CN104996183A

CN104996183A - 一种检测微生物对植物根系的影响的方法及其专用装置

Info

Publication number: CN104996183A
Application number: CN201510450471.7A
Authority: CN
Inventors: 李健强; 孟嫣; 梁超琼; 罗来鑫; 曹永松; 刘西莉; 刘鹏飞; 阮小珀; 张文华; 姜治国
Original assignee: Yunnan Ci & Cp Biotech Engineering Co Ltd; China Agricultural University
Current assignee: Yunnan Ci & Cp Biotech Engineering Co Ltd; China Agricultural University
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-07-28
Also published as: CN104996183B

Abstract

本发明公开了一种检测微生物对植物根系的影响的方法及其专用装置。该方法包括下述步骤：(Ⅰ)在盒体(2)中加入待测微生物和培养液；(Ⅱ)将发芽板(1)放置在所述盒体内的隔板顶端，在所述发芽板上放置润湿的发芽纸；(Ⅲ)在所述发芽纸上放置植物繁殖材料，每个植物繁殖材料对应发芽板的一个通孔；(Ⅳ)用培养基质覆盖植物繁殖材料并培养至植物繁殖材料生根，观察检测植物根系的生长状况。该方法在筛选植物抗感性品种和评价杀菌剂对植物根系病害的防治效果中的应用具有十分广阔的应用前景。

Description

一种检测微生物对植物根系的影响的方法及其专用装置

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测微生物对植物根系的影响的方法及其专用装置，以及该方法在筛选植物抗感性品种和评价杀菌剂对植物根系病害的防治效果中的应用。

背景技术

传统的测定植物根系病害的病原微生物和筛选植物抗感性品种多用盆栽法。盆栽法一般使用土壤为介质，难以实现对植物根系生长变化和对植物和微生物逆境相应的直观观测和评价，而且耗时较长，一般从接种到地上部分表现症状需要20天左右；不同致病力的菌株对植物根系造成的危害程度差异显著，而盆栽法中植株的地上部分在短期内没有明显差异，导致难以区分病原微生物致病性的强弱；同时盆栽法一般使用土壤为介质，无法保证植物根系和病原微生物的完全接触，即使在相同的接种条件下，试验结果的可重复性和稳定性较低。因此，亟待创新一种简便、快速、直观的测定引起植物根系病害的病原微生物的方法。

玉米是我国重要的粮食作物之一，在我国粮食生产中占有举足轻重的地位。1988年玉米苗枯病在我国浙江制种田首次报道，之后在山东、辽宁等省份相继有该病发生，目前已扩展到吉林、黑龙江、新疆、甘肃、宁夏、北京、河北、河南、陕西、四川、云南、江苏、海南等省市区。玉米苗枯病可引起根部变褐、湿腐，以后逐渐扩展侵染中胚轴，造成根系发育不良，根毛减少，受害严重时不产生次生根，随后根系逐渐变黑褐色，在第一节形成坏死环，地上部分发病较轻时叶片发黄、边缘枯焦、心叶卷曲并形成弱苗，发病较重时心叶青枯萎蔫，外围叶片干枯呈暗色、节间缩短直至植株死亡，在田间表现出严重缺苗、断垄现象，发病严重的地区死苗率达到30％以上。玉米苗枯病主要通过土壤、种子和病残体携带病原微生物传播。近年来我国玉米制种面积在全国范围内的迅速扩大，连作程度加剧，品系组合增多，频繁的北种南繁，导致病原微生物在土壤中数量积累，种类增多，加剧了玉米苗枯病的发生。明确各地区病原微生物种类及优势类群，有利于加快开展该病害的预防控制研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定引起植物根系病害的病原微生物的方法，以及该方法在鉴定待测微生物具有影响植物根系生长的作用效果、筛选植物抗感性品种和评价杀菌剂防治植物根系病害的作用效果中的应用。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种发芽盒。

本发明所提供的发芽盒，包括发芽板1、顶端开口的盒体2以及与盒体开口匹配的盖体3；盒体内部设有若干竖直隔板，隔板将盒体内部分隔为n个竖直隔间，隔板高度可为盒体高度的1/3-2/3；盒体内部，各个隔间的顶端以上相互连通、底端以下相互连通；发芽板放置于盒体内、隔板顶端；发芽板上设有n+1个通孔，其中通孔1至通孔n分别对应n个隔间中的1个，通孔n+1的位置任意；n为3以上的自然数；发芽板、盒体、盖体和隔板均为透明材质或半透明材质。

所述盒体的形状可为倒置的梯形台。

所述发芽盒中，隔板将盒体内部分隔为九宫格形式的9个隔间。

所述盒体的顶端长度可为17cm-21cm、宽度可为11cm-15cm；所述盒体的底端长度可为15cm-19cm、宽度可为9cm-13cm；所述盒体高度可为13cm-17cm；所述隔板高度可为3cm-7cm。

所述盒体的顶端长度具体可为19cm、宽度具体可为13cm；所述盒体的底端长度具体可为17cm、宽度具体可为11cm；所述盒体高度具体可为15cm；所述隔板高度具体可为5cm。

所述发芽盒中，n个竖直隔间具体可为9个竖直隔间。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种利用上述发芽盒检测微生物对植物根系的影响的方法。

所述一种利用上述发芽盒检测微生物对植物根系的影响的方法，依次包括下述步骤：

(Ⅰ)在盒体中加入待测微生物和培养液；

(Ⅱ)将发芽板放置在盒体内的隔板顶端，在发芽板上放置润湿的发芽纸；

(Ⅲ)在所述发芽纸上放置植物繁殖材料，每个植物繁殖材料对应发芽板的一个通孔；

(Ⅳ)用培养基质覆盖所述植物繁殖材料并培养至所述植物繁殖材料生根，观察根系的生长状况。

步骤(Ⅳ)的培养过程中，在植物繁殖材料出苗前，在盒体上加盖盖体。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种利用上述发芽盒检测待测药物对引起植物根系病害的微生物的防治效果的方法。

所述一种利用上述发芽盒检测待测药物对引起植物根系病害的微生物的防治效果的方法，依次包括下述步骤：

①在盒体中加入待测药物、引起植物根系病害的微生物和培养液；

②将发芽板放置在盒体内的隔板顶端，在所述发芽板上放置润湿的发芽纸；

③在所述发芽纸上放置植物繁殖材料，每个植物繁殖材料对应发芽板的一个通孔；

④用培养基质覆盖所述植物繁殖材料并培养至所述植物繁殖材料生根，观察根系的生长状况。

步骤④的培养过程中，在植物繁殖材料出苗前，在盒体上加盖盖体。

上述方法中，所述植物繁殖材料为植物种子或植物地下根茎。

上述方法中，所述植物种子为胚根长至1厘米以上的玉米籽粒。

上述任一所述发芽盒在判断待测微生物是否为引起待测植物根系病害的微生物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述方法在判断待测微生物是否为引起待测植物根系病害的微生物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述应用中，具体可通过发病率或病情指数判断待测微生物是否为引起待测植物根系病害的微生物。所述应用中，如果待测植物的根系发病率为11.11％以上且待测植物的病情指数为3.7以上，待测微生物为引起待测植物根系病害的微生物。

上述任一所述发芽盒或上述任一所述方法在鉴定待测微生物是否具有影响植物根系生长的作用效果中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述发芽盒或上述任一所述方法在筛选植物抗感性品种中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述发芽盒或上述任一所述方法在评价杀菌剂防治植物根系病害的作用效果中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述植物繁殖材料可为植物种子或植物地下根茎。

上述任一所述发芽盒的材料可为透明材料或半透明材料,如透明PVC、PP、PET、PMMA及PC。在本发明的一个实施例中，制作所述发芽盒的材料具体可为透明PVC。

上述任一所述微生物可为细菌或真菌；所述真菌可为禾谷镰孢菌(F.graminereum)、木贼镰孢菌(F.equiset)或厚垣镰孢菌(F.chlamydosporum)。

上述任一所述植物根系病害可为玉米苗枯病。

上述任一所述植物可为如下(d1)、(d2)、(d3)、(d4)或(d5)：

(d1)陆生植物；

(d2)双子叶植物；

(d3)单子叶植物；

(d4)禾本科植物；

(d5)玉米。

实验证明，本发明所提供的方法能快速测定引起植物根系病害的病原微生物，在玉米接种后第7天就可通过测定植物根系的发病率和病情指数鉴定待测微生物是否为引起玉米苗枯病的病原微生物。实验结果表明，禾谷镰孢菌(F.graminereum)可引起玉米苗枯病典型的根腐症状，为玉米苗枯病的病原微生物；厚垣镰孢菌(F.chlamydosporum)和木贼镰孢菌(F.equiset)不能引起玉米苗枯病典型的根腐症状，为玉米苗枯病的非病原微生物。

附图说明

图1为发芽盒装置示意图。

图2为测定引起玉米苗枯病的病原微生物的方法操作流程。

图3为玉米幼苗接种不同微生物菌株后7天的生长状态。

其中CK为对照组；Fg为F.graminearum组；Fch为F.chlamydosporum组；Fe为F.equiseti组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

SNA培养基：溶质及其在培养基中浓度为：磷酸二氢钾1.0g/L，硝酸钾1.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，葡萄糖0.2g/L，蔗糖0.2g/L，琼脂15g/L；溶剂为蒸馏水。121℃蒸气灭菌20min。

PDA培养基：马铃薯200g(去皮的马铃薯切成小块，煮沸30分钟过滤去滤液)、葡萄糖20g，琼脂16g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃蒸气灭菌20min。

MS液体培养基：MS培养基干粉(Phytotech公司产品，产品目录号为M519)4.33g溶于蒸馏水，定容至1L。

下述实施例中所用的玉米具体为玉米品种京科968玉米，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。玉米品种京科968在下文中简称玉米。

下述实施例中的禾谷镰孢菌(F.graminereum)、木贼镰孢菌(F.equiset)和厚垣镰孢菌(F.chlamydosporum)均记载在如下文献中：Meng,Y；Luo,L；Hu,M；Liang,C；Mtung'e,O；Mortensen,C；Li,J.2014.The pathogen and its mycotoxin effectof maize seedling blight in Hexi Corridor in China.Phytopathology.104(11)79-80.在下文中依次简称F.graminereum、F.equiset和F.chlamydosporum。

发芽纸：常规滤纸，大小为20cm×30cm。

实施例1、发芽盒的制作

图1为本发明中发芽盒的结构示意图。发芽盒，包括发芽板(1)顶端开口的盒体(2)以及与盒体开口匹配的盖体(3)盒体内部设有若干竖直隔板，隔板将盒体内部分隔为九宫格形式的9个隔间，隔板高度为盒体高度的1/3-2/3；盒体内部，各个隔间的顶端以上相互连通、底端以下相互连通；发芽板放置于盒体内、隔板顶端；发芽板上具有10个通孔，其中通孔1至通孔9分别对应9个隔间中的1个，通孔10的位置任意(图1中位于发芽板的右上角)；发芽板、盒体、盖体和隔板均为透明材质或半透明材质。

盒体的形状为倒置的梯形台。盒体的顶端长度为19cm、宽度为13cm，盒体的底端长度为17cm、宽度为11cm，盒体高度为15cm，隔板高度为5cm，隔板的顶端与盒体的顶端的垂直距离为5cm,隔板的底端与盒体的底端的垂直距离为5cm。

本实施例中，制作发芽盒的材料为透明PVC。

实施例2、应用实施例1制备的发芽盒测定引起玉米苗枯病的病原微生物

一、玉米种子催芽(在超净工作台中进行无菌操作)

取玉米种子120粒，用100mL 1％(质量百分浓度)次氯酸钠浸泡5min，用无菌水冲洗种子3次后放入灭菌后的烧杯中，向烧杯中加入2倍种子体积的无菌水并用封口膜封口，25℃浸种12h，然后将种子转至发芽纸上，待胚根长至1厘米时，选取胚根健康、饱满的籽粒备用。

二、待测微生物孢子悬浮液的制备

待测微生物为F.graminereum、F.equiset或F.chlamydosporum。

取待测微生物的孢子，用无菌水悬浮，得到浓度为1×10⁵CFU/mL的孢子悬浮液。

三、待测微生物的接种

取12个发芽盒，紫外灭菌后分别处理如下：

1、CK组(3个发芽盒)：(1)取发芽盒盒体(见图2中的A)，向盒体中加入混合液(混合液的组成为：1L MS液体培养基，30ml无菌水，200μl吐温20)直至混合液液面低于隔板顶端0.5厘米(由于隔间的底端以下相互连通，所以各个隔间中的混合液实际上是相互连通的)；(2)然后在隔板顶端放置发芽板(见图2中的B)；(3)然后，在发芽板上铺一层发芽纸(用无菌水喷至湿润)，然后将发芽纸上与发芽板上的通孔对应的位置穿透，将步骤一培养的9个玉米籽粒放在发芽纸上，每个玉米籽粒的胚根向下插入通孔1至通孔9中的1个孔，将一个空心管插入通孔10(见图2中的C)；(4)然后，用灭菌的草炭灰-蛭石混合物(草炭灰和蛭石的质量比为1：1)覆盖玉米籽粒，向草炭灰-蛭石混合物中加水保湿，盖上盒盖(见图2中的D)；(5)待玉米幼苗出土后，去掉盒盖，每天根据液面下降情况从空心管处添加MS液体培养基。

2、F.graminereum组(3个发芽盒)：除将CK组中的混合液中的无菌水替换为步骤二制得的F.graminereum孢子悬浮液，其它步骤均不变。

3、F.chlamydosporum组(3个发芽盒)：除将CK组中的混合液中的无菌水替换为步骤二制得的F.chlamydosporum孢子悬浮液，其它步骤均不变。

4、F.equiset组(3个发芽盒)：除将CK组中的混合液中的无菌水替换为步骤二制得的F.equiset孢子悬浮液，其它步骤均不变。

从在发芽纸上放置玉米籽粒开始计时，连续培养7天后观察植株根部，评价玉米苗枯病的发生情况。

四、引起玉米苗枯病的病原微生物的测定

对玉米苗枯病的发生情况的评价采用植物地下部分病级分级标准进行。所述植物地下部分病级分级标准如下：0级：根系健康，无变褐现象；1级：根系出现零星病斑，病斑面积占根系总面积的5％以下；3级：根系出现病斑，病斑面积占根系总面积的5％至25％(不含5％，含25％)；5级：根系出现病斑，病斑面积占根系总面积的25％至50％(不含25％，含50％)；7级：根系出现病斑，病斑面积占根系总面积的50％至75％(不含50％，含75％)；9级：根系出现病斑，病斑面积占根系总面积的75％以上(不含75％)。

植物根系发病率的计算公式为：植物根系发病率％＝(植物总病株数/调查植物总株数)×100％。

植物根系病情指数的计算公式为：植物根系病情指数＝100×∑(植物各级病株数×植物各级代表值)/(调查植物总株数×最高级代表值)。

根据所述植物根系发病率和病情指数评价步骤三中的待测微生物是否为引起玉米苗枯病的病原微生物。评价标准为：如果植物根系发病率≥11.11％且植物根系病情指数≥3.7，则待测微生物为引起玉米苗枯病的病原微生物；其余情况待测微生物则不是引起玉米苗枯病的病原微生物。

对步骤三中的各组幼苗进行植物根系病害发生情况调查并统计植物根系发病率和植物根系病情指数。实验结果见表1。

表1.接种后第7天不同组的幼苗的植物根系发病率和植物根系病情指数

结果表明：在玉米接种后第7天，四个组的玉米幼苗地上部分表现无差异，且F.chlamydosporum和F.equiseti接种后对玉米幼苗的生长有一定促进作用；在玉米接种后第7天，四个组的玉米幼苗地下部分表现差异较大，CK组的玉米根系健康呈白色；F.graminearum组的玉米根系出现较多病斑，接种第4天就能够观察到根系的褐色病斑，第7天时根系褐变现象严重、无侧根，对F.graminearum组幼苗发病率和病情指数进行统计，植物根系发病率达到100％，植物根系病情指数达到58.44；F.chlamydosporum组的玉米根系可见有大量的菌丝出现，但根系仍然呈白色，仅1株幼苗根系轻微变褐色，对F.chlamydosporum组幼苗发病率和病情指数进行统计，植物根系发病率为3.70％，植物根系病情指数为0.41；F.equiseti组的玉米根系的生长有一定影响，侧根数量少于CK处理区幼苗的侧根数量，但不引起根系发病，根系健康呈白色。

对上述发病植株根系表面消毒后进行分离培养，对微生物进行形态学观察和PCR技术鉴定，结果表明从发病植株的根系上再分离得到的微生物与原接种菌株一致。

结果表明，F.graminearum可引起玉米苗枯病典型的根腐症状，依据所述评价标准F.graminearum为玉米苗枯病的病原微生物；F.chlamydosporum和F.equiseti不能引起玉米苗枯病典型的根腐症状，依据所述评价标准F.chlamydosporum和F.equiseti为玉米苗枯病典型的非病原微生物。

Claims

1.一种发芽盒，包括发芽板(1)、顶端开口的盒体(2)以及与盒体开口匹配的盖体(3)；盒体内部设有若干竖直隔板，隔板将盒体内部分隔为n个竖直隔间，隔板高度为盒体高度的1/3-2/3；盒体内部，各个隔间的顶端以上相互连通、底端以下相互连通；发芽板放置于盒体内、隔板顶端；发芽板上设有n+1个通孔，其中通孔1至通孔n分别对应n个隔间中的1个，通孔n+1的位置任意；n为3以上的自然数；发芽板、盒体、盖体和隔板均为透明材质或半透明材质。

2.如权利要求1所述的发芽盒，其特征在于：所述盒体的形状为倒置的梯形台。

3.如权利要求2所述的发芽盒，其特征在于：所述发芽盒中，隔板将盒体内部分隔为九宫格形式的9个隔间。

4.如权利要求2或3所述的发芽盒，其特征在于：所述盒体的顶端长度为17cm-21cm、宽度为11cm-15cm；所述盒体的底端长度为15cm-19cm、宽度为9cm-13cm；所述盒体高度为13cm-17cm；所述隔板高度为3cm-7cm。

5.A1)和/或A2)的方法：

A1)采用权利要求1-4中任一所述发芽盒检测微生物对植物根系的影响的方法，依次包括下述步骤：

(Ⅰ)在所述盒体中加入待测微生物和培养液；

(Ⅱ)将所述发芽板放置在盒体内的隔板顶端，在所述发芽板上放置润湿的发芽纸；

(Ⅳ)用培养基质覆盖所述植物繁殖材料并培养至所述植物繁殖材料生根，观察根系的生长状况；

A2)采用权利要求1-4中任一所述发芽盒检测待测药物对引起植物根系病害的微生物的防治效果的方法，依次包括下述步骤：

①在所述盒体中加入待测药物、引起植物根系病害的微生物和培养液；

②将所述发芽板放置在盒体内的隔板顶端，在所述发芽板上放置润湿的发芽纸；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物繁殖材料为植物种子或植物地下根茎。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物种子为胚根长至1厘米以上的玉米籽粒。

8.权利要求1-4中任一所述发芽盒或权利要求5-7中任一所述方法在判断待测微生物是否为引起待测植物根系病害的微生物中的应用。

9.C1)-C3)中至少一种中的应用：

C1)权利要求1-4任一所述的发芽盒或权利要求5-7任一所述的方法在鉴定待测微生物是否具有影响植物根系生长的作用效果中的应用；

C2)权利要求1-4任一所述的发芽盒或权利要求5-7任一所述的方法在筛选植物抗感性品种中的应用；

C3)权利要求1-4任一所述的发芽盒或权利要求5-7任一所述的方法在评价杀菌剂防治植物根系病害的作用效果中的应用。

10.如权利要求5-7任一所述的方法或权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述植物为如下(d1)、(d2)、(d3)(d4)或(d5)：

(d1)陆生植物；

(d2)双子叶植物单子叶植物；

(d3)单子叶植物；

(d4)禾本科植物；

(d5)玉米；

所述微生物为(a)或(b)：

(a)真菌；

(b)细菌。