸收空气中水分受潮，有利于霉菌的生长。同时盘式蚊香储存时多会长期静止地和地表接触，阴暗潮湿的环境为霉菌的生长创造了条件。塑料制品的主体聚合物并不会为霉菌生长提供条件，但增塑剂、纤维填充剂、润滑剂、稳定剂、着色剂等是造成霉菌侵染的主要原因。织物和皮革只有在一定条件下才能转变成提供霉菌生长的养分。同时，塑料、皮革和纺织品中仅纺织品能够吸水，塑料和皮革的表层均表现出疏水性，与盘式蚊香多孔吸湿的表面也有所不同。而且上述制品的存放位置、使用频次、表面形貌和盘式蚊香差异明显。

除了以上差异外，形状的差异也导致盘式蚊香的防霉测试方法和塑料、皮革、纺织品的测试方法有所区别。一般来说，当前塑料、皮革制品、纺织品的防霉测试方法都是采用面积法来计量分样。面积法计量分样的前提是样品(塑料、皮革、纺织品)能准确地裁剪或分割成一定的面积。而盘式蚊香以阿基米德螺旋线为基本圆形式样，每段盘式蚊香均有一定的弧度，表面不平整，内部结构疏松多孔，其厚度远大于纺织品和皮革。对盘式蚊香进行裁剪时，边缘难以获得整齐的界面。如果按面积进行计量分样，每次分样面积不但难于测量，而且重现性很差。

染菌方式的差异也导致盘式蚊香的防霉测试方法和塑料、皮革、纺织品的测试方法有所区别。当前塑料、皮革制品、纺织品的防霉测试方法都是采用喷洒孢子悬液法、滴加孢子悬液法和分步孢子接种法等接种真菌方式。但这些方法并不适用在盘式蚊香制品的检测中。采用喷洒法时，由于盘式蚊香条段具有一定厚度且侧表面积相对较大，霉菌孢子悬液难以均匀分布在盘式蚊香样品表面(含两侧)。采用滴加法时，由于孢子悬浮液具有较大的表面张力，液滴在样品表面无法均匀铺展，不能反映真实的染菌情况。此外，从染菌方式来说，盘式蚊香感染真菌来源多为加工过程中带入的，并非长时间接触引起。因此分步孢子接种法也都不适用于盘式蚊香的防霉测试。

综上所述，盘式蚊香在防霉测试方法上的需求将会与塑料、皮革制品、纺织品等明显差异。下表1就当前制品的防腐测试方法的计量取样方式和染菌方式进行了对比。可见，无论从提升盘式蚊香制品的储存性能的角度，还是从筛选合适的防霉制剂的角度，都急需建立适用于盘式蚊香制品的防霉检测方法。

表1不同制品的防腐测试方法的计量取样方式和染菌方式对比

发明内容

本发明的目的是提供一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法，其将盘式蚊香前处理后，以同步孢子接种法感染霉菌，目视法评价盘式蚊香的防霉效果。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法，将盘式蚊香前处理后，以同步孢子接种法在平板培养基上接种霉菌，目视法评价盘式蚊香的防霉效果。

本发明的检测方法，所述前处理方法为：

1)对盘式蚊香进行重量法计量分样，每次分样时将盘式蚊香裁剪成一定重量的条段；

2)将条段进行灭菌处理；将灭菌后的条段进行干燥处理。

本发明的检测方法，所述盘式蚊香条段的重量为0.4克至0.6克；

本发明的检测方法，所述灭菌处理的条件为121℃灭菌20分钟，干燥处理的温度为40℃至60℃，优选为50℃。

本发明的检测方法，所述同步孢子接种法是指直接将涂有霉菌孢子的平板感染样品，共同培养至阴性对照样上长满成熟孢子。

本发明的检测方法，所述霉菌菌种选自黑曲霉、绳状青霉的任一种或两者的混合物。

本发明的检测方法，所述平板培养基选自沙堡弱氏琼脂培养基(Sabouraud'sagar，以下简称SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，以下简称PDA)、察氏琼脂培养基和孟加拉红琼脂培养基的任一种，优选为SDA和PDA，进一步优选为SDA。

本发明的检测方法，所述盘式蚊香条段接种霉菌孢子后培养条件如下：温度26℃至30℃、相对湿度大于等于95％；接触时间为3天至10天。

本发明的检测方法，所述接种霉菌孢子的平板使用如下方法制备：挑取试验菌种至斜面培养基上，于26℃至30℃，相对湿度大于等于95％条件下培养7天至孢子成熟，用生理盐水洗涤斜面并稀释成孢子悬液；将1mL孢子悬液均匀涂布平板，孢子悬液的浓度优选为1×10⁵CFU/mL～10×10⁵CFU/mL。

本发明的检测方法，所述目视法指目测样品上霉菌的感染面积以及产生抑菌圈大小，从而定性判断样品的霉变程度。

借由上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是：

1、本发明人意外地发现，将盘式蚊香前处理后，以同步孢子接种法感染霉菌，采用目视法评价防霉效果；能很好地对盘式蚊香的霉变程度和防霉效果进行快速检测；

2、本发明也可用于筛选盘式蚊香的防霉剂，可以有效地评价盘式蚊香的防霉能力，试验周期短，操作简便，重复性好。

附图说明

图1a、1b和1c分别是对比例1的盘式蚊香条段上滴加孢子悬液后绳状青霉的生长情况的3次平行结果；

图2是实施例1的盘式蚊香条段上采用同步孢子接种法的绳状青霉生长情况；

图3a和图3b分别是实施例2的添加不同浓度防霉剂A后的盘式蚊香条段对黑曲霉的防霉效果；

图4a和图4b分别是实施例3的盘式蚊香条段对绳状青霉防霉效果的重复测试结果。

具体实施方式

无需进一步详细说明，相信本领域技术人员使用以上所述即可最大限度地使用本发明。下面的实施例目的在于进一步介绍和展示在本发明范围内的具体实施方案。因此，实施例应理解为仅用于更详细地展示本发明，而不以任何方式限制本发明的内容。

盘式蚊香

盘式蚊香主要由驱蚊药剂、供热材料(包括各种炭粉、各类植物粉，如中草药物、木粉、竹粉等)、粘性材料(粘性植物粉、水溶性黏合剂，如淀粉与变性淀粉、高分子聚合物等)、填充材料(包括碳酸氢钙、滑石粉、双飞粉、高岭土等)以及其它添加剂(香精、增稠剂、交联剂、防霉剂、染料、阻火剂、促燃剂)等组成。

霉菌

霉菌是形成分枝菌丝的真菌的统称，不是分类学的名词，在分类上属于真菌门的各个亚门。它们在潮湿的气候下大量生长繁殖,长出肉眼可见的丝状、绒状或蛛网的菌丝体，有较强的陆生性，在自然条件下，常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害。盘式蚊香中含有各类植物粉、淀粉等霉菌生长的营养成分，且结构疏松多孔，易吸收空气中水分受潮，为霉菌的生长创造了条件。

黑曲霉(Aspergillus niger)

黑曲霉(Aspergillus niger)因在许多材料上广泛生长而作为致病性真菌的代表，在所有防霉测试标准作为试验菌株。黑曲霉为曲霉的一种，喜欢潮湿的环境(相对湿度为65％-85％之间)，适宜的生长温度为20-30℃左右，pH值近中性。

绳状青霉(Penicillium funiculosum)

绳状青霉(Penicillium funiculosum)属半知菌纲，会在纺织木材皮革等多种材料上生长而被选为测试菌株，同时绳状青霉也是美国、中国军用标准中霉菌检验的指示菌。

计量分样法

本发明的术语“计量分样法”是指将测试样品按照一定的计量方式裁剪或分割成具有同一计量单位下相同数量的部分。常见的计量分样法有面积法和重量法。面积法指将测试样品裁剪或分割成具有相同面积的部分。重量法指将测试样品裁剪或分割成具有相同重量的部分。对于盘式蚊香样品来说，重量法更能保证试样的一致性。本发明采用重量法作为计量分样方式。

灭菌处理

灭菌处理是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。本发明采用湿热灭菌方式。

干燥处理

干燥处理是指通过一定的方式减少物品中的含水量。常用的干燥方式有常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、冷冻干燥、微波干燥和吸湿干燥。本发明采用常压干燥的方式。

霉菌接种方式

本发明的术语“霉菌接种方式”是指将霉菌孢子添加到样品表面的方法。按照添加方式可以分为喷洒法、滴加法和平板法。喷洒法指利用喷雾器将孢子悬液均匀的喷洒在样品表面；滴加法指用移液器在样品表面滴加孢子悬液；平板法指样品表面与平板上的孢子直接接触。

平板法按照样品接种时孢子成熟程度不同可以分为分步孢子接种法和同步孢子接种法。本发明的术语“分步孢子接种法”指先将平板上的霉菌孢子培养成熟，再感染样品。本发明的术语“同步孢子接种法”指直接将涂有霉菌孢子的平板感染样品，共同培养至阴性对照样上长满成熟孢子。

霉菌孢子悬液

本发明的术语“霉菌孢子悬液”是指霉菌生长成熟后产生的孢子溶于水中所得的混合物，一般作为测试菌种使用。

培养方式

本发明的术语“培养方式”是指根据微生物的最适生长条件，将霉菌孢子或与感染霉菌孢子的样品放置在适合霉菌生长的温湿度下培养。

平板

平板是指被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为平板，也叫平面培养基、平皿培养基。

生理盐水

生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。本发明所用的生理盐水浓度为0.85％(质量百分比)。

成熟孢子

本发明的术语“成熟孢子”是指霉菌孢子经萌发后生长出菌丝体，再分化成的孢子。

目视法

本发明的术语“目视法”指目测样品上霉菌的感染面积以及产生抑菌圈大小，从而定性判断样品的防霉效果。

本发明采用外标法判定盘式蚊香样品的防霉效果。将盘式蚊香的正常样样和阴性对照样同时进行防霉测试，当阴性对照样上长满霉菌停止测试。采用下表2对盘式蚊香样品的防霉效果的等级进行定性判断。

本发明的术语“正常样”是指按常规盘式蚊香工艺生产的，原料或配方含有杀菌剂及防霉剂成分的盘式蚊香样品。

本发明的术语“阴性对照样”是指按常规盘式蚊香工艺生产的，原料和配方基本不含杀菌剂及防霉剂成分的盘式蚊香样品。术语“基本不含”是指盘式蚊香的原料中不人为添加杀菌剂及防霉剂成分。

表2测试样品的防霉效果评价

对比例1

绳状青霉采用滴加孢子悬液法在盘式蚊香条段上的生长情况

1、前处理

按重量法取盘式蚊香条段3段，每段0.5克，精确至0.01克，121℃灭菌20分钟，50℃烘干待用。

2、滴加孢子悬液法在盘式蚊香条段上染菌

挑取绳状青霉接种至SDA斜面上，于28℃，相对湿度95％条件下培养7d，用5mL生理盐水冲洗至灭菌的有玻璃珠的三角瓶内中，混匀，并使用8层灭菌纱布除去菌丝等杂质后，用生理盐水稀释成终浓度为1×10⁵CFU/mL-10×10⁵CFU/mL的孢子悬液，采用10倍梯度稀释倒平板法测定孢子浓度；用移液器吸取孢子悬液滴至盘式蚊香条段上，每段盘式蚊香条段上滴加200μL，将盘式蚊香条段置28℃，相对湿度95％条件下培养4-7天。

3、培养结果

10倍梯度稀释倒平板法测定的孢子浓度为2.7×10⁵CFU/mL.。培养4天的结果如图1a-1c所示。从图1a-1c的结果可以看出，绳状青霉在盘式蚊香条段上不能均匀地铺展生长。

实施例1

绳状青霉采用同步孢子接种法在盘式蚊香条段上的生长情况

1、前处理

采用重量法取盘式蚊香条段0.5克，精确至0.01克，121℃灭菌20分钟，50℃烘干待用。

2、同步孢子接种法在盘式蚊香上染菌

挑取绳状青霉接种至SDA斜面上，28℃，相对湿度95％条件下培养7d，用5mL生理盐水冲洗至灭菌的有玻璃珠的三角瓶内中，混匀，并使用8层灭菌纱布除去菌丝等杂质后，用生理盐水稀释成终浓度为1×10⁵CFU/mL-10×10⁵CFU/mL的孢子悬液，采用10倍梯度稀释倒平板法测定孢子浓度；取1mL的孢子悬液至SDA平板上，摇动平板，使悬液均匀覆盖整块平板。取已经处理好的盘式蚊香条段放置在染菌平板上。平板正置放入28℃、相对湿度95％条件下培养4-7d。

3、培养结果

10倍梯度稀释倒平板法测定的孢子浓度为2.7×10⁵CFU/mL.。培养4天的结果如图2所示。

对比图1和图2可知，采用滴加法的盘式蚊香条段上绳状青霉仅在加样处及液滴扩散处生长；采用本发明的同步孢子接种法的盘式蚊香条段上的绳状青霉可以样品表面均匀地扩散性地生长。可见，本发明的同步孢子接种法更科学更能量化更具评价性。

实施例2

1、样品的准备

采用重量法选取经不同浓度防霉剂A处理的盘式蚊香两段，同时选择未用防霉剂处理的盘式蚊香两段作为阴性对照，每段0.5克，精确至0.01克。含有低浓度防腐剂A的盘式蚊香条段命名为A1，含有高浓度防腐剂A的盘式蚊香条段命名为A2，两段阴性对照样分别命名为C01和C02。将所有测试样品121℃灭菌20分钟，50℃烘干待用。

2、试验菌平板的制备

挑取绳状青霉接种至SDA斜面上，于28℃，相对湿度95％条件下培养7d，用5mL生理盐水冲洗至灭菌的有玻璃珠的三角瓶内中，混匀，用8层灭菌纱布除去菌丝等杂质后，用生理盐水稀释成终浓度为1×10⁵CFU/mL-10×10⁵CFU/mL的孢子悬液，采用10倍梯度稀释倒平板法测定孢子浓度；取1mL孢子悬液至SDA平板上，摇动平板，使悬液均匀覆盖整块平板。

3、试样接种与培养

用无菌镊子将盘式蚊香条段放置在制备好的试验菌平板上，每块平板放置两段盘式蚊香，一段为阴性对照，一段为测试样品，分别放置在距离平板边缘30mm处。平板正置放入28℃、相对湿度95％条件下培养4-7d。

4、培养结果

10倍梯度稀释倒平板法测定的孢子浓度为2.4×10⁵CFU/mL.。培养7天后的结果如图3a所示，可见A1上长满霉菌，A1无防霉性，防霉等级为1；图3b显示的是A2上没有霉菌生长，且有明显抑菌圈，A2有强防霉性，防霉等级为3。说明按照本发明提供的方法能有效对盘式蚊香的防霉效果进行判断，同时也提供了一种防霉剂筛选的方法。

实施例3

1、前处理

采用重量法取盘式蚊香正常样和阴性对照样条段，每段0.5克，精确至0.01克。正常样命名为S1，阴性对照样命名为C1。121℃灭菌20分钟，50℃烘干待用。

2、试验菌平板的制备

挑取黑曲霉接种至SDA斜面上，于28℃，相对湿度95％条件下培养7d，用5mL生理盐水冲洗至灭菌的有玻璃珠的三角瓶内中，混匀，用8层灭菌纱布除去菌丝等杂质后，用生理盐水稀释成终浓度为1×10⁵CFU/mL-10×10⁵CFU/mL的孢子悬液,采用10倍梯度稀释倒平板法测定孢子浓度；取1mL的孢子悬液至SDA平板上，摇动平板，使悬液均匀覆盖整块平板。

3、样品接种与培养

使用无菌镊子将盘式蚊香条段C1和S1放置在制备好的试验菌平板上，放置在距离平板边缘30mm处。平板正置放入28℃、相对湿度95％条件下培养4-7d。

4、平行实验

重复操作实施例步骤1-3一次。步骤1中正常样命名为S2，阴性对照样命名为C2。

图4a和图4b分别为两次平行实验的盘式蚊香条段的染菌情况。图4a左为S1，C1的染菌情况，图4b右为S2，C2的染菌情况。如图4a和图4b所示，盘式蚊香条段S1、S2两次染菌情况相似，均没有霉菌生长，且有抑菌圈大小相近，抑菌圈直径约9mm。说明该样品有强防霉性，防霉等级为3，两次平行测试的结果一致，说明该方法的可重复性和可信度很高。

本文所公开的量纲和数值不应理解为所述精确值的严格限制。除非另外说明，每个这样的量纲旨在表示所述值和围绕该值的功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

在发明内容中引用的所有文件都在相关部分中以引用方式纳入本文中。对于任何文件的引用不应当解释为承认其是有关本发明的现有技术。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明实质和范围的情况下可以做出多个其它的修改和变型。这些修改和变型均纳入本发明的保护范围之内。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种评价盘式蚊香防霉效果的检测方法，其特征在于：该方法为将盘式蚊香前处理后，以同步孢子接种法在平板培养基上接种霉菌，通过目视法以抑菌圈来评价盘式蚊香的防霉效果；所述同步孢子接种法是指感染霉菌菌种的平板感染盘式蚊香，共同培养至阴性对照上长满成熟霉菌孢子；

前处理方法为：

1)对盘式蚊香进行重量法计量分样，每次分样时将盘式蚊香裁剪成0.4克至0.6克的条段；

2)将条段进行灭菌处理和将灭菌后的条段进行干燥处理；

同步孢子接种法是指：将感染霉菌菌种的平板感染盘式蚊香，共同培养至阴性对照上长满成熟霉菌孢子；接种霉菌孢子的平板使用如下方法制备：

挑取试验菌种至斜面培养基上，于26℃至30℃，相对湿度大于等于95％条件下培养7天至孢子成熟，用生理盐水洗涤斜面并稀释成孢子悬液；将1mL浓度为1×10⁵CFU/mL^-10×10⁵CFU/mL孢子悬液均匀涂布平板；

目视法是指目测样品上霉菌的感染面积以及产生抑菌圈大小，定性判断样品的霉变程度；

盘式蚊香条段和接种霉菌孢子的平板接触后，共同培养的条件如下：温度26℃至30℃、相对湿度大于等于95％，接触时间为3天至10天。

2.如权利要求1所述的评价盘式蚊香防霉效果的检测方法，其特征在于：步骤2)的灭菌处理的条件为121℃灭菌20分钟，干燥处理的温度为40℃至60℃。

3.如权利要求1所述的评价盘式蚊香防霉效果的检测方法，其特征在于：所述霉菌菌种选自黑曲霉、绳状青霉的任一种或两者的混合物；所述平板培养基选自SDA、PDA、察氏琼脂培养基或孟加拉红琼脂培养基的任一种。