CN101036038A - 用于识别有害制剂的多模式方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过对样品进行多模式光谱分析评估有害制剂在该样品中的存在的装置和方法。披露了对于样品中表现出表征有害制剂的一种或多种光学特性的实体采用拉曼光谱学的方法。还披露了适合实施所述方法的装置和系统。

Description

用于识别有害制剂的多模式方法
技术领域
本发明总体上涉及拉曼光谱学领域。
背景技术
有害的或用作武器的化学或生物制剂的有意和无意的开发，对公共福利造成了显著威胁，正像爆炸物和辐射材料那样。这些制剂威胁人类的健康和经济情况的健全程度，并且由这些制剂造成的威胁因为检测所述制剂和作出适当反应的有限能力而复杂化。
生物武器制剂(BWA)和化学武器制剂(CWA)的大规模杀伤潜力被认为与核武器的杀伤潜力相当或者甚至更大。核武器具有影响有限区域的潜力，然而该潜力非常大，并且使用这样的武器的后果马上会显现。用BWA和CWA攻击的地理位置和边界不易于表现出来，并且可能难以在能作出有效反应的时间内识别。一旦释放出来，这些制剂可能悄无声息地并且未受抑制地传播到远离爆心投影点(ground zero)的人群。快速检测和定量化辐射(即使是极低水平)的技术可广泛地获得。不幸的是，用于检测类似水平的BWA和CWA的技术是不确定的，不能广泛地获得，并且在很多情况下，不是非常快速的。存在对用于及时检测和定量化BWA和CWA的装置和方法的显著需求。
识别生物学病原体的常规方法包括诸如特异抗体，遗传学标记，和在培养基中繁殖的方法和制剂。其中的大部分方法是缓慢的，劳动密集型的，并且取决于高度专一的分子结构的检测。使用现代化生物技术方法，可能以某种方式改变很多人类病原体(其限制传统的检测方法)，提高它们的致病性，提高它们对常规治疗的抗性，或上述特性的某种组合。随着生物技术信息变得更广泛地易于获取，工程化的BWA构成了更大的威胁。用于检测BWA的常规工具因为这种知识的传播随着时间的推移可能变得越来效果越差。
由于有意或无意地使用BWA和CWA的威胁越来越大，更加需要对能够快速和准确地在分子水平上检测(优选不接触它们)的工具。还需要这样的工具来帮助增加我们对这些制剂的生物学和化学性质以及它们对人体的潜在影响的理解。本发明满足了上述需求。
发明内容
本发明涉及一种评估有害制剂在样品，如包括多种实体的样品中存在的方法。该方法包括评估所述实体的第一种光学性质，以便选择对其来说所述第一种光学性质(例如，吸收，荧光，衍射，偏振，或显微形态)表征所述有害制剂的实体。然后评估由所选的实体散射的拉曼位移辐射。由所选的实体所表现出的表征所述有害制剂的拉曼散射特性说明在所述样品中存在所述有害制剂。在一种实施方案中，由所选的实体散射的拉曼位移辐射仅在所选的实体还表现出表征所述有害制剂的第二种光学性质时评估。
例如，可以评估样品中的实体，以便确定它们是否表现出表征所述有害制剂的显微形态和荧光特性。为了加快所述过程，可以仅对表现出表征所述有害制剂的显微形态的那些实体(例如，仅对表现出致病菌的特征形状的实体)进行荧光特性评估。对表现出两种特征性质的实体可选择拉曼散射分析，以便减少花费在更确定的、但通常更小的灵敏度的拉曼分析上的时间。
本文披露的方法可用于评估多种有害制剂的存在。这些制剂的例子包括合成的有机化学物质，生物毒素，微生物(例如，细菌和原生动物)，和病毒。
所述方法可以使用多种拉曼位移散射辐射收集系统进行。这种系统可能基于显宏镜(macroscope)、显微镜、内窥镜和光导纤维阵列的装置。本发明包括这样的装置和系统。
附图说明
本专利或申请文件包含用彩色绘制的至少一幅附图。带有彩色附图的该专利或专利申请的拷贝可以根据要求由官方提供，并且要支付必要的费用。
图1是适用于本文所披露的多模式传感和检测系统的仪器(或多种配制的仪器)的示意图。
图2是适用于本文所披露的系统中的BWA和CWA的多模式传感和检测的环境空气传感器的示意图。
图3是表示本文所披露的多模式分析方法的一种实施方案的流程图，用于识别有威胁的实体，如BWA或CWA。
图4包括图4A和4B。图4A是三种芽孢杆菌物质和吡啶二羧酸的拉曼光谱的曲线图。图4B是炭疽芽孢杆菌的显微图像。
图5包括图5A，5B，5C，和5D。图5B是在样品的显微视场中多个实体的彩色图像。图5A表示通过分析存在于样品中的物质获得的拉曼光谱，所述样品在图5B所示的视场中进行成像。在图5A中，″S1″是克虏伯氏芽孢杆菌的拉曼光谱，对应在图5B和5C中用标记″1″表示的实体；″S2″是蛋白的拉曼光谱，对应在图5B中用标记″2″表示的实体；和″S3″是土曲霉孢子的拉曼光谱，对应在图5B和5D中用标记″3″表示的实体。图5C是表示在2950cm-1(±15cm-1)的RS值下检测的拉曼散射辐射的单色图像。图5D是表示在3050cm-1(±15cm-1)的RS值下检测的拉曼散射辐射的单色图像。
图6包括图6A，6B，和6C，表示在短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合物中不同的芽孢杆菌物质的荧光光谱差异和识别。图6A和6B表示在不同的荧光波长下评估的所述混合物的同一视场的图像。图6C表示短小芽孢杆菌的荧光光谱特征(它在图6A中发出荧光)和枯草芽孢杆菌的荧光光谱特征(它在图6B中发出荧光)。
图7包括图7A，7B，7C，7D，和7E，表示炭疽芽孢杆菌与生长培养基和福尔马林的混合物的单一视场的多模式分析。图7A是明视场光学反射显微图像。图7B是拉曼化学图像。图7C是所述视场的荧光图像。在彩色的图7D和7E中，图7A的明视场图像与图7B的拉曼化学图像组合(参见图7D)或与图7C的荧光图像组合(参见图7E)。
图8包括图8A，8B，8C，和8D，表示将荧光感测技术应用在商业化显宏平台(CONDOR(TM)macro imaging system，ChemImageCorp.，Pittsburgh，PA)上，用于检测与信封外面的碳酸氢钠混合的克虏伯氏芽孢杆菌的孢子。图8A表示该实验的配置。图8B和8C表示克虏伯氏芽孢杆菌孢子本身的荧光图像(图8B)和信封上与碳酸氢钠混合的克虏伯氏芽孢杆菌的荧光图像(彩色图8C)。图8D表示碳酸氢钠(图8C和8D中的Pt1)，克虏伯氏芽孢杆菌孢子(图8C和8D中的Pt2)，和信封(图8C和8D中的Pt3)的荧光光谱特征。
图9是在pH8.0的缓冲液中用FITC标记的山羊抗小鼠IgG的吸收和荧光发射光谱。
图10示意性地表示根据本发明一种实施方案的装置。
图11示意性地表示根据本发明另一种实施方案的装置。
具体实施方式
本发明涉及评估有害制剂在样品中的存在的方法，特别是应用于当所述样品除了含有所述有害制剂以外的多种实体时(例如，瓦砾，烟灰，灰尘，非致病微生物，和动物毛屑)。从各种环境中收集的样品(例如，室内和室外环境空气样品，土壤样品，以及未知粉末)通常包括颗粒状实体，这些实体具有与有害制剂相同的某些特性，并且识别和/或定量化样品环境的有害制剂会由于在样品中所述实体的明显的相似性而明显复杂化和缓慢。在需要快速检测有害制剂的场合下，传统的快速显微和荧光分析方法通常表现出灵敏度不够，不能有效识别有害制剂和区分有害制剂和其他实体。
拉曼光谱学可用于评估样品中所有实体的拉曼散射特性，以便识别表现出表征所述有害制剂的拉曼散射特性的实体。对于能够从拉曼散射特性辨别的信息的数量和类型来说，这些特性对于识别样品中的有害制剂通常具有很高的信息价值。不过，由于多种因素(例如，较弱的信号强度，背景荧光的频繁出现，以及拉曼散射分析设备的较慢的运行)，用于获得样品中所有候选实体的资料性拉曼散射信息所需要的时间可能超过了样品分析有效或适当时间，特别是在需要快速分析时。
本文披露的方法通过采用更迅速的光学分析方法(例如，显微和/或荧光分析)能够更迅速地对样品中潜在的有害制剂进行拉曼散射分析，以便排除没有表现出表征有害制剂的光学特征的拉曼散射分析实体。
本文披露的方法，包括评估样品中所述实体的第一种光学性质。因此可以选择对其来说第一种光学性质表征所述有害制剂的实体(即，与作为所述制剂的实体吻合)。随后可以评估由这些所选的实体中的一种或多种散射的拉曼位移辐射。对其来说第一种光学性质未表征所述有害制剂的实体可以从拉曼散射分析中排除，避免了浪费时间和计算资源，从而避免将时间和计算资源花费在对这些非特征性实体进行拉曼散射分析上。表现出表征所述有害制剂的第一种光学性质和拉曼散射特性的实体在样品中的存在表明该样品包括所述有害制剂。
在一种实施方案中，在拉曼散射分析之前评估了样品中实体的至少两种光学特性，并且仅对对其来说所述每一种光学特性表征了有害制剂的实体进行这样的分析。当在拉曼散射分析之前对两种或两种以上光学特性进行评估时，未能表现出表征所述有害制剂的任何光学特性的实体可以从拉曼散射分析的实体中排除。因此，一种实体如果没有表现出表征所述有害制剂的第一种光学性质，就使得没有必要分析该实体的第二种及随后的光学性质。就第二中或接下来的光学性质的评估需要额外的分析和处理时间来说，整个工艺的速度可以通过从进一步分析中排除没有表现出所述有害制剂的甚至一种光学性质的实体而加快。另外，可以评估样品中的实体的两种或两种以上光学特性，并且可以对表现出表征所述有害制剂的至少一种光学性质的每一种实体进行拉曼散射分析。
定义
在本文中，下面的每一个术语具有本节中与它相关的含义。
“带宽”表示辐射束中波长的范围，正如使用半峰全宽方法评估的。
检测器或其他系统的“带通”表示所述检测器或系统能够区分的波长范围，正如使用半峰全宽强度法评估的。
“半峰全宽”(“FWHM”)法是一种通过识别连续波长的范围来表征包括一定范围波长的辐射的方法，即在单一波长下的辐射中，在该波长范围内，某一特性的值(例如，强度或检测能力)等于所述特性的最大值的至少一半。
“有害制剂”是能够对诸如人类的动物造成疾病、损伤、不适、痛苦或死亡的物质(例如，化学、生物、放射性、或爆炸性材料)。
“光谱分辨率”表示辐射检测系统分辨两种光谱峰的能力。
术语“光学的”和“光谱的”在本文中可以交换使用，用于表示材料的特征(以及评估所述特性的方法)。术语“光谱的”一般被理解为表示电磁辐射、电子或中子与所述材料的相互作用。术语“光学的”通常表示与电磁辐射的相互作用。例如，尽管电子显微术并非被认为是“光谱的”或“光学的”方法，这两种术语在本文中都用于包含电子显微术和评估材料与可见、紫外或红外光、与中子、或与其他辐射的相互作用的其他方法。
详细说明
本文披露的方法包括评估样品中所述实体的第一种光学性质。选择对其来说第一种光学性质表征了有害制剂的实体(即，与作为有害制剂的实体吻合)。然后评估由这些所选的实体中的一种或多种散射的拉曼位移辐射。可以从拉曼散射分析中排除对其来说第一种光学性质未表征所述有害制剂的实体，从而避免了浪费时间，否则，这些时间将花费在对非特征性实体进行拉曼散射分析上。表现出表征所述有害制剂的第一种光学性质和拉曼散射特性的实体在样品中的存在表明该样品包括所述制剂。
可以评估样品中所述实体的至少第二种光学性质。那些未表现出表征所述有害制剂的第一和第二种光学性质的实体没有必要进行拉曼散射评估。排除未表现出有害制剂的快速评估的光学性质的实体可以减少用在对非有害制剂的实体进行拉曼散射分析所花费的时间，从而提高了该分析方法的总体速度(即，处理量)。可以评估样品中实体的三种，四种，五种或更多种光学特性，以便选择适合拉曼散射分析的实体，不过，这些额外的评估可能增加了所述系统的复杂性，成本，和计算能力要求。对于大多数目的来说，一种和两种光学特性被认为足够鉴别所用。
在一种实施方案中，将显微方法用于评估样品中实体的形态(即，大小、形状、排列或它们的某种组合)。选择具有表征所述有害制剂的形态的实体(例如，致病菌的形状或链结构)作进一步分析。通过荧光光谱学或荧光显微术评估表现出与有害制剂一致的形态的实体。选择表现出有害制剂的荧光特征的实体(即，表现出荧光或磷光发射的特有的波长、强度或延迟)进行拉曼散射分析，并且不再对没有表现出表征所述有害制剂的荧光的实体进行分析。因此，仅对表现出表征所述有害制剂的形态和荧光的实体进行拉曼散射分析。表现出表征所述有害制剂的拉曼散射特性(例如，特征性拉曼位移和特征性拉曼光谱中的一种或两种)是所述实体是或包含所述制剂的标志。采用这种方法，能够快速地检测有害制剂在样品中的存在。该实施方案在图3中的流程图中示出。
在另一种实施方案中，可以使用荧光显微或光谱方法选择候选实体作进一步的显微形态分析。可以选择样品中表现出表征所关注的有害制剂的荧光和形态特征的实体进行拉曼散射分析。
进行本文所披露的光学分析方法的顺序不是关键的。不过，为了减少拉曼散射分析所需要的时间，所述分析的至少一部分应当在业已通过其他更迅速的分析方法(例如，显微形态分析和/或荧光分析)对样品中实体进行分析并且证实表现出与所述有害制剂的光学特性吻合的光学性质之后进行。例如，光学分析方法可以顺序进行(例如，首先在包括样品的显微视场中评估所有实体的显微形态，然后评估所述视场中所有实体的荧光发射，随后评估所述视场中表现出有害制剂的形态和/或荧光特征的实体的拉曼散射)。任选地将所述分析方法的两种或两种以上进行平行操作(例如，可以同时评估显微视场中的实体的显微形态和荧光发射)，随后可以对所选的实体进行拉曼散射分析，例如，使用适合同时从样品中收集信息的多个检测器。同样可以进行顺序组合和平行操作，以便提高该方法的速度。
本文披露的方法克服了现有技术的单一模式分析方法的缺陷。依赖于单一光学检测策略的技术可能表现出高比例假阳性检测结果。这种假阳性结果的频率可能根据被分析的材料而有很大变化。其他人为了克服这些缺陷所做的努力往往解决所使的个别方法中的灵敏度的个别缺陷或特定光学方法的具体局限。本文披露的方法对所采用的光学分析方法的局限不太敏感，因为一种检测方法的局限可以被所采用的其他光学检测方法识别和补偿。同时使用本文披露的检测方法，准确识别样品中的目标所需要的时间可以显著减少。另外，仔细选择一种或多种检测方法、照射波长、照射辐射的偏振、波长特异性光学元件以及仪器设计可以减少或消除所采用的检测方法之间的干扰。合适参数的选择取决于要评估的样品和目标，并且属于本领域技术人员的知识范围。
拉曼光谱学
拉曼光谱学提供了有关分子振动状态的信息。很多分子具有能够以多种振动状态存在的原子键。这种分子能够吸收与它的两种可能的振动状态之间的跃迁吻合的入射辐射，并且随后发射所述辐射。最常见的是，被吸收的辐射以相同的波长被再辐射出去，这一过程被称作瑞利或弹性散射。在某些场合下，被再辐射的辐射可能包含比所吸收的辐射略高或略低的能量(取决于所述分子允许的振动状态和起始和最终振动状态)，入射辐射和被再辐射的辐射之间的能量差异的结果表现为入射和被再辐射的辐射之间的波长漂移，并且差异程度被称为拉曼位移(RS)，以波数为单位衡量(波长的倒数)。如果入射光基本上是单色的(单一波长)，当使用激光光源时，波长不同的散射光可能更容易与瑞利散射光区分。
由于拉曼光谱学是基于样品的辐照和散射辐射的检测，它能够以非侵入性和非破坏性方式使用，因此，它适合原位分析生物样品。需要很少或不需要样品制备。另外，水表现出非常小的拉曼散射，并且拉曼光谱学技术可以方便地在含水环境中进行。长时间照射样品，可能导致样品中分子的光漂白，这有可能导致在照射终止之后荧光强度的时间依赖性的波动。对样品进行超过几秒钟的低能量，广视场照射，基本上能够完全使整个样品漂白，使得可以在克服非波动背景的情况下进行拉曼和其他测量，与现有技术中披露的扫描拉曼光谱测量相反。
一种材料的拉曼光谱能够揭示该材料的分子组成，包括存在于有机和无机分子上的特殊的官能团。拉曼光谱学可用于检测有害制剂，因为大部分，如果不是全部的话，有害制剂表现出特征性‘指纹’拉曼光谱，遵守各种选择定则，通过这些定则可以识别所述制剂。可以将多种拉曼散射特性，如拉曼峰值位置，峰形，和对选择定则的依从性，用于确定分子身份，并且用于确定固体材料的构象信息(例如，身份，生活力(viability)，晶相，有序度，应力，粒度)。
在过去几年中，业已将多种关键技术引入到广泛的用途中，从而使得科学家能够在很大程度上克服拉曼光谱学所固有的问题。这些技术包括高效率固体激光器，高效率激光拒波滤光器，和硅CCD检测器。一般，用于照射样品的光的波长和带宽不是关键的，只要该系统的其他光学元件在与光源相同的光谱范围内工作就行。
由于拉曼散射峰不取决于照射源的波长，用于辐照细胞的光的波长不是关键的。可将小于700纳米(例如，350-695纳米)并且有可能低至大约220纳米的照射波长用于拉曼散射分析。例如，532纳米的照射波长是合适的。
由于已知散射光的强度取决于辐照光的频率(即，波长的倒数)的四次方，并且仅仅与辐照光的强度成正比，降低辐照光的波长可能具有加强散射信号输出的作用，即使辐照光的强度减弱。因此，即使在稳定照射的条件下，如果小心控制辐照光的强度的话，细胞可以在辐照中存活。如果采用间歇性的或非常短时间的辐照方法的话，可以使用较短波长进行辐照(例如，＜大约500纳米，如220-280纳米的波长)，而不会伤害受辐照的细胞。如果在检测时间以外样品中目标(例如，细胞、病毒或毒素颗粒)的存活不是重要的并且只要保留了拉曼信号就行的话，那么辐照光对有害制剂的影响没有必要考虑。不过，在很多场合下，优选地通过用波长和强度低于所述目标的损伤阈值的辐射照射所述样品，保持样品中目标的完整性。另外，生物样品中的背景荧光一般可以通过增加照射辐射的波长而被减弱。
为了检测拉曼散射光，并且精确地确定光的拉曼位移，应当用基本上为单色的光，如带宽不超过大约1.3纳米，优选不超过1.0、0.50或0.25纳米的光辐照样品。合适的光源包括各种激光器和多色光源-单色仪组合。可以理解的是，辐照光的带宽、波长分辨元件的分辨率和检测器的光谱范围确定了观察、检测到的光谱特征的结果或与其他光谱特征区分的情况。这些元件(即光源、滤光器、光栅或通过波长区分拉曼散射光的其他机构)的组合特性决定了拉曼信号检测系统的光谱分辨率。这些元件的已知关系使得本领域技术人员能够方便地以可预测的方式选择合适的元件。系统在光谱分辨率方面的限制(例如，与辐照光的带宽相关的限制)可能局限了分辨、检测或区分光谱特征的能力。本领域技术人员理解拉曼散射信号的分离和形状能够确定以及如何确定用于本文所披露的任何拉曼光谱特征的系统的光谱分辨率的可接受限度。
照射区域可被划分成多个相邻的、不相邻的或重叠的点，并且可以在每一个点上进行拉曼散射分析的评估。这些点可以顺序扫描(即，通过扫描)或平行评估(例如，使用液晶可调谐滤光器在所选的RS值在各个点评估拉曼散射，然后使用该滤光器在所选的第二个RS值进行)。为了实施扫描策略，在所需要的时间和所生成的光谱图谱(map)或图像的空间分辨率之间存在固有的折中。每一个完整的光谱花费一定时间来收集。在样品的每单位面积上收集的光谱越多，所述光谱图谱的可见分辨率越高，不过数据获取花费的时间越长，在视场的栅格上进行单个点的测量还会产生取样误差，这使得难以或不可能形成高清晰度图像。除了扫描样品之外，还可以对像场中的所有点平行(即同时)进行拉曼散射评估。这种所有点的平行处理称作拉曼化学成像，并且这可能需要大量的计算时间和能力。
拉曼化学成像所需要的计算和分析资源可能是成本高昂的和笨重的。在以下文献中业已披露了拉曼化学成像的装置，Treado的美国专利6,002,476和申请日为2000年7月19日的美国专利申请09/619,371，以上文献被收作本文参考。拉曼化学成像的其他描述为：申请日为2001年3月7日的美国专利申请09/800,953；申请日为2001年10月21日的美国专利申请09/976,391；申请日为2002年6月27日的美国专利申请10/185,090；申请日为2002年6月27日的美国专利申请10/184,580；申请日为1999年7月19日的美国临时专利申请60/144,518；申请日为2002年1月10日的美国临时专利申请60/347,806；申请日为1999年7月19日的美国临时专利申请60/144,518；申请日为2000年3月28日的美国临时专利申请60/187,560；申请日为2000年11月13的美国临时专利申请60/239,969；申请日为2001年6月28日的美国临时专利申请60/301,708；和申请日为2002年11月21日的美国临时专利申请60/422,604。可以将多种已知方法中的任一种用于使在任何特定的点或平均面积上的获得的拉曼光谱与参考光谱关联。例如，可以使用标准光谱库比较方法来识别出现在样品中特定位置上的成分。另外，在申请日为2004年3月29日的美国专利申请10/812,233中披露的光谱分离方法可用于识别出现在样品区域上的多种成分。上述每一件专利和专利申请均被收作本文参考。
在本文披露的方法中，通过首先评估表现出表征所述有害制剂的一种或多种光学特性的视场部分，可以选择视场中样品的所述部分进行拉曼散射分析。对图像中的多个点进行取样，使得可以观察拉曼光谱的变化，并且相应于所述点，对所述样品的各个部分中所存在的成分进行区分。这样，用于评估有害制剂在样品中的存在所需要的处理时间和资源可以降低或最小化。例如，利用在图5A中所示出的拉曼光谱，通过拉曼散射分析评估在图5B中所示出的图像区域，以便识别相应的实体。
尽管一般可以在各种表面上将拉曼光谱学应用到样品上，但是，某些基片材料相对其他材料而言是优选的。理想的基片是光学平的、拉曼无活性的(即，表现出小的或没有拉曼散射)、非荧光的，并且能够承受较大的激光功率，而又不会表现出热膨胀。玻璃型基片是廉价的，常见的，并且便于获得的。不过，某些玻璃表现出很强的叠加在拉曼光谱上的荧光发射。尽管可以从样品光谱中扣除拉曼信号，这种扣除导致了对所获得信号的噪声。另外，在存在具有低拉曼散射截面的样品的情况下(例如，少量的BG孢子)，强的背景信号(例如，可归于玻璃荧光的信号)可能掩盖可归于样品的拉曼信号。在这种情况下，可能难以扣除背景而揭示样品信号。熔融石英(即光学级石英)是通常被拉曼光谱学家所采用的替代品，因为它没有表现出玻璃的明显的荧光背景。熔融石英还是无色的和透明的，可以进行传统的透射光学观察。熔融石英表现出必须从最终光谱中扣除的有限的拉曼信号。尽管这种方法带来某些信噪比问题(例如，在非常低的拉曼散射截面的情况下)，相对玻璃型基片而言，较低的背景信号减弱了背景信号掩盖样品信号的问题。
优选的基片是氧化铝型过滤器(例如，ANODISC(RTM)牌氧化铝滤膜，可获自Whatman PLC，Brentford，Middlesex，UK)。ANODISC(RTM)过滤器表现出较弱的拉曼信号，是非荧光的，并且可以承受较大激光功率密度，而又不会发生热膨胀。所述基片的某些残余的光谱特性需要校正步骤以从总体样品光谱响应中扣除它的信号，不过，这可以通过已知方法实现。另一种优选基片，特别是用于环境空气取样的基片，是微孔均匀沉积撞击器(MOUDI(TM)，可获自MSP Corporation，Shoreview，MN)。该装置表现出有利的背景特性。MOUDI(TM)取样器收集环境颗粒材料，并且将所述材料沉积在平的、光滑的铝箔基片上，同时满足了拉曼和扫描电子显微镜和能量色散光谱测定。
其他光学和光谱方法
可以将多种方法中的一种或多种用于识别应当进行(或相反不必进行)拉曼散射分析的样品区域或样品中的实体。优选的是，用于这一目的的光学或光谱方法可以明显比拉曼散射分析进行得更快。合适方法的例子包括吸收、荧光、衍射、偏振和显微方法。在一种实施方案中，通过辐射照射所述样品(或至少照射样品的视场)，所述辐射可用于一种以上光学和/或光谱方法(例如，用于拉曼散射、荧光光谱和光学显微术的入射激光)。合适的显微方法的例子包括扫描电子显微术、微分干涉对比显微术、明视场反射显微术、偏振光显微术和荧光显微术。可以将显微方法用于评估样品中的实体的形态。
在荧光光谱学中，光子是在吸收光子的激发步骤之后从材料中发射出来的。实验通常包括多色激发源，如汞(Hg)或氙(Xe)灯或单色光源，如发光二极管(LED)或激光器，其用于样品激发。然后可以将一部分被发射的辐射导入色散单色仪，在它上面连接有诸如CCD的检测器。通过测定材料的荧光光谱，人们可以推测出来自无机和有机物质的定性和定量化信息。与拉曼光谱学比较，荧光本身更为灵敏。十亿(billion)分之几的检测极限是常见的。另一方面，荧光的选择性比拉曼低，并且只有有限数量的化学系统表现出荧光。尽管如此，荧光分析能够比拉曼散射分析更快速地进行。
荧光分析可以区分生物和非生物材料，这对于识别样品中的非生命实体来说可能是有利的。如果需要检测有生命的有害制剂(例如，致病菌或真核生物)或病毒制剂，与较缓慢的拉曼散射分析相比，荧光分析是排除样品实体的合适的方法。用于生物材料荧光分析的合适参数是已知的。例如，这些参数描述在Pinnick等人的(1999，FieldAnal.Chem.Technol.3：221-239)中。
分子UV/可见光和NIR吸收光谱法分别涉及UV/可见光(185-780纳米(54,054-12,800cm-1))和NIR(780纳米-2.5微米(12,800-4,000cm-1))光谱范围内的光子的吸收。典型的仪器包括多色光源，如氘或石英卤钨灯，色散性元件，如单色仪或干涉仪，以及检测装置，如硅CCD或InGaAs焦平面阵列检测器。对于本文所披露的其他光学方法来说，应当选择照射辐射的波长和强度，以便避免不可接受的样品或目标降解。较长的波长，如NIR辐射，可以增强对样品的穿透，使得可以分析非表面材料。
基于UV-可见光或NIR辐射的吸收测量具有许多种用于定性和定量测定无机和有机化学物质的已知用途。NIR光谱来自基本中-红外光(MIR)频带的谐波和组合频带。与荧光类似，吸收光谱法是高灵敏度的，不过只具有中等选择性。吸收现象还可以产生有关存在于样品中的材料的化学身份的信息。就所关注的目标的特殊吸收信息是已知的来说，对样品所吸收的辐射的分析可以提供有关在样品中存在所述目标的消息。吸收光谱学对于识别没有必要进行拉曼散射分析的实体来说是一种有用的方法。相反，吸收光谱学可用于识别应当进行拉曼分析的样品区域或样品中的实体。
通过使用成像光谱仪，如液晶成像光谱仪，可以将光谱方法延伸应用到成像技术中。这种技术在近几年中的发展已使得光谱成像发展并且成熟。
光谱成像是一种通用技术，它非常适合分析复杂的非均质材料。光谱成像的应用遍及聚合物混合物的分析、半导体材料的缺陷状态分析、人类乳腺组织中的包含体(inclusion)分析、表征腐蚀样品以及检测和分类并识别BWA和CWA。光谱成像提供了获得有关BWA和CWA的分子组成和形态的定性和定量图像信息的有效手段，使得能够比传统成像或‘潮湿’化学方法更准确、更快速地进行分析。
光学和荧光显微术技术非常适合识别样品中表征或不表征某些有害制剂的实体。例如，很多细菌、细菌孢子、真核细胞和病毒具有特征性大小、形状或排列(例如链、片或组)。显微方法可以快速进行，并且可以使用已知的方法快速分析由此获得的结果，以便在视场中评估实体的大小、形状、排列或其他形态特征。因此，显微方法适用于评估样品中的实体的光学特性，以便将不具备表征所述有害制剂的形态特性、荧光特性或这两者的实体从拉曼散射分析中排除。还可将相同的方法用于识别应当进行拉曼散射分析的实体。
图4B表示含有炭疽芽孢杆菌的样品的典型的放大示意图。所示出的光谱包括对应于炭疽芽孢杆菌的拉曼光谱。炭疽芽孢杆菌的光谱和其他芽孢杆菌物质的光谱之间明显的差异表明了在含全部三种样品的样品中炭疽芽孢杆菌可以与那些物质区分。这可以通过以下方法实现：i)通过可见光反射显微术分析显微视场中的样品，以便识别具有表征芽孢杆菌的大小、形状或这两者的实体(即，具有特征性尺寸的椭圆(oblong)形)；ii)对这些实体进行分析，以便了解哪些发出荧光(例如，使用波长为365纳米的激发辐射，并且评估可见荧光)并因此有可能是生物体；和iii)分析个别发出荧光的芽孢杆菌-大小和/或-形状的实体的拉曼光谱，根据与已知拉曼光谱(如在图4A中所示出的那些)的相似性确定所述实体的身份。所述拉曼光谱学步骤可以这样进行：评估在对应于所述实体的单象素下散射的光，评估由对应于所述实体的一组像素散射的光，或评估由包括部分或全部所述实体的一个或多个区域散射的光。
区分可疑实体与其他实体
本文披露的方法相对上述拉曼光谱分析方法的显著优点在于，通过将样品中没有表现出有害制剂的一种或多种光学特性的实体从拉曼分析实体中排除可以显著缩短拉曼分析所需要的时间。对图像中的多个点进行取样，使得可以观察拉曼光谱的变化，并且相应于所述点，对所述样品的各个部分中所存在的成分进行区分。获取每一个位置上的拉曼散射数据，并且分析图像中每一个点的光谱，需要明显较长的时间。因此可以将设备功率和计算资源集中在最有可能包含有害制剂的样品区域。
本文披露的方法适合于自动化，就是说，光学特性和拉曼光谱的分析可以使用计算机软件完成，也可以人工完成。基于相应于视场中的特定位置的单一光学特性的光场的表征(即，在所选的波长下的吸收的图像分析)是本领域的常规技术。例如，在一种实施方案中，如果要分析有或没有细菌孢子，那么荧光的评估应当通过分析光场的离散区域进行，所述离散区域的大小不超过单个孢子截面积的2、3、5、10或25倍。另外，例如，细菌及其孢子的特征性尺寸通常在一至几个微米的数量级上，病毒的特征性尺寸在数十至数百纳米的数量级上，而真核细胞的特征性尺寸在十微米的数量级上。可以将多种已知的数字图像处理技术中的任一种用于表征可见光或荧光显微视场中实体的大小、形状和空间分布。包括生物毒素在内的化学制剂的特征性尺寸取决于它们的聚合、结晶或其他相关特征。分析物特征性大小可能还取决于除了分析物本身以外的样品成分。
广视场拉曼散射分析也适合作为一种识别准许(warrant)更高清晰度拉曼散射分析的光场区域的方法。当相应于评估拉曼光谱的点的样品区域比分析物或含有分析物的颗粒的特征性尺寸大得多的时候，仍然可以使用本文披露的方法。在这种情况下，用该方法获得的结果可以表明所述分析物在样品的某一区域的存在，而不能精确指明所述分析物的离散颗粒的位置。一旦被识别，就可以对样品的这些区域进行进一步分析。本领域技术人员了解如何根据预期的分析物选择合适的点的大小。
多模式光谱传感可以基本上使用任何光学或光谱方法用于识别样品区域或样品内的实体，这些区域或实体不准许(warrant)更详细和费时的拉曼光谱分析。所述方法的例子包括荧光、UV/可见吸收/反射、NIR吸收/反射和广视场拉曼光谱学。通过重叠、叠加，或组合由上述光谱方法获得的光谱信息，可以在所述图像上产生对比度。这些不同信息集合(set)的显示和/或关联在本文中被称作图像融合。由于生成了每一个评估部位的光谱，诸如相关分析、主成分分析(PCA)和因子旋转的化学计量分析工具，包括多变量曲线分辨(MCR)，可应用于所述图像数据以便提取相关的信息，这些信息在分析普通的单变量参数时可能不够明显。
根据所使用的材料和光谱方法，通过采用不同的激发波长或通过在焦点的增量平面上获取光谱图像还可以获得与深度相关的信息。因此，根据照射的穿透能力和检测的波长，可以使用这些方法评估目标物(例如，小瓶、信封或手提箱)的内含物。
业已证实了使用可见激光波长利用商业化设备的拉曼光谱成像的空间分辨能力为大约250纳米。这几乎比红外成像高两个数量级，例如由于衍射，后者的分辨率通常局限于至少20微米。
将NIR辐射用于多模式光谱传感的优点是，它的穿透深度比可见光大，因此使得人们能够探测纸张或塑料信封或塑料或玻璃容器的内部，例如检测容器中的有害制剂。没有完全吸收入射辐射的任何容器都可以使用NIR多模式光谱传感方法检查。
在样品中区分潜在的有害制剂和其他实体的另一种方法是在单一的表征所述有害制剂的拉曼位移波长下评估拉曼散射辐射。可以选择散射出具有表征所述有害制剂的拉曼位移的辐射(相对入射辐射)的样品区域作更详细的拉曼光谱分析。因此，在一种实施方案中，样品的评估是这样进行的：识别显微视场的一个或多个部分，从这些部分发出了表征所关注的有害制剂的拉曼散射辐射，然后评估这些部分的拉曼散射光谱。当然，还可以使用其他光学方法(例如，光学显微术或荧光光谱，如上文所述)扫描这些部分，以便减少所述部分(为这些部分收集拉曼光谱)的数目，并因此加快处理的速度。
图像融合
通过本文所披露的两种或两种以上光谱方法获得的光谱信息可以结合起来并作为单一的数据集合保存、显示或同时进行这两种操作。例如，可以放大从样品中检测到的拉曼-散射光(或使其伪色)，并且与该样品的可见显微图像一起显示。另外，由该样品发射的荧光可以在同一图像中显示。
通过两种或两种以上光谱方法从单一视场获得的光谱信息的融合，需要将由每一种方法获得的信息映射到数据集合的相同的或重叠的元素上。例如，通过显示具有已知的彼此相对的关系的多个像素可以形成可见图像。对于要在图像中表示它的信息的每一种光谱方法来说，从样品的某一部分获得的光谱信息必须被映射到相应于该部分的像素上。通过由在像素上显示的光的独立变量表示每一种光谱测量，可以将来自不同光谱方法的信息显示在相应于该样品的相同部分的像素中。例如，可以如下生成基于亨特(Hunter)色度的彩色图像(对于图像的每一个像素)：i}在亨特色度上将由可见光显微术评估的亮度表示为发光度(L)；ii}在亨特色度上将由荧光光谱评估的在特定波长下的荧光强度表示为红色(red-ness)(a)；和iii}在亨特色度上将在所选的RS值处的拉曼-散射光的强度表示为黄色(yellow-ness)(b)。这种显示方法仅是一个例子。在单一图像或数据结构中表示独立数据集合的任何方法基本上都可以使用。重要的是，通过多种光谱方法从样品的离散部分获得的光谱信息可被映射到其所获自的样品部分，并且保存或显示该信息的方法保留了这种映射，以便所述部分的不同的光谱特性可以相关联。
实施例
下面将结合以下实施例描述本发明。这些实施例仅仅是为了说明目的提供的，并且，本发明并不局限于这些实施例，相反，它包括由于本文中所提供的教导而显而易见的所有变化形式。
快速有害制剂检测系统
在阅读本说明书之后利用普通技能就可以制作出具有图1所示结构的有害制剂检测系统。可以使用这些系统或按本文所述进行改进，以便满足用于多模式光谱分析的本文披露的方法的设备要求。所述结构可以包括基于显微镜、显宏镜、内窥镜、纤维阵列光谱转换器(FAST)或环境(例如，空气或水)取样器设计的平台。其中的每一项在以下说明中概述。
在图1中，激发源110、120、130和140(相应于近红外，红外、可见和紫外光源，可以存在它们的任意组合)提供了入射辐射，通过输入传递光学元件200将它导向位于样品管(sample cell)210中的样品。样品管210可任选地与该装置的一种或多种其他元件整合，如输入传递光学元件200。这种整合的样品管可以作为一次性(即，用后即可丢弃的)样品容器，可以将这些容器丢弃、焚烧或存档。所述激发源可以基本上是任何已知的辐射源，包括多色光源，如钨或汞弧光灯，以及基本上单色的光源，如激光器。
使用所选的输出传递光学元件220收集由样品中透射的或被样品反射、折射、发射或散射的辐射，该元件的位置适合要收集的辐射。将收集的辐射导向合适的检测器，并且通过数据记录电路或装置获取所述检测器(提供所收集的辐射的信息)的输出；所述数据记录电路或装置可以是与所述检测器在机械和/或电学方面一体化的(如在图1中所示出的集成的光学检测器和数据收集子系统300)。
优选将检测器收集的数据输入计算机450内的或与它连接的数据分析子系统400。计算机可以用控制照射、数据收集和样品定位等的软件操作，并且这些软件属于本领域技术人员知识范畴，可以通过商业渠道获得。计算机优选将输入410、显示420(例如，可视显示器器，如视频显示终端或可打印的图像)和数据储存430的功能与所述光学装置连接起来，并且还优选能够以用户方便的方式格式化输出/结果500。例如，在用于检测连续输入样品管210的样品收集基片上的有害制剂的系统中，在一段给定时间内，当具有表征所关注的有害制剂的拉曼光谱时，计算机450可方便地提供输出500，它表明了在所述基片上检测到的实体的数量。另外，如果在一段时间内(或在多个连续的时段期间)，有害制剂实体的数量(例如，致病微生物或化学制剂出现的区域)超过预定值时，输出500可启动报警电路。另外，可以显示由检测器收集的数据，以便由用户分析，并且可以由用户选择要进行拉曼散射分析的样品部分。
适用于一种或多种平台的可以通过商业渠道获得的装置的例子是实验室或便携式野外(field)拉曼显微镜，如FALCON拉曼显微镜(TM；ChemImage Corporation，Pittsburgh，PA)，或ChemImageCorporation EAGLE(TM)野外硬化(field-hardened)设备，供应商为该仪器配备了同时成像和光谱学装置以便与所述设备一起使用。构成所述系统的基础的合适设备的另一个例子是紫外(UV)/可见(vis)/近红外(NIR)荧光或拉曼显宏镜，或UV/Vis/NIR/Mid-IR(中-红外)吸收/反射显宏镜系统，如CONDOR显宏镜(TM；ChemImage Corporation，Pittsburgh，PA)。另一种合适的装置是实验室或野外纤维镜，如RAVEN内窥镜(TM；ChemImage Corporation，Pittsburgh，PA)。其他合适的装置披露于美国专利6,002,476中。上述任何装置可以单独使用或与其他光学元件一起使用，如实验室或野外纤维阵列光谱转换器(FAST)探针。上述每一种应用模式可以单独使用或者相互组合使用，以便获得需要的速度和结果。
例如，通过组装若干部件可以制成空气取样生物威胁检测器。可以将取样器或收集元件用于从空气样品中获取颗粒和/或气溶胶。可以将收集的颗粒沉积在合适作为拉曼和其他光学分析的基片的表面上。所述表面可以是连续的材料片，其被推进，不断地、间断地、或根据需要在本文所披露的光学检测系统前面。在沉积到所述基片上之前，可任选地分选所述颗粒(例如，静电分选)。使用光学检测系统(例如，光学显微术确定颗粒形态，荧光成像确定生物或非生物源，和拉曼光谱学或成像识别特定的实体，它是通过光学和/或荧光分析识别为可疑的)获得的结果可以被记录、传输或用于进行逻辑运算(例如，在检测到所关注的目标时发出报警)。
可以通过使用机器人或组合的显宏/显微设备使这些系统自动化，以便靶定所关注的分析物。例如，通过激光消融和/或化学消融，可以使该系统自动化来消除靶定后的有害制剂。这种系统应当提供快速的获取时间(在秒的数量级上)、高的空间分辨率(亚微米级)和良好的光谱分辨率(＜200纳米)。
显微镜型系统
多模式光谱成像显微镜在单一平台上组合了用于样品激发(例如，用于拉曼和激光诱导的荧光)的固体激光器、折射光学显微镜座(装配有无限校正的显微镜物镜)、自动化XYZ平移显微镜台、和石英钨卤(QTH)灯和/或汞(Hg)灯。另外，所述显微镜系统的一部分是模拟彩色电荷耦合装置(CCD)检测器(用于普通的光学图像收集和数字图像收集)、液晶光谱仪或其他多点光谱仪技术(包括AOTF)、扫描线性可变或旋转周向可变介电滤光器、角旋转法布里珀罗介电或其他带通滤光器、干涉仪(包括迈克耳孙和沙哥纳克(Zagnac)型)或色散光谱仪。还包括室温或任选地冷却的光电倍增器、用于IR图像获取的IR FPA、或者热电冷却的(TE)硅(Si)CCD(即，TE Si CCD)或互补性金属氧化物半导体(CMOS)检测器(用于UV/可见、拉曼和荧光数据获取)、和遥控色散单色仪(装有CCD或CMOS检测器，用于单点或多点分散光谱分析)。
在使用QTH光源或其他宽带白光源(包括金属卤化物、Hg弧光灯，或Xe弧光灯)的反射光结构或在使用折射光学显微镜平台的QTH或其他合适的光源的透射光结构中将UV、可见或NIR照射导向所述样品。在拉曼或激光诱导的荧光实验中，通过使用拉曼照射器将激光辐射导向样品。通过无限校正的显微镜物镜从放置在自动化XYZ平移显微镜台上的样品中收集散射、发射、反射或透射的光。
使用反光镜或使用嵌于显微镜塔轮的分光器或棱镜组，通过用模拟或数字彩色或单色CCD或CMOS检测器收集图像可以获得样品的普通光学图像。在光谱成像模式下，放大的光谱图像通过成像光谱仪耦合，并且在NIR或中-IR焦平面阵列(FPA)检测器(用于IR光谱成像)或硅CCD检测器(用于UV/可见吸收/反射、荧光、或拉曼光谱成像)上收集。IR FPA通常包括砷化铟镓(InGaAs)，但还可以包括其他IR敏感材料，包括硅化铂(PtSi)、锑化铟(InSb)或碲化镉汞(HgCdTe)。合适的FPA检测器为本领域所公知。
中央处理器，如PENTIUM(RTM)处理器型计算机，可用于控制光谱图像收集和处理。可以通过所述计算机控制模拟彩色CCD、IRFPA、硅CCD、自动化XYZ平移显微镜台、液晶可调谐滤光器、成像光谱仪、设备的其他部件或它们的某种组合。商业化软件包，如CHEMACQUIRE(TM；ChemImage Corporation，Pittsburgh，PA)，CHEMANALYZE(TM；ChemImage Corporation，Pittsburgh，PA)，和CHEMIMAGE XPERT(TM；ChemImage Corporation，Pittsburgh，PA)可用于所述控制，并且改进现有的软件或生成用于控制本文所述仪器的新软件属于本领域技术人员的知识范围。
在液晶成像光谱仪前，通过在光程中引入偏振感光分束元件，来自所述样品的一部分信号可以耦合到遥控色散光谱仪。这使得可以将常规光谱工具用于采集光谱进行传统的高速光谱分析。所述光谱仪可以包括以下类型中的一种或多种：固定的滤光器光谱仪；光栅型光谱仪；傅里叶变换光谱仪；和声光光谱仪。可以将与偏振无关的干涉仪，如迈克耳孙干涉仪，沙哥纳克干涉仪，泰曼-格林干涉仪，或马赫-曾德干涉仪用作滤光器。
将液晶(LC)传感光谱仪技术用于波长选择。所述LC传感光谱仪可以是以下类型的：里奥液晶可调谐滤光器(LCTF)；埃文斯分束元件LCTF；索而克LCTF；铁电体LCTF；液晶法布里珀罗(LCFP)；或包括上述LC滤光器类型的混合滤光器技术。另外，还可以使用包括电介质、正弦周期(rugate)、全息、彩色吸收、声光或偏振类型的固定带通和带阻滤光器，可以单独使用或者与上述LC光谱仪中的一种组合使用。称为双折射干涉光谱灵活滤光元件(BISAFE)以及微型-机-光-电(MOEM)型光谱仪的新型可调谐滤光器设计具有能够用比常规滤光器设计更小的形状因子(form factor)进行多点成像的特征并且适用于手持式和便携式装置。光谱多样性滤光器和光子晶体滤光器同样适用于本文所述目的。
新型固态多点探测器设计可以降低检测器的成本，而又不损害进行多点光谱传感的能力。在申请日为2004年7月19日的待批美国专利申请10/893,331和申请日为2003年7月18日的美国临时专利申请60/488,246中所披露的BISAFE滤光器是线性可调谐滤光器，它能够进行行式成像。光谱数据是在不同的光谱范围和在样品的不同位置(即，行)同时获得的。类似地，在申请日为2004年7月19日的待批美国专利申请10/893,332和在申请日为2003年7月18日的美国临时专利申请60/488,246中披露的MOEMS滤光器沿构成该MOEMS装置的硅板的条传感不同的光谱范围。通过使用MEMS微型驱动器定位所述硅板，这些条限定了样品上所选的区域。通过步进所述样品位置，可以重建图像(如果需要的话)。该装置能够以透射模式工作，其中，光平行于所述基片运动，并且垂直于硅板，或以透射-反射模式工作，其中，光垂直于所述基片运动，并且垂直于硅板。这种装置允许在简单设计中在空间位置选择或光谱分辨率之间的折中。
光栅光谱仪可联合FAST技术用于波长和多点光谱采集。这种光谱仪可以在每一次测量期间在光谱仪的每一个波长设定值上沿样品对多个点(例如，一组或一行)进行取样。这使得能够同时对很多点进行有效的数据收集，因此能提供很多在所关注的光谱范围在一次扫描期间迅速获得的空间上不同的光谱。
所述多模式光谱传感显微镜还可以通过以下措施用作立体成像仪器：让样品沿Z-轴方向(即，沿垂直于图像分析的2-维X/Y平面的方向)通过焦平面，收集焦点内和外的图像，并且使用合适的软件重建所述样品的立体数据，所述软件可以通过商业渠道获得和/或属于本领域技术人员的知识范围。对于具有较大体积的样品来说(例如，填充材料、表面、界面和相接触区域)，立体光谱重建可用于故障分析、产品开发和常规质量监测。可以在立体分析的同时进行定量化分析。立体分析能够以非接触方式进行，不需要用数值共焦技术(所述数值共焦技术需要在离散的焦平面上对样品进行传感)修饰样品。业已证实了基于多种策略的计算光学分割重建技术，包括最近邻和迭代消卷积法，并且这样的计算方法适用于本文所披露的装置和方法。
显微镜型光谱传感系统具有能够检测、分类、识别和可视化诸如BWA的实体的优点，例如，在单个细菌的水平上。这些系统所表现出的光谱分辨率在8cm-1数量级上，使用数值消卷积法的空间分辨率为大约200纳米。
显宏镜型系统
在单一平台上，光谱多模式传感显宏镜结合了照射子组件，所述照射子组件包括照射源(例如，QTH、Xe、Hg或金属卤化物灯)、屏蔽光学滤光器和光引导模块(例如，直接光束、光导纤维、或液体光导照射)。将诸如模拟彩色CCD检测器的辐射检测器用于光学和数字图像采集。波长选择可以使用液晶可调谐滤光器或多点光谱仪进行。例如，所述成像检测器可以是室温(或任选地冷却)NIR FPA(用于NIR图像获取)或室温或热电冷却的硅CCD检测器(用于UV/可见和荧光图像获取)。
在使用QTH光源或其他宽带白光源(包括金属卤化物、Hg弧光灯，或Xe弧光灯)的反射光结构中或在使用QTH或其他合适光源通过直接照射、光导纤维或液体光导的透射光结构中将UV、可见或NIR照射导向样品。通过微距透镜收集放置在显宏镜样品座上的样品的发射，反射或透射光。
使用插入显宏镜收集架上的反光镜或分光器或棱镜组并且使用模拟或数字彩色或单色CCD或CMOS检测器采集图像可以获得样品的普通光学图像。在光谱模式下，取样的光谱点通过液晶光谱仪耦合并且在NIR FPA检测器(用于NIR光谱成像)或硅CCD检测器(用于UV/可见吸收/反射、荧光和拉曼光谱成像)上收集。可以将计算机，如PENTIUM(RTM)处理器型计算机用于本文所披露的多模式光谱数据收集和处理。
液晶(LC)光谱仪技术可用于波长选择。所述LC光谱仪可以是本文所披露的任何类型的。另外，可以使用本文所披露类型的固定带通和带阻滤光器，单独使用或者与LC光谱仪组合使用。所述滤光器可以选择取样点的任意或随机集合或由取样方法和/或光谱仪高性能的要求所确定的点的明确限定的集合。例如，用作光子检测器的电阻阳极阵列有利于沿样品选择线性点。类似地，FAST阵列能够以线性方式或以其他收集几何学(collection geometry)的形式排列，以便有利于数据获取。
可以将光栅光谱仪用于波长和多点光谱采集的FAST结构中。这种联用FAST技术的光谱仪允许在光谱仪的每一个波长设定值上对样品上的任意排列的点进行取样。这使得可以同时对多点进行有效的数据收集，并且在对所关注的光谱范围进行一次扫描期间采集空间上不同的光谱。
显宏镜型系统能够快速检测大面积上的潜在有害制剂，如通过邮件方式收到的信封和包装的表面和内容物，并且能分析远处的表面。在多模式检测中，快速样品分析策略(例如，在分析有害制剂存在时的荧光成像)优选在该分析方法的早期进行，以便更迅速地分离所高度关注的点用于随后的详细分析。在图3中示出了这种方法的例子。可以使用显宏镜光学瞄准看上去可疑的样品区域。所选区域的荧光筛选可以指明不发出荧光的部分，因此看来不像是生物源。所选区域(或所述区域内的实体)发出荧光的部分可以通过拉曼化学成像进一步分析，以便区分潜在的生物威胁与非威胁性实体。
内窥镜型系统
光谱传感传统上一直是在实验室设施中使用研究级的光学显微镜技术作为用于选择特定的点的图像获取平台进行的。不过，多模式光谱传感还适用于现场工业过程监测和体内临床分析。多模式光谱传感在科研实验室以外的应用一直因为与工业过程监测和临床环境的物理要求兼容的稳定的光谱和/或光学选择/检测平台的缺乏而受到限制。工业和临床设施通常需要紧凑轻质、适合检查常规光谱仪器无法到达的远处区域的仪器。
本文业已披露了采用液晶技术的可靠的光谱多模式设计，而使用适合塑造成柔性探针如内窥镜的光导纤维技术，可以使用本文所披露的设备、系统和方法。液晶内窥镜是第一种柔性多点内窥镜技术，它为光谱分析提供了实时视频检查能力。所述内窥镜包括二至数千个独立的排列成纤维束的纤维，其耦合到视频CCD，以便对分析区域进行实时视频成像。这使得能够对样品进行快速视觉筛选。加工内窥镜头(tip)以过滤激光照射并且收集拉曼散射辐射和荧光发射(用于拉曼和荧光应用)。对来自激光输送纤维的光进行过滤，以便基本上只有激光波长提供给样品。将激光从收集的光中除去，以便拉曼信息对于在200cm-1的激光谱线内是可检测的。
液晶拉曼内窥镜的远端是具有环境耐受力的，并且可以承受在高温下连续工作，并且业已证实在0-315℃的温度下工作而同时保持高的信号背景比性能。所述远端可以耦合到显微镜型系统，以便可以在远处进行色散光谱和多点光谱传感。
内窥镜型光谱传感系统可用于在远处检测有害制剂的存在，如盒子或信封的内部。
FAST型系统
光谱成像领域的一种新兴技术是光导纤维阵列的应用。我们业已将该技术称作纤维阵列光谱转换器(FAST)，不过它也被确切地描述为降维阵列。FAST技术可以同时获取数个到数千个完整光谱范围、空间分辨的光谱。为了成像，这通过将光谱图像聚焦到光学纤维的二维阵列而实现，所述光学纤维呈螺旋序向(serpentine ordering)被拉伸成一维远端阵列(one-dimensional distal array)。将一维纤维组件(stack)耦合到成像光谱仪。然后利用软件提取嵌于单个CCD图像帧中的光谱/空间信息。业已在若干种用途中证实了纤维阵列光谱成像，包括微型复合物和生物材料的拉曼化学成像分析和激光诱导的羽烟(plumes)的时间分辨的原子发射化学成像。
该方法与现有点光谱检测方法相比的优点是分析速度。用从特定材料产生单一光谱所花费的时间就能够获得完整的光谱数据集合。即使具有有限的像素清晰度，高-空间分辨率的光学图像与低分辨率的光谱数据的比较可以提供对视场中材料的形态和化学本质有意义的了解。
环境空气传感器系统
本发明包括环境空气传感器系统，其包括两个部分，取样系统和光谱成像系统。在图2中示意性地示出了该系统的光学元件模块。该模块支撑一部分(section)样品收集基片如过滤介质(例如，微孔过滤介质，其具有小到足以基本上阻止所关注的有害制剂通过的微孔，或被涂敷的过滤介质，其具有大到足以让所关注的有害制剂通过的孔，但涂敷有油或其他物质，通过的颗粒可以粘附到其上或通过的分子可以被吸收或溶解到其中)，并且在取样区周围提供空气密封。该模块应当便于打开，以便可以将新的过滤器(当该系统使用离散的过滤器作为基片时)或新的过滤器部分(当该系统使用连续的过滤器基片时)放入取样/光学元件通道中。在使用连续基片时，可以引入驱动装置(例如手动曲柄或马达)，以便在测量之间推进所述基片，从而将新的基片用于每一次测量。所述驱动装置可以由用于控制光学元件的相同的控制器(或计算机，如果独立的话)控制。
所述取样系统具有入口，其对于检测的大气是开放的。它的尺寸通过取样流速和预期的粒度范围进行优化。对于颗粒或气溶胶取样来说，重要的是所述入口没有锐弯或低线性速度的部位，这些可能导致颗粒在收集过滤器之前沉积。所述取样系统包括取样泵或者与其连接，所述取样泵提供负压，以便使环境空气通过过滤器。使用正压工作以便迫使环境空气通过基片也是可行的。在0.5-2.0升/分的空气流速被认为适合取样，并且大约100英寸水(180毫米汞柱)的真空度应足以在合理的样品基片面积中在上述体积中收集颗粒。
所述取样系统可以连续作业，或者优选在一系列离散的取样时间内作业。在每一段时间结束时，可以更换样品收集基片(或者，如果使用连续介质的话，将其向前推进)。这可以由操作人员完成或自动完成。对于连续或间断取样来说，所述基片可以是磁带型过滤器结构，并且通过“磁带”驱动机构(类似于盒式录音磁带的驱动装置)将过滤器的新的样品放置在光学元件模块上。有多种合适的样品收集介质是已知的，包括过滤器介质，如盘状、片状和卷状形式的多孔聚丙烯介质和铝介质。合适的样品收集基片的选择属于技术人员的知识范围。
一旦将颗粒捕获在样品收集基片上，就采用多模式光谱学方法检测所存在的有害制剂并且对其分类。如果所述激发源是激光器(使用常规光学元件或光导纤维将所述激光器耦合到光学元件模块以将激光器的输出分布在取样区上)，可以使用拉曼成像。或者，所述激光器照射可以被成形和/或分束以匹配(例如，基于基片上所述颗粒的其他光学特性)所选的或所取样的点的分布。在另一种结构中，包括宽带UV/可见(UV/Vis)、被滤光的UV/Vis，或UV/Vis激光的光源可用于激发自发荧光。所述检测器可以是液晶可调谐类型或本文所披露的其他多点光谱仪类型，并且可以将CCD或其他阵列照相机用于确定多种波长下的取样区。将检测器耦合到光学元件模块可以由纤维型或常规光学元件实现。使用化学计量和数据分析工具(如CHEMANALYZE(TM)和CHEMIMAGE XPERT(TM)软件包中的那些)处理所述检测器数据。
环境空气监测器可以间歇性地工作，例如，作为一系列的取样时间，在此期间，进行定期的光谱测量。取样时间可以一个紧接一个(即，随后的取样时间在前面的取样时间之后马上开始)或中断一段时间(例如，取样时间中断20分钟)。来自以前和当前取样时间的结果可以通过系统计算机解读，所述计算机能够显示结果，并且启动报警和危险警报，或启动某种动作，如关闭建筑物外面的空气入口。
用于动态化学成像的系统和方法
在本部分中描述的方法可以使用用于检测在第一时间间隔和第二时间间隔之间在样品中发生的动态变化的系统或方法使用样品的一系列的至少第一和第二顺序化学图像来进行。所述第一化学图像对应于在第一时间间隔期间样品的图像。所述第二化学图像对应于在第一时间间隔之后样品在第二时间间隔的图像。
在所述第一时间间隔期间：(i)用多个光子照射所述样品从而产生被所述样品散射的或发射的光子；(ii)然后使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和(iii)此后所述检测元件的二维阵列被额外使用一次或多次同时检测从样品上或样品内的不同位置在一个或更多其它预定波段散射的或发射的光子。然后，在第一时间间隔期间所述检测元件的二维阵列的输出被合并以产生所述样品的第一化学图像。
在所述第二时间间隔期间：(i)用多个光子照射所述样品从而产生被所述样品散射的或发射的光子；(ii)然后使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和(iii)此后所述检测元件的二维阵列被额外使用一次或多次以在一个或更多其它预定波段从样品上或样品内的不同位置同时检测散射的或发射的光子。然后，在第二时间间隔期间所述检测元件的二维阵列的输出被合并以产生所述样品的第二化学图像。
基于所述第一和第二化学图像之间的一个或多个差异，检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。
本发明使得可以以全空间信息快速观察样品，并且允许监测样品中自然进行或发生的(即在平衡条件下)进展和变化以及通过外界方式(例如施加到样品的一种或多种外部场或力)产生非平衡条件而额外强制或强加的那些。在某些实施方案中，所述外界方式可以施加到样品内的特定位置(而不是整个样品)。
图10示意性地示出了根据本发明一个实施方案的仪器。图1示出的仪器可以在不同放大倍数为微光成像提供高光通量。参见图10，将样品1000放置在基片1050上。基片1050可以是任何常规显微载玻片或者用于接收以及任选地固定样品1000的其它器具。设置光源1100以向样品1000提供入射光。光源1100可包括任何常规光子源，包括激光器、LED和其它IR或近IR装置。也可以选择光源1100以提供样品的迅衰照射。在一个实施方案中，所述光源的带宽为约15-25cm-1。
仍旧参见图10，应该注意，设置光源1100以相对于样品1000以一定的角度提供入射光，其与正交于样品1000发射(shining)的光相对。换句话说，用于照射所述样品的辐射不需要经过常规显微镜(或显宏镜)的光学系统；相反地，它可以以倾斜角度从样品1000上面或下面照射所述样品。光子束1102被反光镜1150接收并反射，穿过透镜1200。透镜1200可以任选地被用于将所述光聚焦在样品1000上。或者，可以不需要反光镜1150而将光子束1120引向样品1000。
到达样品1000的光束1120中的众多光子照射样品并且被样品散射或吸收，这可造成后续的在不同波长的发射(发光)。如本领域技术人员已知的那样，术语“发光”包括各种使用其它名称描述的光学过程。这些包括：荧光、磷光、光致发光、电致发光、化学发光、声致发光、热致发光和甚至升频转换。被散射的光子示意性地表示为光束1160和1180，而被镜反射的光子示意性地表示为光束1140。发光发射的光子也表示为光束1180。设置光学透镜1250以接收光子束1160和1180。光学透镜1250可以用于聚集并聚焦所接收的光子束。这包括聚集并聚焦偏振的和非偏振的光子。一般而言，样品尺寸决定聚光光学透镜1250的选择。例如，可以使用显微镜透镜来分析亚微米至微米的样本。对于更大的样品，可以使用微距透镜。光学透镜1250(以及透镜1200)可包括具有更大数值孔径的简单的低分辨率/像差的透镜，从而增加系统的光通量和效率。设置反光镜1300以将发射的或散射的光子束1180引向可调谐滤光器1400。应该指出的是，反光镜1300的放置是任选的，并且在其中可调谐滤光器被置于样品1000上方的结构中，反光镜1300可能是非必需的。
激光拒波滤光器1350可以被置于可调谐滤光器1400之前以过滤出光束1160表示的散射的照射光并优化系统的性能。换句话说，拒波滤光器1350能够在照射波长以光谱方式过滤光子。
可以使用常规可调谐滤光器(包括光电的、机械的或其它可调谐滤光器)以进一步说明本公开的原理。合适的可调谐滤光器的例子包括液晶可调谐滤光器(“LCTF”)或声-光可调谐滤光器(“AOTF”)。取决于控制器加载在所述装置上的控制信号，所述光电滤光器(或其它可调谐滤光器)允许特定波长或波长范围的光作为图像通过。可以通过可调谐滤光器1400的波长范围可以为200纳米(紫外)到2000纳米(即，远红外)。波长的选择取决于期望的光学区域和/或被分析样品的性质。
图像传感器1450可以是数字装置，例如二维图像焦平面阵列(“FPA”)或CCD或CMOS传感器。用于表征所关注样品的光学区域决定FPA检测器的选择。例如，硅电荷耦合装置(“CCD”)检测元件的二维阵列可以与可见波长荧光和拉曼光谱一起使用，而砷化镓(GaAs)和砷化铟镓(GaInAs)FPA检测器可以用于在近红外波长下的图像分析。此类装置的选择取决于被分析的样品的类型。在一个实施方案中，用于形成图像传感器1450的检测元件的二维阵列中的每一个检测元件都用于检测从样品上或样品内的不同空间位置散射的或发射的光子。在一个实施方案中，图像传感器1450通过可调谐滤光器1400的处理产生样品的整个视图的数字图像。
图11示意性地示出了根据本发明另一个实施方案的仪器。更加具体地，图11示意性地示出在不同放大倍数用于微光成像的高光通量结构。聚光装置与图10中所示的类似，但是却从样品1000的下面照射。
应注意，在图10和11中，以某一倾斜角度照射样品1000。具体参见图11，光子束1200和样品1000的平面轴限定了倾斜角度。已经发现，通过倾斜照射，开发出所谓的“暗视场拉曼成像”。与常规明视场拉曼结构不同，暗视场拉曼成像使激发辐射的输送与图像捕获光学器件去偶。因此，入射辐射的内散射和衰减被最小化以改进信噪比(S/N)。此外，在光学系统之外的光源位置进一步使得可以使用更低的成本、更低功率的照射源以及使得可以更简单地、更便宜地将几个照射源集成到系统中。这种结构的使用并不限于拉曼和发光成像，其可成功用于例如常规光谱法。
在图10和11所示的每一个实施方案中，可以将计算机或处理器(未在图中示出)连接到光学装置并用于控制光学装置，所述光学装置包括光源(1100)、透镜(1200，1250，1350)、反光镜(1150，1300)和可调谐滤光器(1400)。所述计算机也可以连接到图像传感器1450并用于从图像传感器1450的输出产生“化学图像”。在一个实施方案中，每个化学图像都是从多个“帧”形成的所述样品的空间精确波长分辨的图像；其中每一帧都具有多个空间维数并且由特定波长(或波数)的光子或由特定波段(或波数段)中的光子产生，所述光子在样品1000上或样品1000内从不同空间位置由图像传感器1450同时收集。在每一个化学图像中，可以合并多个帧以形成跨越整个所关注波长(波数)的完整图像。计算机产生的化学图像可以进一步通过计算机进行分析和/或显示给使用者。
本发明使用例如示于图10和11中的那些仪器来使用样品1000的一系列的至少第一和第二顺序化学图像以检测在第一时间间隔和第二后续时间间隔之间在样品1000中发生的动态变化。
在所述第一时间间隔期间：(i)用来自光源1100的光子照射样品1000从而产生被样品1000散射的或发射的光子；(ii)然后使用图像传感器1450同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段(通过可调谐滤光器1400选择)散射的或发射的光子；和(iii)对于一个或多个其它预定波段(每一个都使用可调谐滤光器1400顺序选择)的每一个波段，然后使用图像传感器1450同时检测从样品上或样品内同时检测散射的或发射的光子。然后，检测器1450的输出(对于在第一时间间隔期间通过可调谐滤光器1400选择的每一个波长或波段)通过计算机(未在图中示出)被合并以产生所述样品的第一化学图像。
在所述第二后续时间间隔期间：(i)用来自光源1100的光子照射样品1000从而产生被样品1000散射的或发射的光子；(ii)然后使用图像传感器1450在第一预定波段(通过可调谐滤光器1400选择)从样品上或样品内的不同位置同时检测散射的或发射的光子；和(iii)对于一个或多个其它预定波段(每一个都使用可调谐滤光器1400顺序选择)的每一个波段，然后使用图像传感器1450从样品上或样品内的不同位置同时检测散射的或发射的光子。然后，检测器1450的输出(对于在第一时间间隔期间通过可调谐滤光器1400选择的每一个波长或波段)通过计算机被合并以产生所述样品的第二化学图像。
基于所述第一和第二化学图像之间的一个或多个差异，检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。具有或不具有物理图像的化学图像的计算机分析可用于动态变化的检测(或增强检测)。所述动态变化也可以通过使用者观察所述化学图像的显示进行检测。
在各种实施方案中，快速顺序得到一系列的很多序列的化学图像以产生样品的“电影”。例如，为了基本实时地检测样品中的动态变化，可以得到所述样品每秒多达100幅化学图像。在一些实施方案中，序列中化学图像的时间分辨率可以细达1毫秒，即系统将每一毫秒产生一幅样品的化学图像。也可以选择其它的时间分辨率，包括例如一种折合为化学图像以相邻图像之间多至15分钟间隔的时间分辨率。当使用本发明来监测特定的过程或反应时，所选的时间分辨率应足以随时间检测样品中发生的所关注的动态变化。
本发明因此使得可以以全空间信息快速观察所述样品1000，并且允许监测样品1000中自然进行或发生的(即在平衡条件下)进展和变化以及通过外界方式(例如施加到样品的一种或多种外部场或力)产生非平衡条件而额外强制或强加的那些。在某些实施方案中，所述外界方式被施加到样品1000内的特定位置(而不是整个样品)。使用本发明的动态化学成像技术可以分析和观察的样品的例子包括随时间发生变化的生物样品或微流路。这些变化可包括移位、化学相互作用、化学状态的变化、相变、生长、收缩、化学分解、化学代谢和物理应变。本领域技术人员将认识到可用于本发明的样品/变化的各种其它例子，并且所述样品/变化的各种其它例子同样在本发明的范围之内。
如上面指出的那样，本发明可用于检测由于向样品施加外部条件而导致的样品中的动态变化。这些外部条件包括，例如，在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品1000或在样品1000内的电场或磁场；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的外光场，其中所述外光场与开始用于照射样品的光场不同；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的光场，其中所述额外的光场是通过使用于照射样品的光场发生脉冲产生的；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的内部产生的光子；在第一和第二时间间隔之间改变用于照射样品的偏振光；在第一和第二时间间隔之间改变样品的温度；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品的压力；或在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的应力。在其它实施方案中，与样品相关的化学梯度(例如施加到样品上的化学梯度)在第一和第二时间间隔之间发生变化。在另一个实施方案中，在第一和第二时间间隔之间在样品中引发生理或生物应力。在其它重要实施方案中，在多个时间观察向样品加入一种或多种化学物质(例如药物活性试剂、抗体或核酸)的动态效果。
在一些实施方案中，序列中的每个化学图像都是由所述样品的多个分开的空间精确波长分辨的图像(如上述那样，每一个都从多个“帧”形成)组成；其中所述多个分开的空间精确波长分辨的图像的每一个都对应于样品中多个不同深度中的一个。这些实施方案可用于检测在样品1000整个体积中发生的化学变化，而不是在样品的单个表面或平面上发生的变化。
在其它实施方案中，序列中各个化学图像之间的差异可以与样品的正交(即互补)测量关联起来(使用例如上述的计算机或通过使用者进行)，所述正交测量在与所述序列相关联的每个时间间隔期间进行，从而增强样品中动态变化的检测或观察。可以使用的正交测量的例子包括使用下述形式进行的测量：拉曼散射、近红外吸收(NIR)、可视图像、视频或发光。也可以使用其它正交测量，并且这些测量被认为是在本发明的范围之内。
实验结果
使用传统光谱方法生成的光谱可潜在揭示大量有关有害制剂的分子特性的信息。如果需要的话，通过使待探测的这些材料的组合物中的变化低到任意小的水平(例如，单个细菌)，光谱成像将上述信息组合(compound)起来。例如，图7表示光学图像(图7A)、拉曼化学图像(图7B)和荧光图像(图7C)，它是从炭疽芽孢杆菌在混合的培养基成分和福尔马林的混合物中获得的。图7D和7E是图7A所示光学图像分别与图7B和7C所示光谱图像的图像融合的例子。
图4A表示获自三种不同样品的色散拉曼光谱，每一种包括一种类型的细菌孢子。这表明尽管在遗传学和形态学上相似，但可以利用拉曼光谱学足够在不同的细菌孢子间进行区分。在一次光谱扫描期间区分小目标的不同光谱的能力对于挑选出并且区分混合物中的诸如BWA或CWA的实体来说是重要的。
图6表示如何使得使用荧光系统的光谱传感和分析能够用于区别和区分不同的芽孢杆菌。对于两种类型的芽孢杆菌，获得了图6C中的荧光光谱。基于这些荧光光谱的差别，特别是峰的差别，可以区分枯草芽孢杆菌孢子(它的荧光峰最大值为630纳米)和短小芽孢杆菌孢子(它的荧光峰最大值为540纳米)。图6A和6B中的图像表示使用不同荧光光谱成像波长的相同的显微镜视场。
图8表示显宏镜系统中的荧光和可见光谱分析如何检测信封外面的克虏伯氏芽孢杆菌和碳酸氢钠混合物中的克虏伯氏芽孢杆菌候选实体。通过与这些化合物的参考拉曼光谱进行比较，标为Pt1、Pt2和Pt3的样品区域(或该区域内的一种或多种像素)的拉曼光谱成像可用于证实图8D中的荧光光谱识别的化合物的身份。
在一个安全的生物危害实验室中对炭疽孢子进行了拉曼成像。通过拉曼光谱学和拉曼成像区分了不同的炭疽孢子品系。另外，已将化学图像的拉曼光谱分析(即，拉曼化学成像)用于区分在不同环境条件下和/或生长培养基中生长的相同物种和品系。这种能力可能具有有益的研究目的。类似地，已将拉曼光谱分析用于区分有生活力的和无生活力的内生孢子。可疑孢子的生活力在决定构成实际威胁方面是关键参数。
本文所披露的装置和方法可用于在可能存在于样品中的多种实体间进行区分。图5B表示包括至少三种不同材料的样品的图像。图5A表示已知存在于样品中的三种成分的拉曼光谱。图5B中用方框圈起来的部分的拉曼光谱分析表明了该方框区内的实体的身份。这些结果证实了本文所披露的系统区分样品中的实体的能力，这些实体是多种多样的，如克虏伯氏芽孢杆菌(细菌)、蛋白(蛋白聚集物)和土曲霉孢子(真菌孢子)。在图5B中，克虏伯氏芽孢杆菌细胞看上去呈浅绿色，蛋白看上去呈浅红色，而土曲霉孢子看上去呈浅蓝色。在图5C中，RS值为大约2950cm-1的拉曼散射光显示浅色的，并且与图5B中的浅绿色区域对应，证实了克虏伯氏芽孢杆菌细胞在视场的这些部分的存在。在图5D中，RS值为大约3050cm-1的拉曼散射光显示浅色的，并且与图5B中的浅蓝色区域对应，证实了土曲霉孢子在视场的这些部分的存在。在包括拉曼散射和其他光谱数据的合成图像(例如，包括拉曼光谱数据和可见光图像的合成图像，有或没有荧光图像数据)中相应于所选的RS值的颜色可能是拉曼位移光的实际颜色或伪彩色。例如，可以选择伪彩色以最大化对其他图像成分的对比度，而与用在独立图像中的伪彩色相一致，以便得到视觉吸引人(visually appealing)的图像，或任意所选的图像。
可以使用本文所披露的多模式光谱传感方法检测多种生物学病原体(即，对物种或品系进行检测、分类，确定它们的生活力或这些的某种组合)。这些病原体包括真核生物，如原生动物和真菌(例如，水或土壤中的贾第虫属物种、白色假丝酵母或隐孢子属物种)；细菌(例如，大肠埃希氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌属物种、产气荚膜梭菌和其他梭菌属物种、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、鹦鹉热衣原体、伯氏考克斯氏体、普氏立克次氏体、弧菌属物种、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、白喉棒杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌)；和病毒(天花、牛痘、丝状病毒如埃博拉和马尔堡病毒、navirus如拉沙热和玻利维亚出血热病毒、和α病毒如委内瑞拉马脑炎、东方马脑炎和西方马脑炎病毒)。所述方法还可用于检测任何病毒、细菌、寄生虫或朊病毒疾病的病原体，例如，包括以下疾病的病原体，如兔热病、普鲁氏菌病、鼻疽病、类鼻疽、鹦鹉热、Q热、斑疹伤寒、天花和脑炎。
另外，正如可以检测掩蔽混合物中的毒性成分，因此，同样可以检测其他混合物中的特殊材料。这些包括但不局限于多种混合物，如血液中的有害制剂，药片中的杂质或活性成分，和空气悬浮颗粒中的特殊实体。
数据分析
例如，通过与保存在图1所示数据储存器实体430中的光谱的参考数据库进行比较，数据分析和化学计量工具对各个光谱检查所发现的荧光或拉曼光谱的区别进行检查并且分离成主成分以区分纯的成分并识别各自成分。比较拉曼光谱与一种或多种参考光谱的方法为本领域所公知。
可以将多种数据处理方法应用在这些系统上。例如，加权多点光谱数据扣除方法可用于抑制样品背景或样品支持物(例如，由显微镜载玻片产生的拉曼散射光)的作用。另外，包括主因子分析和随后的因子旋转的多变量光谱分析可用于区分有害制剂中的纯分子特征，和其他实体(例如，非威胁性“掩蔽”化合物)。
以下是可用于这种多点分析的算法的例子，并且用枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌孢子的混合物作为样品：
1.加载来自保存的值或来自仪器输出的荧光图像。
2.加载来自保存的值或仪器输出的相同视场的明视场显微图像。
3.通过校正图像切分每一幅图像进行仪器响应校正。
4.对两种图像进行预处理，以便排除异常值和噪声，例如，使用
4a.宇宙(cosmic)滤光器，以便获得对它的值明显不同于局部相邻平均值的中等过滤，和
4b.维纳滤光器，以便获得顺利去掉附加噪声的空间图像。
5.使用所述明视场图像，使用若干可行的方法之一获得所述孢子的二元掩模，其中的两种方法是：
5a.分水岭分割，它根据它的密度曲线梯度标记每一种孢子并且分割每一种孢子，和
5b.Otsu阈值方法，用于确定最佳密度阈值(参见Otsu，1979，″A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms，″IEEETransactions on Systems，Man，and Cybernetics 9(1)：62-66)。
6.对二元目标进行颗粒分析，以便获得空间特征，如面积、长度、宽度、形状因子和偏心率等。
7.通过所述二元掩模倍增荧光图像。
8.对该掩模的荧光图像进行主成分分析(PCA)，以便获得最重要的主成分和相应的划线图像(score image)，它构成了该变量的大部分百分比。例如，如果两种主成分占该变量的99％，99％就是规定的阈值，保留两个划线图像。
9.在包含掩模目标的像素上从由划线图像的平均值产生“光谱”特征。
10.合并所述光谱和空间特征向量。
11.对合并的特征向量进行PCA分析。
12.采用多维k均值聚类对PC进行聚类，将由PC数量决定的类数保留在步骤8中。
13.分配每类一种颜色，并且为所述掩模中的目标分配相应的颜色，这种彩色图像示出了检测到的威胁。
14.进行图像融合，以便使这些特征与已通过其他方法表征的光学或其他图像特征相关联。
应用
本文所披露的装置，系统和方法适用于快速(化学和/或生物)检测有害制剂和其他用途。在显宏镜形式的技术中，可以将多模式光谱传感用于对可疑的有害制剂的大面积进行快速评估，基于它们的荧光、NIR、UV/可见特性，或基于这些特性的某种组合。对于显微镜模式来说，可以对可疑的有害制剂进行观察、阳性检测、分类和识别。对于内窥镜模式来说，可以在远处对有害制剂进行观察、检测、分类和识别。对于FAST模式来说，可以在远处或在显微镜下实时检测、分类、识别和观察有害制剂。作为空气取样器，可以对空气悬浮的有害制剂进行明确的检测。
与现有技术相比的优点
检测有害生物制剂的传统方法包括接种方法，酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，BIOTHREAT ALERT(TM，Tetracore Inc，Gaithersburg，MD；BTA)测试条，DNA型测试，DNA芯片分析，和质谱分析。
接种方法包括将被怀疑的培养物或样本接种到动物体内，然后观察疾病的发展。除了对动物残忍之外，该方法的缺陷还包括为了完成检测需要花费大量时间。
ELISA试验涉及抗体检测。这种技术同样缓慢并且存在高比例假阳性结果(例如，不相关的抗体与抗原非专一性地反应)，以及假阴性结果(例如，出现在血液中的干扰化合物或抗体未被浓缩至以足够检测)。另外，患者可能在恢复之后很长时间检测抗体时仍然为阳性。
BTA测试条是小型塑料装置，它的工作原理与家庭妊娠试验非常类似。测试条包含存在条上变色的特殊抗体，指明生物威胁制剂的存在。阴性结果表明，在该测试条的检测极限内不存在生物威胁制剂。尽管结果可以在较短时间内获得(例如，15分钟)，但是假阴性和假阳性的出现频率很高。
DNA型试验通过识别它们的遗传序列检测生物学制剂。尽管比BTA测试条更灵敏，DNA型试验更容易受到掩蔽剂的影响，并且需要很长的分析时间。DNA芯片分析涉及将DNA链固定在Si或玻璃晶片上。DNA能够与测试样品中的互补的DNA链结合或与它杂交。专门设计的显微镜能检测DNA在哪里杂交。通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。据报导，生物威胁制剂的检测可以在几分钟内完成。DNA型方法的限制是双重的。首先，要设计DNA方法，以便通过其独特的DNA序列检测特异性的生物威胁制剂。因此，每一种DNA试验对一种制剂是特异性的，如果需要检测其他制剂的话，必须开发其他试验制剂。第二种限制涉及由于环境污染而产生的假阴性和假阳性问题。众所周知的是，DNA试验具有在″真实世界″样品中产生正确结果的问题。
质谱分析(MS)使用质量片段(这些片段是当细胞、孢子或化合物在高真空条件下经历电离过程时产生的)的图谱以便表征存在于样品中的有机体或化合物。该技术的优点是检测灵敏度极高，不过需要复杂的取样系统，以便将相应的样品输送到电离器。MS的主要限制是，它需要使用高真空泵，这种泵本身是精密的和昂贵的。另一个限制是，它是破坏性的技术。
本文所披露的装置和系统的其他实施方案包括基于光谱方法(包括拉曼、荧光、NIR和其他快速、非接触、精确的有害制剂检测)的探针或显微镜。类似技术早先已应用于费时的方法，包括通过光谱方法每次寻找样品中的一个点。本文所披露的多模式光谱传感方法快速提供自动化光谱分析方法所需要的数据。可以将局部成分分析方法与这些化学成像分析方法组合使用。本文所披露的多模式光谱传感方法可以在小型化、紧凑的传感平台上实施。本文所披露的装置、系统和方法可用于在本地或远程环境中识别存在于其它有害制剂、环境污染物和/或非威胁性“掩蔽”制剂中的个别的有害制剂的分布。这些特征是传统方法所不具备的。本文所披露的装置、系统和方法可能出现假阳性和假阴性结果的几率较低，并且能够确定在几分钟的时间帧内是否存在真正的威胁。
5-异硫氰酸荧光素(FITC)的三模式化学成像
细胞的集成荧光成像在荧光型细胞和分子生物化学分析领域中是很完善的技术。具体地讲，作为药物发现和开发的一部分，该方法被广泛应用于检测药物-细胞相互作用。这种类型的成像一般是使用带通光学滤光器进行的，并且在这样做时，不能提供与化学环境或与分子探针的相互作用有关的谱带形或峰值位置变化的信息。相反，超光谱(hyperspectral)荧光成像提供了与图像的每一个像素相关的光谱，由此揭示视场中每一个空间位置上有关化学环境和分子相互作用的信息。可应用在相同视场上的其他超光谱模式包括可见吸收和拉曼成像。通过来自相同视场的光谱成像的电子和振动模式的组合探测化学相互作用，提供了有关诸如细胞、组织和有机体的生物系统的大量信息。
基于可见吸收、荧光发射和拉曼散射，三模式化学成像可以使用一台仪器完成。该仪器包括液晶可调谐滤光器(LCTF)和电荷耦合装置(CCD)成像照相机，正如本文所披露的。这种仪器可用于对溶剂化合物进行三模式的光谱成像，如通常被用作生物成像用途的分子探针。
为了理解所述化学基础，考虑了广泛使用的分子探针，FITC(分子化学式：C21H11NO5S，分子量：389.38)。FITC是外源荧光团，就是说，必须与生物分子共轭结合以便发挥荧光标记作用的分子，它对某些生物学位点具有特异性。外源荧光团的共同特征是，它们高度共轭化学键，由此产生了与可见光的强吸收相关的电子跃迁，以及随后的发射，通常是以高的量子效率进行的。另外，高度共轭的pi-键合造成了所述分子的高极性，还由于振荡跃迁造成了强的拉曼散射。因此，外源荧光团的分子结构适用于开发多模式超光谱成像。
在图9中示出了FITC的吸收和荧光发射光谱。FITC吸收波长为425-525纳米的光，并且表现出的最大吸收值为大约490纳米。所述荧光发射表现出适度的斯托克司频移(在吸收和发射最大值之间的能量差异)，最大发射为大约520纳米。因此，通过用波长为488纳米的光(例如，氩激光器的488纳米线)照射含有FITC的样品能够产生超光谱荧光图像。通过用来自He-Ne激光器的632.8纳米线或来自半导体激光器的635纳米线辐照样品生成超光谱拉曼图像。任何红光波长都明显比吸收或发射最大值长，并且在使用这种红色波长照射样品进行拉曼成像时，预计不会有荧光干扰拉曼散射辐射。因此，通过适当选择照射波长，可以从包含FITC的样品的同一视场获得超光谱拉曼和荧光图像。
通过让白色光透射样品并让它通过LCTF，并且将光聚焦在CCD成像照相机上，可以生成超光谱吸收图像。光收集、波长选择和成像照相机可以与用于超光谱吸收、荧光发射和拉曼成像的相同。因此，超光谱成像的所有三种方式提供了有关单一视场中相同位置的互补性的化学信息。
在本文中所引用的每一份专利，专利申请和公开文献的内容，被以它们的全文形式收作本文参考。
尽管业已结合具体实施方案对本发明进行了说明，显而易见的是，本领域其他技术人员在不超出本发明的实际构思和范围的前提下可以设计出本发明的其他实施方案和变化形式。所附权利要求书包括所有这样的实施方案和等同的变化形式。

Claims (51)

1.一种评估有害制剂在包括多种实体的样品中的存在的方法，该方法包括评估所述实体的第一种光学性质，以便选择对其来说所述第一种光学性质表征所述制剂的实体，然后评估由所选的实体散射的拉曼位移辐射，其中，由所选的实体所表现出的表征所述制剂的拉曼散射特性说明所述样品中存在所述制剂。
2.如权利要求1的方法，其中，所述第一种光学性质选自下列一组：吸收、荧光、衍射、偏振、显微形态和与粒子运动相关的光学性质。
3.如权利要求1和2中任意一项的方法，其中，拉曼位移散射辐射仅用于评估对其来说所述第一种光学性质表征所述制剂的实体。
4.如权利要求3的方法，其中，所述第一种光学性质是显微形态。
5.如权利要求4的方法，其中，所述形态是通过选自下列一组的方法评估的：扫描电子显微术、可见光反射显微术、紫外光反射显微术、光反射显微术、可见光透射显微术、紫外光透射显微术、红外光透射显微术和荧光显微术。
6.如权利要求5的方法，其中，所述形态是通过可见光反射显微术评估的。
7.如权利要求1-6中任意一项的方法，包括评估由同样表现出表征所述制剂的第二种光学性质的所选的实体散射的拉曼位移辐射。
8.如权利要求7的方法，其中，所述第二种光学性质选自下列一组：吸收、荧光、衍射、偏振和显微形态。
9.如权利要求7的方法，其中，仅对对其来说所述第一和第二种光学性质表征所述制剂的实体进行拉曼位移散射辐射评估。
10.如权利要求7的方法，其中，所述第一种光学性质是显微形态。
11.如权利要求10的方法，其中，所述第二种光学性质是荧光。
12.如权利要求11的方法，其中，所述第一和第二种光学性质都是荧光显微术评估的。
13.如权利要求11的方法，其中，所述形态是通过可见光反射显微术评估的。
14.如权利要求11的方法，其中，仅对表现出表征所述制剂的显微形态的实体进行荧光评估。
15.如权利要求1-14中任意一项的方法，其中，所述制剂是合成的有机化学物质。
16.如权利要求1-14中任意一项的方法，其中，所述制剂是无机化学物质。
17.如权利要求1-14中任意一项的方法，其中，所述制剂是生物毒素。
18.如权利要求1-14中任意一项的方法，其中，所述制剂是微生物。
19.如权利要求18的方法，其中，所述微生物是细菌。
20.如权利要求18的方法，其中，所述微生物是原生动物。
21.如权利要求1-14中任意一项的方法，其中，所述制剂是病毒。
22.如权利要求1-21中任意一项的方法，其中，在评估所述拉曼位移散射辐射之前，所述拉曼位移散射辐射透射过滤光器。
23.如权利要求22的方法，其中，所述滤光器选自下列一组：法布里珀罗角度调谐滤光器、声光可调谐滤光器、液晶可调谐滤光器、里奥滤光器、埃文斯分束元件液晶可调谐滤光器、索而克液晶可调谐滤光器、光谱多样性滤光器、光子晶体滤光器、固定波长的法布里珀罗可调谐滤光器、空气调谐法布里珀罗可调谐滤光器、机械-调谐法布里珀罗可调谐滤光器和液晶法布里珀罗可调谐滤光器。
24.如权利要求1-21中任意一项的方法，其中，在评估所述拉曼位移散射辐射之前，所述拉曼位移散射辐射透射过干涉仪。
25.如权利要求24的方法，其中，所述干涉仪选自下列一组：与偏振无关的成像干涉仪、迈克耳孙干涉仪、沙哥纳克干涉仪、泰曼-格林干涉仪、马赫-曾德干涉仪和可调谐法布里珀罗干涉仪。
26.如权利要求1-25中任意一项的方法，其中，所述拉曼位移散射辐射是使用选自下列一组的装置收集的：显宏镜、显微镜、内窥镜和光导纤维阵列。
27.如权利要求1-26中任意一项的方法，包括评估所选的实体的拉曼散射光谱。
28.如权利要求27的方法，其中，所述光谱包括在20-2000cm-1范围内的拉曼位移值。
29.如权利要求27的方法，其中，所述光谱包括在2700-3200cm-1范围内的拉曼位移值。
30.如权利要求27的方法，其中，所述光谱包括在1000-2000cm-1范围内的拉曼位移值。
31.如权利要求27的方法，其中，所述光谱包括在500-3000cm-1范围内的拉曼位移值。
32.一种用于评估有害制剂在包括多种实体的样品中的存在的装置，该装置包括用于辐照所述样品的辐射源，用于检测所述实体的第一种光学性质的第一检测器，用于检测由所述实体散射的拉曼位移辐射的拉曼检测器，和可操作地连接到拉曼检测器的控制器，其用于将拉曼位移辐射的检测局限于对其来说所述第一种光学性质表征所述制剂的实体。
33.如权利要求32的装置，其中，所述控制器是计算机操作的软件，以便分析第一检测器的反应。
34.如权利要求32和33中任意一项的装置，其中，所述辐射源是可见光源。
35.如权利要求34的装置，其中，所述第一种光学性质是显微形态。
36.如权利要求32和33中任意一项的装置，其中，所述第一种光学性质是荧光强度。
37.如权利要求32-36中任意一项的装置，还包括用于报导所述实体的第一种光学性质的输出，其中，所述控制器是由用户可操纵的。
38.如权利要求37的装置，其中，所述输出是可视显示器，在它上面显示了第一种光学性质的图像。
39.如权利要求32-38中任意一项的装置，还包括用于检测所述实体的第二种光学性质的第二检测器，其中，所述控制器将拉曼位移辐射的检测局限于对其来说所述第一和第二种光学性质表征所述制剂的实体。
40.如权利要求39的装置，其中，所述第一种光学性质是显微形态，而第二种光学性质是荧光。
41.如权利要求32-40中任意一项的装置，其中，所述辐射源基本上是单色的。
42.如权利要求32-41中任意一项的装置，包括多色辐射源和基本上单色的辐射源。
43.如权利要求32-42中任意一项的装置，其中，来自所述样品的辐射通过多个光学纤维耦合到所述第一和拉曼检测器。
44.如权利要求43的装置，其中，所述光学纤维在它们最接近样品的末端呈螺旋序向以一维阵列形式排列。
45.一种用于评估有害制剂在环境样品中的存在的装置，该装置包括用于将环境空气中的颗粒沉积在基片上的空气调节系统，用于辐照所述基片的辐射源，用于检测沉积在所述基片上的颗粒的第一种光学性质的第一检测器，用于检测由沉积在所述基片上的颗粒散射的拉曼位移辐射的拉曼检测器，和可操作地连接到所述拉曼检测器的控制器，用于将拉曼位移辐射的检测局限于对其来说所述第一种光学性质表征所述制剂的颗粒。
46.如权利要求45的装置，其中，所述基片是微孔过滤介质。
47.如权利要求46的装置，其中，所述空气调节系统包括通过所述过滤介质抽出环境空气的真空泵。
48.如权利要求46的装置，其中，所述过滤介质的形式是具有长轴的条，并且该装置还包括用于沿其长轴方向推进所述条的驱动装置。
49.如权利要求48的装置，其中，所述控制器协调第一种光学性质的评估、拉曼-散射辐射的评估和所述条的随后推进。
50.如权利要求45-49中任意一项的装置，还包括用于检测沉积在所述基片上的颗粒的第二种光学性质的第二检测器，其中，所述控制器将拉曼位移辐射的检测局限于对其来说所述第一和第二种光学性质表征所述制剂的颗粒。
51.如权利要求50的装置，其中，所述第一种光学性质是显微形态，而所述第二种光学性质是荧光。
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