CN104515763A - 一种快速区分环境中刺激(污染)物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境监测技术领域，具体的说是一种采用活体单细胞拉曼光谱技术快速区分环境中刺激物如抗生素类、醇类及重金属离子类等污染物质的方法。将活化的E.coli细胞培养至对数早期，加入到待区分的环境刺激物中1-5h，而后收集单细胞利用拉曼光谱，根据不同的药物的不同处理产生的拉曼形态的不同，确定环境刺激物的类型。本发明操作简单、样品用量少、时间短、成本低的优点，进而利用本发明采用的活体单细胞拉曼技术可以用于检测并区分环境变化（如温度变化、渗透压变化、CO₂浓度变化、pH变化，但又不局限于此）和环境刺激物（如抗生素类、醇类、重金属类物质、药物，但又不局限于此）的方式，具有普适性，同时具有广阔的应用前景。

Description

一种快速区分环境中刺激(污染)物质的方法

技术领域

本发明涉及环境监测技术领域，具体的说是一种采用活体单细胞拉曼光谱技术快速区分环境中刺激（污染）物质的方法。

背景技术

随着世界经济的不断发展，环境污染问题已经日趋明显，人们越来越重视保护自己赖以生存的环境。监测环境中污染物的类型变得尤为重要，只有了解到环境中污染物的类型才能有的放矢，治理环境污染。环境中比较主要的污染物包括有机物、抗生素类、醇类和重金属类污染等等。传统的检测技术包括LC-MS等高精密手段的应用，这类技术能够精确的确定环境中污染物的种类和浓度，并且可靠性极强，但是此类传统的检测手段费时、费力、成本高而且需要专业人士进行操作。目前，生物传感器以其简单、快速的特点日益成为监测环境污染的常规手段。针对不同类型的污染物都有其特定的生物传感器的研发，包括酶生物传感器、受体生物传感器、抗体生物传感器和完整细胞生物传感器等等，其中完整细胞生物传感器用于监测环境得到更多关注。而目前完整细胞生物传感器的开发主要是对细胞进行基因工程改造，将具有特定敏感度的启动子与报告基因融合，用来监测特定环境污染物，限制了监测污染物的范围，而且需要复杂的基因工程操作。而活体单细胞拉曼技术越来越得到人们的广泛应用，可用来区分细胞的不同时期，鉴定细胞种类，评价药物等等。之前已有关于E.coli，yeast，Pseudomonas等对刺激物处理的报道，单细胞拉曼图谱展示的细胞内部生理组分的变化是细胞对刺激物作出的响应的体现，但目前还没有相关报道称单细胞拉曼光谱技术是否可以作为区分环境刺激类型的检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速区分环境中刺激（污染）物质的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速区分环境中刺激（污染）物质的方法：将培养至对数早期的E.coli细胞加入到待区分的环境刺激物中1-5h，而后收集细胞并采集该单细胞拉曼光谱，利用细胞在不同环境中细胞内部成分发生特定变化进而产生特定的拉曼光谱的特点，区分外界环境中刺激物的类型。其中，刺激（污染）物质如抗生素类、醇类及重金属类物质。

进一步的说，将培养至对数早期的E.coli细胞分别加入到处理组或对照组中处理1-5h，分别收集各处理组的细胞并采集各单细胞拉曼光谱，利用细胞在不同环境中细胞内部成分发生特定变化进而产生特定的拉曼光谱的特点，区分外界环境中刺激物的类型，其中对照组为ddH₂O溶液。

所述待区分的环境中刺激物的浓度为稍大于其半致死浓度（8小时内）。

所述在待测区分的环境刺激物中1-5h的细胞采用ddH₂O离心洗涤3次，离心转速为5,200rpm，离心3min，离心过程要轻缓，尽量避免细胞受到强烈的刺激。

将收集的单细胞在能量为25mW的激光下，采集拉曼光谱的时间为10-15s。

将通过不同类物质刺激的单细胞拉曼光谱，进行PC-LDA分析，并根据每组细胞平均拉曼光谱的性质进行层次聚类分析，得到直观的分类关系，用来判断环境中的刺激物的类型。

本发明作用原理：根据激光拉曼光谱的特点，其特征是：拉曼光谱信息来自于细胞内部大分子的键的振动，因此根据原理单细胞拉曼光谱可作为细胞的“指纹技术”，每种细胞根据其内部成分的不同都有其独特的拉曼图谱。当细胞接受到外界环境中的刺激时就会表现出应激反应或适应反应，这种变化通常伴随细胞内部成分的变化，同时拉曼图谱也会发生变化，利用不同刺激物作用原理不同，产生的细胞内部变化的不同，从而通过与对照组细胞拉曼光谱的比较，解析细胞受到刺激的类型。

本发明的优点：简单、快速、成本低、不需要复杂工序，需要样本量少。首先，此单细胞拉曼技术不需要对细胞进行标记，可以操作活体细胞，不需要大量的背景知识；其次，与传统的检测手段相比，较早的传统检测污染物的办法主要涉及到化学法，如质谱法，HPLC法等，费用高而且工序繁琐，且需要相当专业的技术人员，相比现在较常用的生物传感器检测方法，活体单细胞拉曼技术，不需要对细胞进行繁琐的基因工程改造，可以直接对完整细胞进行操作；再次，单细胞拉曼技术的应用可以节约时间，一般在5h内通过比较对照组和处理组的单细胞拉曼形态，确定环境中是否存在抗生素类物质或是醇类物质。此外，单细胞拉曼技术相较于以前的检测方法对样品的细胞量要求低，极少量的单细胞的存在即可用于检测。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的实验实施流程图。

图2为本发明实施例1提供的细胞分别经过两种抗生素和两种醇类物质处理1h和5h后的细胞形态变化图。

图3为本发明实施例1提供的细胞分别经过两种抗生素和两种醇类物质处理1h和5h后的细胞拉曼形态变化图。

图4为本发明实施例1提供的细胞分别经过两种抗生素和两种醇类物质处理1h和5h后，对照组与处理组样本的PC-LDA Scores图。

图5为本发明实施例1提供的对照组与处理组样本分别在1h和5h平均拉曼图谱的聚类树。

图6为本发明实例2提供的细胞经过两种重金属离子处理1h和5h后的细胞形态变化图。

图7为本发明实例2提供的细胞经过两种重金属离子处理1h和5h后的细胞拉曼形态变化图。

图8为本发明实例2提供的细胞经过两种重金属离子处理1h和5h后，对照组与处理组样本的PC-LDA Scores图。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明：

本发明采用活体单细胞拉曼技术区分环境中抗生素类或醇类物质的方法中，当受刺激的细胞进行细胞收集，点CaF₂平板的时候，因为风干过程中的不确定因素，可能导致拉曼信号的不稳定，这种现象的出现，可以通过以下处理进行实现，从而得到可靠的数据，具体方法如下：点在CaF₂板子上的样本水滴保证小于2μl，不得大于4μl，这样受到风干作用的时间相对减少，并且通过增加平行样本的数目，可以保证得到可靠，重复性好的样本拉曼光谱信息。

实施例1

本发明采用一株E.coli DH5α菌株为研究对象，采用氨苄青霉素（ampicillin）、卡那霉素（kanamycin）、乙醇（ethanol）和正丁醇（n-butanol）为四类不同的刺激物对细胞进行处理，采用单细胞拉曼技术对四种物质进行区分。

1）细胞的培养

将E.coli DH5α菌株进行细胞平板划线，37℃培养约12h；而后将其转接入1～2ml的LB液体培养基中，37℃度过夜活化；

将活化后菌株按1%接种量转接入150ml LB液体培养基中，37℃，100rpm振荡培养约2.5h，此时A₆₀₀约为0.3；

而后根据图1所示，四个实验独立展开，分别采用50mg/L氨苄青霉素（ampicillin）、4.5mg/L卡那霉素（kanamycin）、5%(v/v)乙醇（ethanol）和0.9%(v/v)正丁醇（n-butanol）加入到LB培养基中对大肠杆菌细胞进行刺激处理（四种物质浓度的选择是稍大于此物质在8小时内作用于大肠杆菌的半致死浓度），其对照组分别为LB培养基中加入等体积的ddH₂O。每个处理组分别在处理1h和5h后，收集上述物质处理不同时间的菌体，而后将其各组菌体进行单细胞拉曼光谱的测量。

2）单细胞拉曼光谱测量

取上述各培养时间下培养基中添加不同物质的1ml细胞培养液，5,200rpm离心3min，收集菌体，然后采用ddH₂O轻轻悬浮洗涤后继续离心，反复两次后，采用ddH₂O进行悬浮，并采用2μl移液枪吸取洗涤好的细胞，将其置于CaF₂上，迅速风干；

将风干的细胞，通过光学显微镜系统，准确定位到细胞，采用25mW的激光进行拉曼光谱信号的采集，每个细胞的信号采集的时间为10s，对照组和处理组细胞分别设有三个生物学平行，每个生物学平行样品采集约20个细胞，则对照组和处理组细胞数目总共约60个；

采集到的拉曼光谱用LabSpec软件进行拉曼图谱的基准线归一化和最大值标准化，以及平均化处理（参见图3）。

图3所示的为四种物质ampicillin,kanamycin,ethanol和n-butanol分别处理不同时间（1h和5h）后，细胞的拉曼形态；图3A所示的是大肠杆菌细胞经ampicillin处理1h和5h后拉曼图谱的变化，上图为1h处理后的图谱，下面为5h处理后的图谱，由图可见，采用ampicillin处理1h，对照组与处理组的拉曼图谱没有非常明显的不同，证明采用ampicillin对大肠杆菌处理1h后，大肠杆菌对ampicillin的响应无法体现在拉曼图谱上；而处理5h后，对照组和处理组细胞的拉曼图谱已有明显的变化，主要体现在781cm^-1,811cm^-1,1240cm^-1,1336cm^-1,1480cm^-1,1574cm^-1等几处峰值的不同，处理组的拉曼峰值在这几处都高于对照组，可见对照组和处理组的细胞内部成分已经有明显的区别。图3B所示的为大肠杆菌细胞经kanamycin处理1h和5h后拉曼图谱的变化。同理，kanamycin与ampicillin的作用类似，同样在1h时对照组与处理组没有明显的区别，采用kanamycin处理5h后，对照组与处理组已经有非常明显的区别，且拉曼形态的不同同样主要集中在上述6处峰值处，只是程度上有所区别。图3C和图3D所示的是大肠杆菌细胞经过乙醇和正丁醇处理后细胞的拉曼图谱的变化，与之前两种抗生素对细胞的处理不同，上述六处关键峰在采用乙醇和正丁醇处理后有明显的下降趋势，而抗生素处理使得这几处的峰值相对于对照组偏高；此外，表征蛋白类物质的1605cm^-1和1614cm^-1两处峰值，在采用这两种醇类刺激细胞时也发生不同程度的变化，采用乙醇处理后，1h没有明显变化，5h后有明显的下降；而正丁醇处理1h后有明显的下降，5h后又有明显的升高。

3）拉曼光谱的多变量分析

经过LabSpec软件处理的拉曼图谱，先采用R进行PCA降维处理，然后再进行PC-LDA分析[Hu,P.,et al.,Metabolic phenotyping of the cyanobacteriumSynechocystis6803engineered for production of alkanes and free fatty acids.Applied Energy,2013.102:p.850-859.]（参见图4）。

图4显示的为对照组和处理组经过PC-LDA分析后得到的Scores图；图4A直观的显示了上述四种不同的刺激物质处理1h后的PC-LDA Scores图，图4B直观的显示了上述四种刺激物对大肠杆菌细胞处理5h后的PC-LDA Scores图；1h时，乙醇（p=6.66e-014）和丁醇（p=3.00e-015）处理能比对照组相对于ampicillin（p=2.53e-007）和kanamycin（p=1.41e-006）有更小的p值；5h时，乙醇（p=2.47e-022）和丁醇（p=5.02e-019）都有很小的p值，但抗生素中kanamycin具有更小的p值（p=8.83e-055），而ampicillin的p值（1.84e-009）则高于其他三者，证明ampicillin对于细胞的影响体现在拉曼图谱上小于其他三者。对上述拉曼数据进行多变量统计学检验并采用PC-SVM对数据进行分析，结果分别列于表1中，结果显示，四种不同物质对细胞处理5h后的p-value都小于1h处理的数据，并且采用PC-SVM进行分析，在1h时有较高的错误率，但5h时四组处理的分析错误率都为0%；

表1

通过对这四个独立实验的对照组和处理组平均拉曼光谱的简单聚类分析，可得到如图5所示的结果，在此实验中，细胞经过两种抗生素处理相比两种醇类处理来讲，有类似的拉曼形态，而根据处理时间的延长，同一类处理的内部又会呈现不同的拉曼形态，从而进一步说明外界环境的抗生素类物质和醇类物质可以通过活体细胞的单细胞拉曼技术获得区分。

实施例2

本发明采用一株E.coli DH5α菌株为研究对象，采用CuSO₄和K₂CrO₄两类不同的重金属离子对细胞进行处理，采用单细胞拉曼技术对这两种重金属离子进行区分。

1）细胞的培养

如实例1中所述，将E.coli DH5α菌株进行细胞平板划线，37℃培养约12h；而后将其转接入1～2ml的LB液体培养基中，37℃度过夜活化；并按1%接种量转接入150ml LB液体培养基中，37℃，100rpm振荡培养约2.5h，此时A₆₀₀约为0.3。

根据实例1中的实验过程，采用3.8mM CuSO₄和0.5mM K₂CrO₄，分别加入到LB培养基中对大肠杆菌细胞进行刺激处理（两种物质浓度的选择是稍大于此物质在8小时内作用于大肠杆菌的半致死浓度），其对照组分别为LB培养基中加入等体积的ddH₂O。每个处理组分别在处理1h和5h后，收集上述物质处理不同时间的菌体，而后将其各组菌体进行单细胞拉曼光谱的测量。

2）单细胞拉曼光谱测量

如上述实例1中所述，5,200rpm离心3min，收集菌体，然后采用ddH₂O轻轻悬浮洗涤后继续离心，反复两次后，采用ddH₂O进行悬浮，并采用2μl移液枪吸取洗涤好的细胞，将其置于CaF₂上，迅速风干；将风干的细胞，通过光学显微镜系统，准确定位到细胞，采用25mW的激光进行拉曼光谱信号的采集，每个细胞的信号采集的时间为10s，对照组和处理组细胞分别设有三个生物学平行，每个生物学平行样品采集约20个细胞，则对照组和处理组细胞数目总共约60个；采集到的拉曼光谱用LabSpec软件进行拉曼图谱的基准线归一化和最大值标准化，以及平均化处理（参见图7）

图7所示的为两种物质CuSO₄和K₂CrO₄分别对大肠杆菌细胞处理不同时间（1h和5h）后的细胞拉曼形态；图7A所示的是大肠杆菌细胞经CuSO₄处理1h和5h后拉曼图谱的变化。由图可见，采用CuSO₄处理1h，对照组与处理组的拉曼图谱没有非常明显的不同，而处理5h后，对照组和处理组细胞的拉曼图谱已有明显的变化，主要也体现在781cm^-1,811cm^-1,1240cm^-1,1336cm^-1,1480cm^-1,1574cm^-1等几处峰值的不同，处理组的拉曼峰值在这几处都高于对照组。图7B所示的为大肠杆菌细胞经K₂CrO₄处理1h和5h后拉曼图谱的变化。与CuSO₄的作用类似，同样在1h时对照组与处理组没有明显的区别，而5h后，对照组与处理组已经有非常明显的区别，且拉曼形态的不同同样主要集中在上述6处峰值处，K₂CrO₄对细胞的拉曼影响程度比CuSO₄大。

3）拉曼光谱的多变量分析

如实例1中所述，先采用LabSpec软件对拉曼图谱，再采用R进行PC-LDA分析（图8为分析结果）。

图8显示的为对照组和处理组经过PC-LDA分析后得到的Scores图；图8A直观的显示了上述两种重金属刺激物质对细胞处理1h后的PC-LDAScores图，图8B为处理5h后的PC-LDA Scores图；1h时，相对于对照组K₂CrO₄比CuSO₄有稍小一些的p值（3.03e-006<5.07e-004）；而5h时，相对于对照组二者都有很小的p值，同样还是K₂CrO₄更小些（9.05e-049<2.87e-031），证明K₂CrO₄的作用更明显。

由实施例1、2可知，本发明将活体单细胞拉曼技术作用在对于环境刺激物的检测方面具有其独特的优势。光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射，弹性散射的散射光是与激发光波长相同的成分，非弹性散射的散射光有比激发光波长长的和短的成分，统称为拉曼效应。根据拉曼效应的原理，拉曼效应起源于分子振动（和点阵振动）与转动。那么，环境刺激物根据其作用原理的不同，细胞会做出不同的反应来应对外界刺激，这样就造成细胞内部成分的不同，作为一个特定细胞固有属性的拉曼效应也就会不同。根据上述原理，本发明采用的活体单细胞拉曼技术可以用于检测并区分环境变化（如温度变化、渗透压变化、CO₂浓度变化、pH变化，但又不局限于此）和环境刺激物（如抗生素类、醇类、重金属类物质、药物，但又不局限于此）的方式，具有普适性，同时具有广阔的应用前景。

Claims (6)

1.一种快速区分环境中刺激（污染）物质的方法，其特征在于：将培养至对数早期的E.coli细胞加入到待区分的环境刺激物中1-5h，而后收集细胞并采集该单细胞拉曼光谱，利用细胞在不同环境中细胞内部成分发生特定变化进而产生特定的拉曼光谱的特点，区分外界环境中刺激物的类型。

2.按权利要求1所述的快速区分环境污染中刺激（污染）物质的方法，其特征在于：将培养至对数早期的E.coli细胞分别加入到处理组或对照组中处理1-5h，分别收集各处理组的细胞并采集各单细胞拉曼光谱，利用细胞在不同环境中细胞内部成分发生特定变化进而产生特定的拉曼光谱的特点，区分外界环境中刺激物的类型，其中对照组为ddH₂O溶液。

3.按权利要求1或2所述的快速区分环境中刺激（污染）物质的方法，其特征在于：所述待区分的环境中刺激物的浓度为稍大于其半致死浓度（8小时内培养）。

4.按权利要求1或2所述的快速区分环境中刺激（污染）物物质的方法，其特征在于：所述在待测区分的环境刺激物中1-5h的细胞采用ddH₂O离心洗涤3次，离心转速为5,200rpm，离心3min，离心过程要轻缓，尽量避免细胞受到强烈的刺激。

5.按权利要求1所述的快速区分环境中刺激（污染）物质的方法，其特征在于：将收集的单细胞在能量为25mW的激光下，采集拉曼光谱的时间为10-15s。

6.按权利要求1所述的快速区分环境中刺激（污染）物质的方法，其特征在于：将通过不同类型的刺激物对单细胞进行刺激，并采集刺激后的单细胞拉曼光谱，进行PC-LDA分析，并根据每组细胞平均拉曼光谱的性质进行层次聚类分析，得到直观的分类关系，用来判断环境中的刺激物的类型。