CN104507915A - 环烷基醚化合物及其作为bace抑制剂的用途 - Google Patents

环烷基醚化合物及其作为bace抑制剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环烷基醚化合物、它们治疗学上可接受的盐、它们的制备方法、此类化合物用于治疗Aβ相关的病理的治疗用途和含此类化合物的药物组合物，所述Aβ相关的病理例如唐氏综合征、β-淀粉样蛋白血管病、阿尔茨海默病、记忆丧失、与阿尔茨海默病有关的注意力缺陷症状、与疾病例如阿尔茨海默病有关的神经变性或痴呆(包括混合型血管和变性源性痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆和与帕金森病有关的痴呆)、进行性核上麻痹或皮质基底变性。式(I)，其中A为-O-或-CH2-，n为0或1。

Description

环烷基醚化合物及其作为BACE抑制剂的用途
技术领域
本发明涉及环烷基醚及其治疗学上可接受的盐、它们的药物组合物、制备它们的方法及它们用作治疗和/或预防多种疾病的药物的用途。本发明具体涉及化合物，所述化合物为β-分泌酶(β-secretase)的抑制剂且因此抑制淀粉样蛋白β(amyloidβ,Aβ)肽的形成并可用于治疗和/或预防Aβ相关病理例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、唐氏综合征(Down’s syndrome)和β-淀粉样蛋白血管病(β-amyloid angiopathy)例如但不限于脑淀粉样蛋白血管病(cerebral amyloid angiopathy)、遗传性脑出血(hereditary cerebral hemorrhage)、与认知缺损(cognitive impairment)相关的病症例如但不限于MCI(“轻度认知缺损(mild cognitive impairment)”)、阿尔茨海默病、记忆丧失(memory loss)、与阿尔茨海默病相关的注意力缺陷症状(attention deficit symptom)、与疾病例如阿尔茨海默病相关的神经变性或痴呆(包括混合型血管和变性源性痴呆(dementia of mixed vascular and degenerative origin)、早老性痴呆(pre-seniledementia)、老年性痴呆(senile dementia)和与帕金森病相关的痴呆)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)或皮质基底变性(cortical basaldegeneration)。
背景技术
区分阿尔茨海默病(AD)的主要神经病理学事件为具有40-42个残基的淀粉样蛋白β-肽(Aβ)在脑实质和大脑血管中的沉积。大量遗传学、生物化学和体内数据支持了Aβ在最终导致AD的病理学级联中的关键作用。患者通常在其60或70岁时出现早期症状(通常为记忆丧失)。疾病随痴呆加重和Aβ沉积增加而进展。另外，微管相关蛋白τ的高磷酸化形式积聚在神经元中，这对神经元的功能造成很大的有害影响。盛行的关于Aβ和τ蛋白病理之间的时间关系的工作假设认为在人类和动物疾病模型中Aβ沉积在τ蛋白聚集前发生。在该背景下值得注意的是，Aβ介导该病理学功能的确切分子性质目前为集中研究的问题。最有可能的是，存在一系列毒性物质，其范围为低阶Aβ低聚物至超分子装配物例如Aβ纤丝。
Aβ肽为I型蛋白APP(Aβ淀粉样蛋白前体蛋白)的整合片段，而I型蛋白APP是一种在人类组织中普遍表达的蛋白质。因为可在血浆和脑脊液(CSF)及培养细胞的培养基中发现可溶性Aβ，所以APP必然经历蛋白水解。存在三种主要的与AD病理生物学相关的APP裂解即所谓的α-、β-和γ-裂解。α-裂解大致在APP的Aβ域的中间进行且通过金属蛋白酶ADAM10或ADAM17(后者也称为TACE)来实现。β-裂解在Aβ的N-末端发生且通过跨膜天冬氨酰基蛋白酶β位点APP裂解酶1(BACE1)来进行。γ-裂解在Aβ的C-末端进行且随后释放肽且通过称为γ-分泌酶的多重亚单位天冬氨酰基蛋白酶来实现。ADAM10/17裂解及随后的γ-分泌酶裂解引起可溶性p3肽的释放，而可溶性p3肽为不能在人类中形成淀粉样蛋白沉积物的N-末端截短型Aβ片段。该蛋白水解途径通常称为非淀粉样蛋白生成途径。BACE1和γ-分泌酶所引起的连续裂解可产生完整的Aβ肽，因此该加工过程称为淀粉样蛋白生成途径。在该现有认识下有可能设想出两种可能减少Aβ产生的途径：刺激非淀粉样蛋白生成加工或抑制或调节淀粉样蛋白生成加工。本申请关注于后一种策略即抑制或调节淀粉样蛋白生成加工。
淀粉样蛋白生成斑块和血管性淀粉样蛋白血管病也是以下患者的脑部特征，所述患者患有第21对染色体三体症(Trisomy 21)(唐氏综合征)、具有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)和其它神经变性障碍。神经原纤维缠结也出现在其它神经变性障碍(包括引起痴呆的障碍)中(Varghese,J.等人,Journal of Medicinal Chemistry,2003,46,4625-4630)。β-淀粉样蛋白沉积物主要为Aβ肽的聚集物，而Aβ肽为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的蛋白水解产物。更具体地，作为β-淀粉样蛋白生成途径的一部分，Aβ肽如下产生：APP在C-末端通过一种或多种γ-分泌酶来裂解且在N-末端通过β-分泌酶(BACE)[也称为天冬氨酰基蛋白酶或Asp2或β位点APP裂解酶(BACE)]来裂解。
BACE的活性与由APP产生Aβ肽直接相关(Sinha等人,Nature,1999,402,537-540)且越来越多的研究表明对BACE的抑制可抑制Aβ肽的产生(Roberds,S.L.等人,Human Molecular Genetics,2001,10,1317-1324)。BACE为膜结合1型蛋白，其被合成为具有部分活性的酶原且在脑组织中大量表达。其被认为代表了主要的β-分泌酶活性且被认为是产生淀粉样β肽(Aβ)的限速步骤。
因此，降低或阻断BACE活性的药物应该在脑中或在Aβ或其片段沉积的其它处降低Aβ水平和Aβ片段水平并由此减缓淀粉样蛋白斑块的形成和AD或其它涉及Aβ或其片段沉积的疾病的进展。因此，BACE就开发用于治疗和/或预防Aβ相关病理的药物而言是重要的候选物，所述Aβ相关病理为例如唐氏综合征、β淀粉样蛋白血管病例如但不限于脑淀粉样蛋白血管病或遗传性脑出血、与认知缺损相关的病症例如但不限于MCI(“轻度认知缺损”)、阿尔茨海默病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意力缺陷症状、与疾病例如阿尔茨海默病相关的神经变性或痴呆(包括混合型血管和变性源性痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆和与帕金森病相关的痴呆)、进行性核上性麻痹或皮质基底变性。
因此，通过用抑制剂例如本申请提供的化合物抑制BACE来抑制Aβ及其部分的沉积是有用的。
抑制Aβ沉积的治疗潜力已促使多个团队分离和表征分泌酶且鉴定它们的潜在抑制剂。
具体实施方式
本发明涉及式(I)化合物或其药用盐，所述式(I)化合物为游离碱：
其中
A为-O-或-CH2-；
n为0或1；
R1为C1-6烷基或C1-6卤代烷基；
R2为C1-6烷基或C1-6卤代烷基；其中所述C1-6烷基或C1-6卤代烷基取代有一个至三个独立地选自以下的基团：C3-6环烷基或C3-6卤代环烷基；
R5和R6独立地为氢、杂环基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基或C1-6烷基，其中所述杂环基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基或C1-6烷基任选地取代有一个或两个独立地选自以下的取代基：卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基或OR9；
或者R5和R6与它们所连接的碳一起形成环B，其为3-14元环烷基或杂环基单环，或9-14元二环环烷基或杂环基环；并且其中环B任选地被一个或两个独立地选自以下的取代基所取代：氧代、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基或OR7；
R7独立地为氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基或C0-6烷基C3-6环烷基；
R8为氢、卤素或甲基。
在一个具体实施方案中，本发明涉及式I化合物或其药用盐，所述式I化合物选自：
(1r,4r)-4-甲氧基-5″-甲基-6'-[(1-甲基环丙基)甲氧基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-[(3,3-二氟环丁基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'R,4R)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'S,4S)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-[(2,2-二氟环丙基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'R,4R)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'S,4S)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；和
(1r,4r)-6'-(2-环丙基乙氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺。
本发明涉及本发明化合物的用途并涉及它们的盐。用于药物组合物的盐应为药用盐，但是其它盐可用于制备本发明化合物。
本发明化合物可按前药形式给药，所述前药在人类或动物体内分解得到本发明化合物。前药的实例包括本发明化合物的体内可水解的酯。含有羧基或羟基的本发明化合物的体内可水解(或可裂解)的酯为例如在人类或动物体内水解产生母体酸或醇的药用酯。前药的各种形式是本领域已知的。
本申请所述定义意在阐明在本申请各处所使用的术语。术语“本申请”指本申请通篇。
本发明所有化合物可按特定的几何异构形式或立体异构形式存在。本发明包括所有这些化合物，包括互变异构体、顺式和反式异构体，R-和S-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、它们的外消旋混合物和它们的其它混合物，这些都在本发明范围内。其它不对称碳原子可存在于取代基(例如烷基)中。所有这些异构体及它们的混合物都包括在本发明中。本申请所述化合物可具有不对称中心。可将包含不对称取代原子的本发明化合物分离成光学活性形式或外消旋形式。如何制备光学活性形式是本领域公知的，例如通过对外消旋形式进行拆分、由光学活性原料进行合成或使用光学活性试剂进行合成。当需要时，外消旋物质可通过本领域已知的方法来分离。烯烃、C＝N双键等的多种几何异构体也可存在于本申请所述化合物中且所有这些稳定的异构体都包括在本发明中。对本发明化合物的顺式和反式几何异构体进行了描述且可将它们分离成异构体的混合物或分离成分开的异构形式。结构的所有手性形式、非对映异构形式、外消旋形式和所有几何异构形式都包括在本发明中，除非具体指明了特定的立体化学或异构形式。
本申请使用的“药用”指这样的化合物、物质、组合物和/或剂型，它们在合理的医药判断范围内适用于与人类组织和动物组织接触而没有过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症且与合理的益处/风险比相称。
本申请使用的“药用盐”指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸加成盐或碱加成盐来改性。药用盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐、酸性残基(例如羧酸)的碱盐或有机盐等。药用盐包括母体化合物的无毒盐或季铵盐，其例如由无毒无机酸或有机酸来制备。例如，所述无毒盐包括由无机酸(例如盐酸)衍生的那些盐。
本发明药用盐可由包含碱性部分或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法来合成。通常，所述盐可如下制备：使游离酸形式或游离碱形式的这些化合物与化学计量的合适的碱或酸在水或有机溶剂或这二者的混合物中反应；通常使用非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。
本发明还包括本发明化合物的所有互变异构形式。
本申请使用的“互变异构体”指由于氢原子迁移而平衡存在的其它结构异构体。例如酮-烯醇互变异构，其中所得化合物既具有酮的性质又具有不饱和醇的性质。互变异构的其它实例包括2H-咪唑-4-胺及其互变异构体即1,2-二氢咪唑-5-亚胺和2H-咪唑-4-硫醇及其互变异构体即1,2-二氢咪唑-5-硫酮。应该理解的是，在本说明书通篇所表示的化合物中仅描绘或命名了化合物的可能互变异构体中的一种。
本申请使用的“稳定的化合物”和“稳定的结构”指这样的化合物，其足够稳定以经受得住由反应混合物分离至有用的纯度和配制成有效的治疗剂。
本发明化合物还包括水合物和溶剂化物。
本发明还包括同位素标记的本发明化合物。“同位素标记”或“放射性标记”的化合物是这样的本发明化合物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中常见原子质量或质量数的(即天然存在的)原子代替。可结合在本发明化合物中的合适的放射性核素包括但不限于2H(也写作D且表示氘)、3H(也写作T且表示氚)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。结合在放射性标记的本发明化合物中的放射性核素将取决于该放射性标记的化合物的具体应用。例如，就体外受体标记和竞争测定而言，结合有3H、14C、82Br、125I、131I或35S的化合物通常将是最有用的。就放射性成像应用而言，11C、18F、125I、123I、124I、131I、75Br、76Br或77Br通常将是最有用的。
应该理解的是，“放射性标记的化合物”是结合有至少一个放射性核素的化合物。在一些实施方案中，所述放射性核素选自3H、14C、125I、35S和82Br。
本发明化合物可按以下方式来给药：口服、胃肠外、口腔、阴道、直肠、吸入、吹入、舌下、肌内、皮下、局部、鼻内、腹膜内、胸内、静脉内、硬膜外、鞘内、脑室内和注射到关节中。
剂量将取决于给药途径、疾病的严重度、患者的年龄和体重以及在确定最适于特定患者的个别方案和剂量水平时主治医师通常考虑的其他因素。
化合物的给药量将随所治疗的患者而变化且将为每天约100ng/kg体重至100mg/kg体重。例如，剂量可由本领域技术人员根据本申请公开的内容和本领域的知识来容易地确定。因此，本领域技术人员可容易地确定化合物及任选的添加剂、媒介物和/或载体在组合物中的量和在本发明方法中的给药量。
在另一个方面，本发明涉及本发明化合物或其药用盐，其用作例如用于治疗或预防Aβ相关病理的药物。
在另一个方面，本发明涉及本发明化合物或其药用盐在制备用于治疗或预防Aβ相关病理的药物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及在哺乳动物(例如人类)中治疗或预防Aβ相关病理的方法，其包括向有此需要的哺乳动物给药治疗有效量的本发明化合物或其药用盐。
因此，本发明化合物及其药用盐提供治疗Aβ相关病理的方法，所述Aβ相关病理为例如但不限于阿尔茨海默病、唐氏综合征、β-淀粉样蛋白血管病、脑淀粉样蛋白血管病、遗传性脑出血、与认知缺损相关的障碍、MCI(“轻度认知缺损”)、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意力缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合型血管源性痴呆、变性源性痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森病相关的痴呆、进行性核上性麻痹、创伤性脑损伤和皮质基质变性。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性成分的治疗有效量的本发明化合物或其药用盐及至少一种药用赋形剂、载体或稀释剂。
在另一个方面，本发明涉及用本发明化合物抑制BACE活性的方法。
在另一个方面，本发明涉及在哺乳动物(例如人类)中治疗或预防Aβ相关病理的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的本发明化合物或其药用盐和至少一种认知增强剂、记忆增强剂或胆碱酯酶抑制剂，其中所述Aβ相关病理为阿尔茨海默病。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含(i)本发明化合物或其药用盐；(ii)其它治疗剂或其药用盐；和(iii)药用赋形剂、载体或稀释剂。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含(i)本发明化合物或其药用盐；(ii)至少一种选自认知增强剂、记忆增强剂和胆碱酯酶抑制剂的药物；和(iii)药用赋形剂、载体或稀释剂。
本申请定义的对Aβ相关病理的治疗可按单一疗法来应用或除本发明化合物外还可涉及与对一种或多种本申请所述病症具有治疗价值的常规疗法的联合治疗。所述常规疗法可包括一种或多种以下类别的药物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、认知和/或记忆增强剂或非典型抗精神病药。认知增强剂、记忆增强剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂包括但不限于多奈派齐(Aricept)、加兰他敏(Reminyl或Razadyne)、利伐斯的明(Exelon)、他克林(Cognex)和美金刚(Namenda、Axura或Ebixa)。非典型抗精神病药包括但不限于奥氮平(商品名为Zyprexa)、阿立哌唑(商品名为Abilify)、利培酮(商品名为Risperdal)、喹硫平(商品名为Seroquel)、氯氮平(商品名为Clozaril)、齐拉西酮(商品名为Geodon)和奥氮平/氟西汀(商品名为Symbyax)。
所述联合治疗可通过同时、先后或分开给药各个治疗组分来实现。所述组合产品使用本发明化合物。
其它常规化学疗法可包括以下类别的药物中的一种或多种：(i)抗抑郁药、(ii)非典型抗精神病药、(iii)抗精神病药、(iv)抗焦虑药、(v)抗惊厥药、(vi)目前使用的阿尔茨海默病疗法、(vii)帕金森病疗法、(viii)偏头痛疗法、(ix)中风疗法、(x)尿失禁疗法、(xi)神经性疼痛疗法、(xii)伤害性疼痛疗法、(xiii)失眠疗法和(xiv)情绪稳定剂。上述疗法的已知治疗可与本申请所述发明联用。
此类组合产品使用在本申请所述剂量范围内的本发明化合物和在所批准的剂量范围或出版物中描述的剂量内的其它药物活性化合物。
化合物的制备
本发明化合物可通过下述方法来制备成游离碱或其药用盐。在以下描述此类方法的通篇中应该理解的是，在合适的情况下可按有机合成领域技术人员所容易理解的方式将合适的保护基加到各种反应物和中间体中且随后从所述反应物和中间体中除去所述保护基。使用此类保护基的常规方法及合适的保护基实例例如参见Protective Groups in Organic Synthesis by T.W.Greene,P.G.M Wutz,3rd Edition,Wiley-Interscience,New York,1999。应当理解的是，可替换地使用微波(MW)来加热反应混合物。本发明的另一个方面提供了用于制备式(I)化合物或其药用盐的方法，其中除非另有说明，否则R1-R8、n和A如上文中对式(I)所定义，或者为可在后续转换中转化成R1-R8或A的基团。式(Ia)化合物可相当于式(I)化合物。R9被定义为OR2或者为基团，例如离去基团(例如卤素)，在后续转换中可将其转化成OR2。式(X)化合物可相当于式(I)化合物。LG表示离去基团，例如卤素(例如氯、溴或碘)或烷基-、芳基-、或卤代烷基-磺酸酯基(例如三氟甲磺酸酯基(triflate))且PG表示保护基。所述方法包括：
方法(i)：式(IIIa)相应化合物的形成：
方案1
在合适的亲电体例如丙烯酸甲酯、(经双取代的)烷基卤化物、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯存在下，用合适的碱例如氢化钠、KOtBu或LDA处理式(II)的酮，得到式(IIIa)化合物(方案1)。所述反应可在0℃至+90℃的温度范围内在合适的溶剂例如四氢呋喃、2-Me THF或二甲基甲酰胺中进行。烷基化可与分离和纯化中间体以按序方式或以一釜逐步方式进行。如果反应得到取代有酯、烯烃、氰基、砜、锍供体等的产物，则可任选地通过Dieckman环化、RCM、亲核取代或环加成使其进一步反应。所得螺环可任选地含有一个或多个取代基，其可通过已知官能团转换来进一步转化，所述官能团转换例如脱羧基、将酮还原为醇和将所述醇转化为醚。
方法(ii)：式(IIIa)相应化合物的形成：
方案2
式(II)的酮与醛或酮例如甲醛在室温至+100℃的温度范围内在三氟乙酸N-甲基苯胺鎓(anilinium)存在下，在合适的溶剂例如THF、苯或甲苯中反应(方案2)。可利用Diels-Alder反应在室温0℃至+90℃的温度范围内任选地在密封管中使用其中Z和Y被定义为例如氢或烷基的中间体(IV)与各种二烯例如(丁-1,3-二烯-2-基氧基)三甲基甲硅烷反应。反应可在无溶剂(neat)下或在合适的溶剂例如二氯甲烷、苯、甲苯、THF或2-Me THF中进行。可加入可有助于反应的Lewis酸或任意其它试剂以得到富集的对映异构体或非对映异构体。所得螺环可任选地含有一个或多个取代基，其可通过已知的官能团转换而进一步转化，所述官能团转换例如脱羧基、将酮还原为醇和将所述醇转化为醚。
方法(iii)式(VII)相应化合物的形成：
方案3
通过使式(III)化合物与式(V)化合物进行反应可得到式(VII)化合物(方案3)，其中R11为烷基(例如叔丁基)。反应在合适的Lewis酸中进行，所述Lewis酸例如式(VI)化合物，其中R12为烷基(例如乙基或异丙基)。反应在合适的溶剂(例如二氯甲烷、2-甲基-四氢呋喃或四氢呋喃)中在室温至回流温度的温度进行，其任选地用共沸蒸馏以除去反应中所形成的醇。
方法(iv)式(X)相应化合物的形成：
方案4
通过使式(VII)化合物(其中R11为烷基(例如叔丁基)(方法(iii)，式VII))进行反应，使用除去磺酰胺保护基的合适方法以形成亚胺(VIII)，可得到式(VIII)化合物(方案4)。合适的方法可为但不限于在干燥条件下在合适的溶剂(例如二噁烷或四氢呋喃)中用酸例如盐酸处理所述化合物VII。可分离化合物(VIII)或不经进一步分离使其进行反应。式(VIII)的化合物与2-氧代环丙烷硫代酰胺(述于Asinger et al.Justus Liebigs Annalen der Chemie 1971,vol 744,p.51-64)任选地在原甲酸三乙酯存在下，在溶剂例如甲醇中，在室温至回流温度的温度，任选地在Dean-Stark条件下，进一步反应，得到式(IX)化合物。通过使式(IX)的中间体与氨反应可使其转换为式(X)化合物。如果将方案4所述方法中的2-氧代丙烷硫代酰胺换成2-氧代丁烷硫代酰胺，将会得到式(IXb)和(Xb)化合物，而不是式(IX)和(X)化合物。
方法(v)式(I)相应化合物的形成：
方案5
在过渡金属催化剂例如钯催化剂例如乙酸钯(II)存在下，任选地在合适的配体例如例如二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3-甲氧基-6-甲基联苯-2-基)膦或2-(二叔丁基膦基)-1,1’-联萘存在下，通过使式(XIV)化合物(其中LG表示离去基团，例如卤素(例如碘化物或溴化物)，Pg1和Pg2表示氢和/或合适的保护基例如叔丁氧基羰基)与式(XV)的醇进行反应，可制备式(XVI)化合物(方案5)。所述反应在合适的碱例如碳酸铯存在下，在合适的溶剂例如THF、2-甲基-四氢呋喃或甲苯中，在20℃至160℃的温度进行。在水存在下，在60℃至100℃的温度，通过与NH3的溶液(例如在甲醇中的溶液)进行反应，可由式(XVI)化合物(其中Pg1和/或Pg2为叔丁氧基羰基)得到式(I)化合物。
式(II)、(V)、(VI)、(XIII)和(XV)化合物为市售化合物，或者为文献中已知的，或者它们可通过本领域中已知的标准方法来制备。
一般方法
所用的所有溶剂均为分析级并且常规地使用市售无水溶剂进行反应。所用的起始物质可从商品化来源得到，或者根据文献操作制备。室温是指20-25℃。溶剂混合物组成以体积百分比或体积比给出。
微波加热在以2450MHz产生连续辐照的Biotage Creator、Initiator或Smith Synthesizer单模式微波空腔中进行。应当理解的是，可使用微波加热反应混合物。
在Merck TLC板(硅胶60F254)上进行薄层色谱(TLC)并使斑点UV可见。正相(Straight phase)快速柱色谱(“快速色谱”)在Merck硅胶60(0.040-0.063mm)上手动进行，或者使用ISCOCompanionTM系统使用RediSepTM正相(normal-phase)快速柱使用所标明的溶剂系统自动进行。任选地在相分离器上进行相分离。
在装有合适构型的探针的400-600MHz NMR光谱仪上记录NMR光谱。除非另有说明，否则在环境温度记录光谱。化学位移以自TMS(0.00ppm)向低场和高场移动的ppm给出。在1H-NMR中使用下列参考信号：TMSδ0.00，或者以下残留溶剂信号：DMSO-d6δ2.49，CD3ODδ3.30，丙酮-d62.04或CDCl3δ7.25(除非另有说明)。共振多重性用s、d、t、q、m、br和app分别表示单峰、双峰、三重峰、四重峰、多重峰、宽峰和明显峰。在一些情况下，仅报道诊断信号。
HPLC、HPLCMS和LCMS分析：在反相(RP)柱上进行高压液相色谱(HPLC)。使用例如流动相A(10mM NH4OAc在5％CH3OH或5％CH3CN(水溶液)或0.1％NH3(水溶液)或0.1％甲酸(水溶液)中的溶液)和B(CH3OH或CH3CN)施加线性梯度。质谱(MS)分析使用电喷雾电离(ESI+/-)和/或大气压化学电离(APCI+/-)以正离子和/或负离子模式进行。
GCFID和GCMS分析：在装备有质谱仪(MS)或火焰电离检测器(FID)的GC上进行气相色谱(GC)。MS离子源为电子轰击(EI)或化学电离(CI，反应气体甲烷)。对于分离，使用毛细管柱，例如DB-5MS(J&W Scientific)。施加线性温度梯度。
在具有组合自动取样器的自动馏分收集器(Waters 2767)、梯度泵(Waters2525)、柱转换器(Waters CFO)和PDA(Waters 2996)的Waters FractionLynx系统上运行制备型色谱。柱；Prep C8 10μm OBDTM19x 300mm，具有保护柱；Prep MS C8 10μm 19x 10mm Cartridge。以流速20ml/min施加A(95％0.1M NH4OAc的MilliQ水溶液和5％MeCN)在B(100％MeCN)中的梯度或者A(95％0.1M NH4OAc的MilliQ水溶液和5％MeOH)、A(0.2％NH3的MilliQ水溶液)或A(0.2％甲酸的MilliQ水溶液)在B(100％MeOH)中的梯度来进行LC-分离。在例如系统上使用指定的柱和流动相系统运行制备型手性色谱以分离异构体。
SFC分析：在正相柱上进行超临界流体色谱(SFC)。使用流动相A(CO2)和例如流动相B(MeOH、EtOH或IPA)施加等度流动(isocratic flow)。
正相HPLC分析：在正相柱上进行高压液相色谱(HPLC)。使用例如流动相A(庚烷)和B(EtOH或IPA)施加线性梯度或等度流动。
高分辨质谱(HRMS)：在装备有LockSpray源并连接至具有PDA检测器和Acquity UPLC BEH C18柱的Acquity UPLC系统的Waters Synapt-G2质谱仪上进行精确的质量测量。所测量的质量确定3ppm以内的元素组成。
缩写
ACN         乙腈
aq          含水的
Atm         大气压
Boc         叔丁氧基羰基
Borax       四硼酸二钠或硼酸钠或四硼酸钠
Cbz         苄基氧基羰基
CDI         1,1'-羰基二咪唑
dba         二亚苄基丙酮
DCM         二氯甲烷
DEA         二乙胺
DIBAL-H    二异丁基氢化铝
DIPEA      二异丙基乙基胺
DMAP       4-二甲基氨基吡啶
DME        1,2-二甲氧基乙烷
DMF        N,N-二甲基甲酰胺
DMSO       二甲基亚砜
dppf        1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁
Et2O       乙醚
EtOAc      乙酸乙酯
EtOH       乙醇
eq.或equiv.当量
h          小时
HPLC       高效液相色谱
IPA        异丙醇
LCMS       液相色谱质谱
LiHMDS     双(三甲基甲硅烷基)氨基锂
MeOH       甲醇
min        分钟
MS         质谱
MW         微波
NH4OAc     乙酸铵
NMR        核磁共振
ox         氧化
Psi        磅/平方英寸
quant.     定量的
RCM        闭环易位(ring closing metathesis)
r.t.       室温
sat.       饱和的
SFC        超临界流体色谱
TFA        三氟乙酸
THF        四氢呋喃
TLC        薄层色谱
TMEDA      四甲基乙二胺
UPLC       超高效液相色谱
2-Me THF   2-甲基四氢呋喃
化合物已使用来自Advanced Chemistry Development,Inc.(ACD/Labs),Toronto ON,Canada,www.acdlabs.com的CambridgeSoft MedChem ELN v2.2或ACD/Name,version 10.0或10.06版或12.01版软件，或者来自OpenEye的Lexichem,1.9版软件命名。
中间体
中间体1
2-氧代丙烷硫代酰胺
向THF(1700mL)和乙酰氰(250mL,3.15mol)的-10℃溶液中鼓泡H2S大约45min。停止鼓泡，并搅拌溶液直至温度为-10℃。再鼓泡通入H2S直至温度稳定在-10℃。以将温度保持在0℃至-3℃的速率逐滴加入三乙胺(2.2mL,15.8mmol)在THF(20mL)中的溶液(极度放热的反应)。加入完成后，将温度设置为+4℃并将混合物搅拌过夜。用氮气吹洗反应混合物30min并将混合物浓缩，得到标题产物(319g，98％产率)。1H NMR(500MHz,CDCl3)ppm 2.67(s,3H),7.30-7.81(m,1H),7.97-8.52(m,1H)；13C NMR(126MHz,CDCl3)ppm 25.1,190.8,192.5；MS(ES+)m/z 104[M+H]+。
中间体2
6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮
方法A
在冰浴中冷却下，向6-溴-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(11.8g,55.7mmol)和丙烯酸甲酯(11.1mL,123mmol)在THF(55mL)中的溶液中分份加入叔丁醇钾(7.50g,66.8mmol)。在室温搅拌1.5h。加入水(80mL)和KOH(3.12g,55.7mmol)，将混合物加热至75℃，然后在60℃加热过夜。将混合物冷却至0℃，滤出形成的析出物并在真空中干燥，得到标题化合物(11.69g,72％产率)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δppm 1.83-1.92(m,2H),2.15-2.27(m,2H),2.40-2.50(m,2H),2.71(dt,2H),3.17(s,2H),7.39(d,1H),7.75(dd,1H),7.92(d,1H)；MS(ES+)m/z 293[M+H]+。
方法B
将6-溴-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(800g,3.79mol)和丙烯酸甲酯(787mL,8.72mol)在2-Me THF(4L)中的溶液在28℃搅拌。逐滴加入叔戊醇钾在甲苯中的溶液(1.7M,2.68L,4.55mol)，保持温度为30℃至43℃。将混合物在25℃搅拌0.5h。加入水(4L)并在10min后加入KOH(383g,6.82mol)。将混合物加热回流，历时4h蒸馏出有机溶剂。将混合物冷却至10℃，滤出形成的析出物并在真空中干燥，得到标题化合物(837g,75％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 1.74-1.85(m,2H),1.94(m,2H),2.34(m,2H),2.52-2.60(m,2H),3.27(s,2H),7.60(d,1H),7.79-7.83(m,1H),7.89(m,1H)；MS(ES+)m/z 293[M+H]+。
方法C
在约20-30℃，向6-溴-1-茚满酮(8.00kg,37.9mol)、THF(16L)和叔丁醇钾(210g,1.87mol)的混合物中，分三等份(每份2.2L,24.6mol)逐步加入丙烯酸甲酯(6.6L,73mol)。在加入第一份丙烯酸甲酯后，加入溶于THF(0.39L)的另外的叔丁醇钾(86g,0.77mol)。在加入第二份丙烯酸甲酯后，再加入溶于THF(0.39L)的叔丁醇钾(86g,0.77mol)。然后在约20-30℃，再逐步加入叔丁醇钾(4.64kg,41.3mol)在THF(21L)中的溶液。在约65℃蒸发出溶剂(21.5L)，然后历时约10min，在低于60℃，加入水(49L)和50％KOH水溶液(2.3L,30mol)的混合物。将反应混合物在60℃保持约6h，然后历时1h将其冷却至20℃，然后在20℃保持约12h后进行过滤。将固体用水(8L)和THF(4L)的混合物洗涤，然后干燥，得到标题化合物(7.47kg,在92％w/wNMR测定下,23.4mol,62％产率)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.78-1.84(m,2H),1.95(td,2H),2.32–2.38(m,2H),2.51-2.59(m,2H),3.27(s,2H),7.60(d,1H),7.81(m,1H),7.89(m,1H).
中间体3
6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
方法A
将6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(中间体2,6.1g,20.8mmol)溶于THF(220mL)并冷却至-65℃。加入硼氢化钠(0.354g,9.36mmol)并将冷却浴移开。使混合物达到0℃(大约30min)。加入水(10mL)，并通过蒸发除去大部分有机溶剂。将残余物在EtOAc(100mL)和NaCl水溶液(50mL)之间分配。将有机相干燥(MgSO4)并蒸发，得到产物，将其与由14.6g 6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮起始以类似方式得到的其它产物合并。通过快速色谱(120g硅胶，梯度洗脱：CH2Cl2:CH2Cl2/MeOH(90:10))进行纯化，得到13.6g(66％产率)标题化合物。所得物质由异构体1和异构体2的80:20混合物组成。通过快速色谱(庚烷/EtOAc梯度)分离异构体的分析样品，得到：
异构体1：(1r,4r)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.20-1.43(m,4H),1.49-1.62(m,2H),1.79-1.89(m,2H),2.99(s,2H),3.39-3.50(m,1H),4.68(d,1H),7.56(d,1H),7.76(d,1H),7.85(dd,1H)；MS(ES+)m/z 317[M+Na]+和
异构体2：(1s,4s)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.07-1.20(m,2H),1.51-1.63(m,2H),1.65-1.76(m,2H),1.93(td,2H),2.98(s,2H),3.83(d,1H),4.45(d,1H),7.51-7.55(m,1H),7.76(d,1H),7.84(dd,1H)；MS(ES+)m/z 317[M+Na]+。
中间体3，异构体1
方法B
在0℃，向6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(中间体2,50.5g,172mmol)在DCM(250mL)中的溶液中慢慢加入甲硼烷叔丁胺络合物(5.70g,65.5mmol)在DCM(50mL)中的溶液。40min后，加入浓HCl(20mL)，接着加入20％NaCl(70mL)。使混合物达到室温并将其搅拌30min。分离各相并向水相中加入DCM(40mL)和H2O(10mL)。将有机相合并，浓缩并在真空中干燥过夜，得到标题化合物(52.4g,100％产率)，为标题产物(83％产率)和其它非对映异构体(1s,4s)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(17％)的混合物：1H NMR(500MHz,CDCl3,两种异构体的信号)ppm 1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 1.39-1.50(m,3H),1.67-1.85(m,3H)2.05-2.12(m,2H)2.96(s,0.34H),2.98(s,1.68H),3.76(m,0.83H),4.04(m,0.17H),7.34(m,1H)7.70(m,1H)7.88(d,1H)；MS(ES+)m/z 295[M+H]+。
中间体3，异构体1
方法C
将6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(中间体2,750g,2.56mol)和丙-2-醇(9.855L)加热回流，并向混合物中分两份加入磨碎的NaOH(100g,2.50mol)。将混合物加热回流2h。通过真空蒸馏除去5L溶剂。加入甲苯(2L)并通过真空蒸馏除去2L溶剂。在搅拌下向混合物中加入甲苯(3L)，接着加入2M HCl(1.278L,2.56mol)。分离各相并用水(2.0L)洗涤有机相。浓缩有机相，加入甲苯(2L)，然后浓缩混合物。加入2-Me THF(1L)，然后通过真空蒸馏除去0.5L溶剂，所得混合物用于下一步骤中。标题化合物为非对映异构体(1s,4s)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮的7:3比率的混合物(通过HPLC和NMR分析确定)：1H NMR(500MHz,CDCl3,两种异构体的信号)ppm 1.40-1.52(m,3H),1.70-1.84(m,3H),2.04-2.11(m,2H),2.97(s,0.62H),3.00(s,1.38H),3.73-3.81(m,0.7H),4.04(m,0.3H),7.31-7.38(m,1H),7.67-7.73(m,1H),7.89(m,1H).
中间体4
6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
方法A
在N2下，将6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮的异构体混合物(中间体3,12.7g,43.0mmol)溶于THF(210mL)中并冷却至0℃。逐份加入叔丁醇钾(5.79g,51.6mmol)并将混合物在0℃搅拌25min。加入碘甲烷(4.30mL,68.8mmol)。移开冷却浴，并将混合物在室温搅拌。在2h和3h后，分别再加入叔丁醇钾(0.483g,4.30mmol)两次，然后将混合物搅拌2h。加入水(100mL)并将所得溶液在NaCl水溶液(200mL)和EtOAc(200mL)之间分配。用另一份EtOAc(100mL)萃取水相。将合并的有机相干燥(MgSO4)并蒸发，得到12.5g(94％产率)以下产物的混合物(大约80:20)：
异构体1：(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮：
和异构体2：(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,异构体1的信号)δppm 1.20-1.32(m,2H),1.40-1.48(m,2H),1.51-1.62(m,2H),1.97-2.07(m,2H),3.00(s,2H),3.15-3.23(m,1H),3.26(s,3H),7.56(d,1H),7.77(d,1H),7.86(dd,1H)；MS(ES+)m/z 309[M+H]+。
中间体4，异构体1
方法B
在N2下，将(1r,4r)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体3,异构体1,50.9g,172mmol)(含17％的(1s,4s)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮)、碘甲烷(18.3mL,293mmol)和2-Me THF(360mL)加热至30℃。历时30min，逐滴加入叔戊醇钾在甲苯中的溶液(1.7M的甲苯溶液,203mL,344mmol)。使混合物达到室温并将其搅拌1h。加入水(250mL)，搅拌10min后，分离各相。用水(140mL)洗涤有机相，将其浓缩并在真空中干燥，得到固体。向固体中加入300mL MeOH并将混合物加热回流。加入水(30mL)，接着回流5min。使混合物慢慢达到室温。将混合物在室温搅拌过夜。滤出固体，得到标题化合物，为单一异构体(31g,58％产率)：1H NMR(500MHz,CDCl3)ppm 1.38(m,2H)1.52(m,2H)1.77(td,2H)2.16(m,2H)2.98(s,2H)3.28(m,1H)3.40(s,3H)7.35(d,1H)7.70(dd,1H)7.88(d,1H)；MS(ES+)m/z 309[M+H]+。
中间体4，异构体1
方法C
在约0-5℃，历时约40min，向6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(中间体2,7.46kg,在92％w/w NMR测定下,23.4mol)在DCM(41L)中的浆液中加入溶于DCM(3.6L)的甲硼烷叔丁胺络合物(820g,9.4mol)。约1h后，加入NaCl(2.68kg)、水(12.9L)和37％盐酸(2.5L,31mol)的溶液。将混合物温热至约15℃，并在沉降分层后分离各相。将含(1r,4r)-6'-溴-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体3,异构体1)的DCM相与甲磺酸甲酯(2.59L,30.5mol)和四丁基氯化铵(130g,0.47mol)一起放回到反应器中。然后历时约1h，在约20℃，向剧烈搅拌的反应混合物中加入50％NaOH水溶液(13L,229mol)。保持约16h后，加入水(19L)，分离各相后弃去水相。在大气压下蒸馏出溶剂(34L)，然后蒸馏出更多溶剂(20L)，同时以5等份加入EtOH(20L)。加入EtOH(14L)并将溶液冷却至25℃。在冷却期间在40℃取出样品(0.3L)。样品自然结晶，在25℃将其再次加入到反应器中。重新加热至约40℃后，历时约20min加入水(14L)。将浆液冷却至约20℃并在过滤前保持16h。用水(4.8L)和EtOH(6.4L)的混合物洗涤固体，然后干燥，得到标题化合物(HPLC-分析显示含4.6％异构体2：(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮)(5.57kg,在91％NMR测定下,16.4mol,70％产率)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 1.22-1.32(m,2H),1.41-1.48(m,2H),1.56(td,2H),1.99-2.07(m,2H),3.01(s,2H),3.16–3.23(m,1H),3.27(s,3H),7.56(d,1H),7.77(d,1H),7.86(dd,1H).
中间体5
(N-(5'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺)
方法A
将6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体4,异构体的混合物,1.14g,3.69mmol)、2-甲基丙-2-亚磺酰胺(0.670g,5.53mmol)和乙醇钛(1.519mL,7.37mmol)溶于2-Me THF(8mL)中并加热回流26h。将反应混合物冷却至室温，并在搅拌下加入EtOAc(80mL)和NaHCO3(饱和的,15mL)。然后不经搅拌放置15min。经由过滤收集有机相，以MgSO4干燥并浓缩。用0-20％EtOAc/正庚烷的梯度进行快速色谱，得到标题化合物(1.00g,66％产率)。1H NMR(500MHz,CD3CN,主要异构体的信号)δppm 0.85-0.91(m,1H),1.27(s,9H),1.25-1.86(多重峰,5H),2.01-2.10(m,2H),3.02(br.s,2H),3.18-3.26(m,1H),3.31(s,3H),7.37(d,1H),7.67(dd,1H),8.59(br.s.,1H),MS(ES+)m/z 413[M+H]+。
中间体5，异构体1
N-((1r,4r)-5'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺
方法B
将(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体4,异构体1,方法B,31g,100mmol)、2-甲基丙-2-亚磺酰胺(15.8g,130mmol)、2-MeTHF(200mL)和乙醇钛(41.3mL,200mmol)加热至100℃，在74℃得到共沸物。继续共沸蒸馏8h，然后将混合物回流过夜。再继续共沸蒸馏8h，然后将混合物回流过夜。将混合物冷却至室温。再加入2-Me THF，得到原始浓度的混合物。制备硫酸(11.14mL,200.5mmol)和Na2SO4(35.6g,250mmol)在水(150mL)中的混合物。然后历时20min将反应混合物加入到4/5体积的酸性溶液中。分离各相，先后用剩余的酸性溶液、乙酸铵(15.46g,200.5mmol)在水(75mL)中的溶液和水(75mL)洗涤有机相。将有机相浓缩并在真空中干燥过夜，得到标题化合物(40.8g,99％产率)：MS(ES+)m/z 412[M+H]+。
中间体6
6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺
方法A
向N-(5'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺(中间体5,异构体的混合物,2g,4.85mmol)在无水1,4-二噁烷(25mL)中的溶液中加入4M HCl在1,4-二噁烷中的溶液(12.12mL,48.50mmol)。立即有白色析出物形成，在氮气气氛下，将所得浑浊的(cloudy)混合物在室温搅拌90min。加入Et2O(30mL)，滤出固体并用Et2O洗涤。将固体在DCM(40mL)与饱和NaHCO3水溶液(40mL)之间分配。分离各相并浓缩有机层。标题化合物(1.41g)直接用于下一步骤中。MS(EI)m/z 307M+。
方法B
中间体6，异构体1
(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺盐酸盐
历时5min，向溶于Et2O(30mL)和DCM(30mL)中的N-((1r,4r)-5'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺(中间体5,异构体1,40.8g,98.9mmol)逐滴加入HCl(2M的Et2O溶液,99mL,197mmol)。搅拌混合物60min，然后过滤。用Et2O洗涤滤饼并在真空中干燥，得到标题化合物(31.3g,92％产率)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 1.28(m,2H)1.70(d,2H)2.04(m,4H)3.17(s,2H)3.23(m,1H)3.28(s,3H)7.61(d,1H)8.04(dd,1H)8.81(s,1H)；MS(EI)m/z 307M+。
方法C
中间体6，异构体1
在约82℃，通过与乙醇钛(IV)(24mL,115mmol)和2-Me THF(44mL)加热，使(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体5,异构体1,19.20g在91％NMR测定下,56.5mmol)与2-甲基丙-2-亚磺酰胺(8.90g,73.5mmol)进行反应。分别在加热0.5h、7.5h和8h后蒸馏出三份溶剂(每份约26mL)，并且在完成每次蒸馏后再加入2-Me THF(每份26mL，三份)。17.5h后蒸馏出另一部分溶剂(约26mL)。将反应混合物冷却至室温，用DCM(52.5mL)稀释，然后历时约4min逐步加入到由Na2SO4(17.9％w/w)、水(72.2％w/w)和硫酸(9.9％w/w)制备的溶液(92mL,113g)中。使用DCM(52.5mL)洗涤反应烧瓶和滴液漏斗，然后加入到后处理(work-up)烧瓶中。分离各相后，用水(17.5mL)和由Na2SO4(17.9％w/w)、水(72.2％w/w)和硫酸(9.9％w/w)制备的溶液(18.5mL,23g)的混合物洗涤有机相。将混合物与Na2SO4(8.75g)搅拌约6h。过滤浆液并用DCM(17.5mL)洗涤滤饼。通过蒸馏出溶剂(约108mL)浓缩合并的滤液。再加入DCM(52.5mL)并蒸馏出相同体积的溶剂(52.5mL)。将无水的溶液冷却至约20℃并用DCM(17.5mL)和EtOH(8.7mL)稀释。然后历时约20min逐步加入HCl(2M的Et2O溶液)(34mL,68mmol)。将所得浆液在约20℃保持约45min，然后过滤。用由等体积的DCM和Et2O制备的溶液(每份17.5mL，三份)洗涤滤饼，然后在真空中干燥，得到标题化合物，其含有约4％另一种异构体(17.41g在88％w/w NMR测定下,44.4mmol,79％产率)(在NMR测定中检测到6.8％w/w残余的DCM和2.9％w/w氯化铵)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 1.30(m,2H),1.70(d,2H),1.98(m,2H),2.10(m,2H),3.17(s,2H),3.23(m,1H),3.29(s,3H),7.61(d,1H),8.04(dd,1H),8.75(d,1H),12.90(br s,2H).
中间体7
6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮
方法A
将6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺(中间体6,1.41g,4.57mmol)和2-氧代丙烷硫代酰胺(中间体2,1.42g,13.7mmol)溶于无水MeOH(30mL)中，在氮气气氛下将所得溶液加热至60℃。15h后，将反应混合物冷却至室温。形成析出物，将其滤出并在真空中干燥，得到标题化合物(1.16g,64％产率)，为异构体的混合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.18(m,4H),1.47(m,2H),1.87(m,2H),2.27(m,3H),3.03(m,3H),3.20(s,3H),6.98(d,1H),7.34(d,1H),7.51(dd,1H)；MS(APCI+)m/z 394[M+H]+。
方法B
中间体7,异构体1
(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2'-咪唑]-4″(3″H)-硫酮
将(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺盐酸盐(中间体6,异构体1,95g,200mmol)(含30％(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺盐酸盐)在DCM(600mL)和2M NaOH水溶液(400mL)之间分配。浓缩有机相，加入2-丙醇(200mL)并将混合物浓缩。将所得(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺、原甲酸三甲酯(66mL,602mmol)和2-丙醇(300mL)加热至80℃。历时40min，加入2-氧代丙烷硫代酰胺(51.5g,500mmol)在2-丙醇(250mL)中的溶液，同时使温度保持在65℃以上。将反应混合物在75℃搅拌2h。将混合物浓缩至约1/2体积并在0℃放置过夜。滤出所形成的固体，并在40℃在真空柜(vacuum cabinet)中干燥3h，得到标题化合物(61.24g,78％产率,含14％(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2'-咪唑]-4″(3″H)-硫酮)：MS(EI)m/z 392M+。
中间体8
6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
方法A
将6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮(中间体7,0.936g,2.38mmol)吸收在氨(7M的MeOH溶液,10mL,70.00mmol)中，用氩气对所得混合物进行鼓泡，然后在微波反应器中在120℃加热1h。蒸发溶剂。加入氨(7M的MeOH溶液,6mL,42mmol)，用氩气对反应混合物进行鼓泡并使用微波在120℃再加热60min。蒸发溶剂并加入氨(7M的MeOH溶液,10mL,70mmol)。用氩气对反应混合物进行鼓泡，然后使用微波在120℃加热2h。蒸发溶剂，加入氨(7M的MeOH溶液,15mL,105mmol)并在120℃再加热2h。蒸发溶剂，加入氨(7M的MeOH溶液,15mL,105mmol)并在120℃再加热2h。蒸发溶剂，加入氨(7M的MeOH溶液,20mL,140mmol)。使用微波将反应混合物在120℃再加热1h。蒸发溶剂，将所得残余物吸收在DCM(60mL)和盐水(x2)中，倾入相分离器中。用MgSO4干燥有机相，过滤并蒸发，得到标题化合物(0.736g,82％产率)，为异构体的混合物：1H NMR(500MHz,CDCl3)ppm 1.09(td,1H),1.27-1.49(m,3H),1.62-1.74(m,2H),1.93-2.01(m,2H),2.37(s,3H),3.04-3.18(m,3H),3.34(s,3H),6.90(d,1H),7.20(d,1H),7.38(dd,1H)；MS(MM-ES+APCI)+m/z 376[M+H]+。
分离6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺的异构体
使用制备型色谱(装备有Prep C8 10μm OBDTM19x 250mm柱和保护柱；Prep MS C8 10μm 19x 10mm Cartridge的WatersFractionLynx系统。以流速20ml/min施加35-70％MeOH/0.2％NH3的MilliQ水溶液的线性梯度)纯化6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(中间体8,80mg,0.21mmol)，得到：
异构体混合物1：(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(第一个洗脱出来，次要的异构体，2.0mg,2.5％产率)：
1H NMR(500MHz,CD3CN)δppm 1.15-1.25(m,2H),1.36(td,1H),1.45-1.59(m,2H),1.63-1.74(m,3H),2.19(s,3H),2.98-3.06(dd,2H),3.20(s,3H),3.32(t,1H),5.19-5.39(m,2H),6.75(d,1H),7.20(d,1H),7.34(dd,1H)；MS(ES+)m/z 378[M+H]+.
和异构体混合物2：(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(第二个洗脱出来，主要的异构体，未确定产率)：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 1.09(td,3.47Hz,1H),1.27-1.49(m,3H),1.62-1.74(m,2H),1.93-2.01(m,2H),2.37(s,3H),3.04-3.18(m,3H),3.34(s,3H),6.90(d,1H),7.20(d1H),7.38(dd,1.73Hz,1H),MS(MM-ES+APCI)+m/z 378[M+H]+。
分离(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺的异构体
使用SFC Berger Multigram II(LuxC4；4.6*250mm；5μm柱,由15％MeOH(含0.1％DEA)和85％CO2组成的流动相，流速为50mL/min)，分离中间体8中异构体混合物2的异构体，得到：
异构体1：(1r,1'R,4R)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(9mg,11％产率)，保留时间为6.1min：
1H NMR(500MHz,CD3CN)δppm 1.05(dd,1H),1.23(dt,2H),1.39(d,1H),1.49(ddd,2H),1.81-1.89(m,2H),2.17(s,3H),2.94-3.10(m,3H),3.23(s,3H),5.32(br.s.,2H),6.75(d,1H),7.19(d,1H),7.33(dd,1H),MS(MM-ES+APCI)+m/z 378[M+H]+；
和异构体2：(1r,1'S,4S)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(15mg,19％产率)，保留时间为9.5min：
1H NMR(500MHz,CD3CN)δppm 1.00-1.09(m,1H),1.17-1.31(m,2H),1.39(td,1H),1.50(ddd,2H),1.86(dt,2H),2.18(s,3H),2.94-3.10(m,3H),3.24(s,3H),5.32(br.s.,2H),6.76(d,1H),7.20(d,1H),7.34(dd,1H),MS(MM-ES+APCI)+m/z 378[M+H]+。
分离(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺的异构体
使用下列条件，通过制备型色谱纯化1.7g含(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(中间体8,异构体混合物2,主要的)和(1s,4s)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(中间体8,异构体混合物1,次要的)的混合物：柱：XBridge C18；50*300mm；10μm,流动相：20-60％MeCN在0.1％NH3水溶液中的溶液，历时20min,流速：120mL/min。然后使用下列系统通过制备型SFC将所得到的保留时间为15min的次要异构体(相当于上述异构体混合物1)分离成其异构体：Berger Multigram II SFC系统，柱：Chiralcel OD-H；20*250mm；5μm,流动相：10％MeOH(含0.1％DEA)/90％CO2,流速：50mL/min，得到：
具有未确定的绝对构型的异构体3(77mg,5％产率)，保留时间为6.5min：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.05-1.17(m,2H),1.24(td,1H),1.36-1.54(m,2H),1.57-1.74(m,3H),2.16(s,3H),2.85-3.07(m,2H),3.12(s,3H),3.29(br.s.,1H),6.58(s,2H),6.63(d,1H),7.24(d,1H),7.33(dd,1H)；MS(APCI+)m/z 376[M+H]+，
和具有未确定的绝对构型的异构体4(64mg,4％产率)，保留时间为12min：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.05-1.17(m,2H),1.24(td,1H),1.36-1.55(m,2H),1.57-1.74(m,3H),2.16(s,3H),2.85-3.06(m,2H),3.12(s,3H),3.29(br.s.,1H),6.58(s,2H),6.63(d,1H),7.24(d,1H),7.33(dd,1H)；MS(APCI+)m/z 376[M+H]+。
方法B
中间体8，异构体混合物2
(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
将(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮(中间体7,异构体1,22.7g,57.7mmol)和氨(7M的MeOH溶液,180mL,1.26mol)置于压力反应器中并加热至74℃过夜。使残余物达到室温并将混合物浓缩。将残余物在2M柠檬酸(400mL)和EtOAc(400mL)之间分配。滤出不可溶的物质并确定其为未反应的起始物质。在真空中浓缩有机相(有机相1)，得到另外的未反应的起始物质。向水相中加入EtOAc(300mL)，然后加入50％NaOH直至pH约12，将混合物搅拌10min。保存所得有机相(有机相2)。合并来自有机相1的残余物和滤出的固体，将其混悬在氨(7M的MeOH溶液,180mL,1.26mmol)，置于压力反应器中并加热至100℃，保持过夜。真空浓缩所得溶液。将残余物在2M柠檬酸(300mL)和EtOAc(300mL)之间分配。向水相中加入EtOAc(300mL)，然后加入50％NaOH直至pH约12，将混合物搅拌10min。将有机相与来自上述的有机相2合并。向有机相中加入活性炭，将混合物搅拌30min后经由硅藻土过滤。将有机相浓缩并在真空中干燥，得到固体。向固体中加入二异丙基醚(125mL)并将混合物回流过夜。使混合物达到室温，滤出固体，得到标题化合物(相当于上述中间体8,异构体混合物2)(15g,69％产率)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 0.93(m,1H)1.1-1.25(m,2H)1.35-1.45(m,3H)1.81(br.d,2H)2.16(s,3H)2.87-3.03(m,3H)3.18(s,3H)6.59(br.s.,2H),6.64(d,1H),7.25(d,1H),7.34(dd,1H)；ES+)m/z 376[M+H]+。
中间体8，异构体1
(1r,1'R,4R)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1',2″-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
向1L圆底烧瓶中加入(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(中间体8,异构体混合物2,方法B,61g,162mmol)、EtOH(99.5％,600mL)和水(60mL)，得到均质混合物，将其加热至70℃。将混合物在升高温度搅拌30min，接着加入D(+)-10-樟脑磺酸(18.8g,81.0mmol)。将混合物在70℃搅拌3h，然后历时2h使其达到20℃，接着在20℃搅拌12h。过滤混合物，得到固体，将其用冷的EtOH洗涤，然后在真空干燥箱中在50℃干燥10h，得到标题化合物，为D(+)-10-樟脑磺酸盐(37g；37％产率)。由10％MeOH(含0.1％DEA)和90％CO2组成的流动相，以3mL/min的流速，通过在装备有Chiralpak AD-H柱(4.6*250mm；5μm)的SFCBerger Analytix系统上的分析，确定对映体比率。保留时间为3.68min(面积2.5％)的第一个峰对应于(1r,1'S,4S)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺，相当于异构体2。保留时间为4.58min(面积97.5％)的第二个峰对应于标题化合物(1r,1'R,4R)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1',2″-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺，相当于异构体1。
在室温，历时30min，通过将混悬在二氯甲烷(4mL)中的樟脑磺酸盐(0.32g,0.53mmol)与KOH(0.32g,5.7mmol)的水溶液(4mL)搅拌，实施标题化合物从所述盐中的释放。分出有机相并在真空中浓缩，定量地得到95％对映体过量的标题化合物(如上文所确定)。
方法C
中间体8，异构体1(+)-樟脑磺酸盐
(1r,1'R,4R)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1',2″-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(+)-樟脑磺酸盐
将(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮(中间体7,异构体1,12.8g,32.6mmol)、氨(7M的MeOH溶液,93.3mL,653mmol)和二水合乙酸锌(8.60g,39.2mmol)加入到压力反应器中并加热至80℃，保持24h。将反应混合物冷却下来，溶剂换成1-丁醇，终体积为130mL(1-BuOH(130mL)，然后将混合物蒸馏至130mL，在该阶段下继续蒸馏，同时加入另外的1-BuOH(65mL)以保持体积)。用1M氢氧化钠水溶液(85mL)和水(51mL)洗涤有机溶液。将所得溶液加热至70℃并加入D(+)-10-樟脑磺酸(6.82g,29.4mmol)。冷却混合物，经由过滤收集所得固体，用乙醇(51mL)洗涤并在真空干燥箱中在40℃干燥，得到标题化合物，为白色固体(7.09g,41％产率)，对映体纯度为99％(色谱：ChiralPak IA-30.46cm x 5cm,柱温度20℃，由95:5异己烷：乙醇(0.1％v/v三乙胺)组成的流动相，流速为0.9mL/min，中间体8,异构体1：保留时间为2.66min,中间体8,异构体2保留时间为2.39min)。
中间体9
[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]亚氨基二碳酸二叔丁酯
向(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(中间体8,异构体混合物2,7.00g,18.6mmol)在DCM(100mL)的溶液中加入一缩二碳酸二叔丁酯(8.53g,39.1mmol)、Et3N(5.44mL,39.1mmol)和DMAP(0.227g,1.86mmol)。将所得混合物在室温搅拌20h。将反应混合物用DCM稀释，用2M HCl水溶液、水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，以MgSO4干燥并浓缩。使用0-5％甲醇/DCM的梯度洗脱，通过硅胶色谱进行纯化，得到标题化合物(4.41g,41％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 1.1-1.3(m,4H),1.4(s,18H),1.5-1.6(m,2H),1.8-1.9(m,2H),2.2(s,3H),2.9-3.0(m,1H),3.1(s,2H),3.2(s,3H),6.7(d,1H),7.4(d,1H),7.5(dd,1H).MS(ES+)m/z 576[M+H]+.
中间体10
[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]氨基甲酸叔丁酯
在40℃，将[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]亚氨基二碳酸二叔丁酯和[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]亚氨基碳酸叔丁酯(中间体12,未进行色谱纯化的混合物使用,4.09g,7.78mmol)的混合物用2M Na2CO3水溶液(7.1mL,14mmol)处理8h。在减压下蒸发大部分甲醇并用EtOAc萃取残余物。将合并的萃取物用盐水洗涤，以MgSO4干燥并浓缩。使用0-10％MeOH/DCM和庚烷的混合物(15:85)的梯度洗脱，通过硅胶色谱进行纯化，得到产物(2.90g,86％产率)，其展示出与标题化合物的两种异构体的1:1混合物一致的1HNMR。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.44(与多重峰部分重叠的s,9H),1.47(与多重峰部分重叠的s,9H),2.18(s,3H),2.28(s,3H),3.18(与多重峰部分重叠的s,4H),3.20(与多重峰部分重叠的s,3H),6.66(d,1H),7.03(m,1H),7.31(m,2H),7.41(dd,1H),7.48(dd,1H),9.85(s,1H),10.52(s,1H)；MS(ES+)m/z 476[M+H]+。
中间体11
6-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮
向6-羟基-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(3.6g,24.3mmol)在THF(60mL)中的溶液中加入(3,3-二氟环丁基)甲醇(2.97g,24.3mmol)和三苯基膦(9.56g,36.45mmol)。逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(7.18mL,36.5mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。使用0-100％EtOAc/庚烷的梯度，通过快速柱色谱纯化所述物质，得到3.67g(60％产率)标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 2.30(br.s.,1H)2.42-2.52(m,6H)2.54-2.62(m,1H)2.63-2.66(m,2H)2.67-2.76(m,2H)2.98-3.04(m,2H)4.08(d,2H)7.10(d,1H)7.26(dd,1H)7.48(d,1H)；MS(ES+)m/z 253[M+H]+。
中间体12
6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮
将6-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(中间体11,7.0g,27.8mmol)和丙烯酸甲酯(5.51mL,61.1mmol)在2-Me THF(6mL)中的混合物冷却至0℃，并且分份加入叔丁醇钾(3.74g,33.3mmol)。在室温搅拌2h后，加入水(9mL)和氢氧化钾(1.56g,27.8mmol)并将混合物回流加热过夜。将混合物冷却至室温，加入水和盐水。分离各相，用EtOAc萃取水层。以MgSO4干燥合并的有机层，并将其浓缩，得到标题化合物(3.51g,37％产率)。1H NMR(500MHz,CDCl3)ppm 1.80-1.91(m,2H)2.17-2.26(m,2H)2.39-2.57(m,4H)2.58-2.82(m,5H)3.16(s,2H)4.05(d,2H)7.20(d,1H)7.25(dd,1H)7.40(d,1H)；MS(ES+)m/z 335[M+H]+。
中间体13
6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
将6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(中间体12,3.51g,10.5mmol)溶于THF(50mL)和甲醇(4.25mL,105mmol)的混合物中。加入甲硼烷-三甲胺络合物(1.69g,23.1mmol)并将混合物搅拌过夜。加入一份一水合柠檬酸(30.9g,147mmol)，接着逐滴加入水(3.78mL,210mmol)。搅拌混合物3h，此后用水稀释并用EtOAc(x2)萃取。将合并的有机相干燥并浓缩。使用柱色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化产物，得到2.98g(定量产率)标题化合物。MS(ES+)m/z 337[M+H]+。
中间体14
6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
在氮气气氛下，将6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体13,2.98g,8.85mmol)溶于THF(35mL)中，并将溶液冷却至0℃。逐份加入叔丁醇钾(2.98g,26.6mmol)并将混合物在下0℃搅拌15min。加入碘甲烷(1.11mL,17.7mmol)。移开冷却浴，将混合物在室温搅拌过夜。加入水(200mL)，将所得溶液在另外的水(200mL)和EtOAc(400mL)之间分配。将有机相干燥(MgSO4)并浓缩，使用柱色谱(0-50％EtOAc/庚烷)分离产物，得到1.85g(59％产率)标题化合物。MS(ES+)m/z 351[M+H]+。
中间体15
6'-(环丁基甲氧基)螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮
使用针对中间体11所述的操作，由6-羟基-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(3.0g,20.3mmol)和环丁基甲醇(2.10mL,22.3mmol)起始，制备标题化合物(2.56g,58％产率)。将混合物加热至45℃并搅拌过周末。1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 1.81-2.03(m,4H),2.11-2.20(m,2H),2.69-2.74(m,2H),2.78(dt,1H),3.04-3.12(m,2H),3.96(d,2H),7.17-7.22(m,2H),7.36(d,1H)；MS(ES+)m/z 217[M+H]+。
中间体16
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
使用针对中间体13所述的操作，由6'-(环丁基甲氧基)螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(中间体15,2.35g,7.88mmol)起始，制备标题化合物。在硅胶柱(0-50％EtOAc/正庚烷梯度洗脱)上纯化产物，得到标题化合物(1.84g,78％产率,含29％(1s,4s)-6'-(环丁基甲氧基)-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮)。所述化合物用于下一步骤中：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.10(m,次要异构体),1.2-1.4(m,4H),1.57(m,2H),1.71(m,次要异构体),1.75-1.95(m,6H),2.07(m,2H),2.71(m,1H),2.92(m,2H),3.44(m,1H),3.84(m,次要异构体),3.98(d,2H),4.42(d,次要异构体),4.66(d,1H),7.07(d,1H),7.26(m,1H),7.44(m,1H)；MS(ES+)m/z 301.1[M+H]+。
中间体17
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
在惰性气氛下，将(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-羟基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体16,含29％的另一种异构体,1.84g,6.13mmol)溶于2-Me THF(17mL)中并将溶液冷却至0℃。加入碘甲烷(0.498mL,7.96mmol)，接着逐份加入叔丁醇钾(0.962g,8.58mmol)。将所得混合物在35℃搅拌1h。加入叔丁醇钾(0.962g,8.58mmol)并继续搅拌。又过30min后，加入一份新的叔丁醇钾(0.103g,0.92mmol)并继续搅拌。总共4h后，获得完全转化。加入水(6mL)和盐水(3mL)。分离各相，干燥并浓缩有机层。在硅胶柱(0-50％EtOAc/正庚烷梯度洗脱)上纯化产物，得到标题化合物(1.48g,77％产率)。产物含29％(1s,4s)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮，将其用于下一步骤中：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm1.11(m,次要异构体),1.26(m,2H),1.40(d,1H),1.57(m,2H),1.75-1.95(m,5H),2.0-2.1(m,3H),2.71(m,1H),2.95(s,3H),2.95(s,次要异构体),3.19(m,1H),3.24(s,次要异构体),3.26(s,3H),3.45(m,次要异构体),3.99(d,2H),7.07(d,1H),7.26(m,1H),7.45(m,1H)；MS(ES+)m/z 315.1[M+H]+。
中间体18
N-(5'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺
将6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体14,1.85g,5.28mmol)和2-甲基丙-2-亚磺酰胺(1.15g,9.50mmol)溶于2-Me THF(40mL)中。加入四乙氧基钛(2.21mL,10.6mmol)并将所得混合物加热至80℃，保持过周末。将反应混合物冷却至室温并用乙酸乙酯(85mL)稀释。在剧烈搅拌下加入水(3mL)，然后将混合物放置1h。过滤混合物，蒸发溶剂，使用0-70％乙酸乙酯/庚烷的梯度，通过硅胶柱色谱纯化残余物。将产物从EtOH中重结晶两次，得到0.750g标题化合物(31％产率)。MS(ES+)m/z 454[M+H]+。
中间体19
6'-[(3,3-二氟环丁基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮
向N-(5'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺(中间体18,750mg,1.65mmol)在无水1,4-二噁烷(25mL)中的溶液中加入HCl(4M的1,4-二噁烷溶液,4.13mL,16.5mmol)。立即有白色析出物形成，在氮气气氛下，将所得浑浊的混合物在室温搅拌过夜。将混合物用NaHCO3(水溶液)稀释并用DCM萃取。干燥并浓缩有机相，得到6'-((3,3-二氟环丁基)甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺(672mg,1.92mmol)。将亚胺、原甲酸三甲酯(0.557mL,5.08mmol)和2-丙醇(5mL)置于微波管中并将混合物在油浴中在60℃加热。加入2-氧代丙烷硫代酰胺(中间体1,397mg,3.85mmol)在MeOH(15mL)中的溶液并将所得混合物搅拌过夜。真空浓缩混合物。使用柱色谱(0-50％EtOAc/庚烷)分离产物，得到106mg(12％产率)标题化合物。MS(ES+)m/z 435[M+H]+。
中间体20
N-((1r,4r)-5'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺
将(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(中间体17,1.48g,4.71mmol)和2-甲基丙-2-亚磺酰胺(1.027g,8.47mmol)溶于2-Me THF(17mL)中。加入乙醇钛(IV)(1.97mL,9.41mmol)。将所得混合物加热回流过夜。加入2-甲基丙-2-亚磺酰胺(0.560g,4.62mmol)并将反应混合物回流6h。再加入2-甲基丙-2-亚磺酰胺(0.560g,4.62mmol)和乙醇钛(IV)(1mL,4.79mmol)并将混合物回流过夜。再加入2-甲基丙-2-亚磺酰胺(0.560g,4.62mmol)和乙醇钛(IV)(1mL,4.79mmol)并将混合物回流过夜(80％转化)。在搅拌期间加入EtOAc(10mL)及饱和NaHCO3水溶液(2mL)。将混合物静置1h。通过经硅藻土的过滤收集有机相，将其以MgSO4干燥并浓缩。在硅胶柱(0-100％EtOAc/庚烷梯度洗脱)上纯化产物，得到标题化合物(1.12g,57％产率)，其含30％(1s,4s)-异构体。将其用于下一步骤中：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.26(m,11H),1.50(m,3H),1.87(m,5H),2.06(m,4H),2.73(m,1H),2.96(m,2H),3.17(m,1H),3.26(s,3H),3.95(d,2H),7.22(m,1H),7.40(m,1H),7.83(m,1H)；MS(ES+)m/z 418.2[M+H]+。
中间体21
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺
向N-((1r,4r)-5'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-3'(1'H)-亚基)-2-甲基丙-2-亚磺酰胺(中间体20,1.12g,2.68mmol)在无水1,4-二噁烷(8mL)中的溶液中加入HCl(4M的1,4-二噁烷溶液)(6.70mL,26.8mmol)。将反应混合物在氮气气氛下在室温搅拌90min。向反应混合物中加入DCM(20mL)及饱和NaHCO3水溶液(15mL)。分离各相，浓缩有机相，得到标题化合物(0.840g,定量的产率)，将其直接用于下一步骤中：MS(ES+)m/z 314.15[M+H]+。
中间体22
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮
将(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺(中间体21,0.84g,2.68mmol)和2-氧代丙烷硫代酰胺(中间体1,0.829g,8.04mmol)溶于无水MeOH(12mL)中，并将所得橙色溶液在60℃在N2(g)下加热过夜。向反应混合物中再加入2-氧代丙烷硫代酰胺(0.829g,8.04mmol)，并将其加热至60℃6h。浓缩反应混合物并将溶剂换成2-丙醇(12mL)。加入原甲酸三甲酯(0.880mL,8.04mmol)。将反应混合物加热至80℃约2天(20％转化)。浓缩混合物。将残余物溶于EtOAc，然后用水洗涤。浓缩有机相，在硅胶柱(0-100％EtOAc/正庚烷)上纯化残余物，得到标题化合物(0.140g,13％产率)。产物含15％(1s,4s)-异构体，将其用于下一步骤中：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.09(m,1H)1.24(m,3H)1.49(m,2H)1.85(m,6H)2.03(m,2H)2.26(s,3H)2.64(dt,1H)2.97(m,3H)3.20(s,3H)3.85(m,2H)6.30(d,1H)6.87(dd,1H)7.23(d,1H)12.29(s,1H)；MS(ES+)m/z 399.1[M+H]+。
实施例：
实施例1
(1r,4r)-4-甲氧基-5″-甲基-6'-[(1-甲基环丙基)甲氧基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
将[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体10,315mg,0.66mmol)、烯丙基氯化钯(II)(5mg,0.01mmol)、二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3-甲氧基-6-甲基联苯-2-基)膦(19mg,0.04mmol)和Cs2CO3(323mg,0.99mmol)称入到管中。将管盖上帽。加入甲苯(5mL)，将顶部空间排空并用氩气回填。加入(1-甲基环丙基)甲醇(114mg,1.32mmol)并将混合物加热至90℃16h。过滤冷却的反应混合物。加入7M甲醇氨(3mL,21mmol)并将所得混合物加热至80℃65h。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物，得到93mg标题产物(37％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 0.30-0.35(m,2H),0.44-0.49(m,2H),0.90(m,1H),1.08-1.26(m,5H),1.33-1.48(m,3H),1.80(m,2H),2.14(s,3H),2.81-2.88(m,1H),2.88-2.98(m,2H),3.18(s,3H),3.54-3.63(m,2H),6.04(d,1H),6.50(s,2H),6.69(dd,1H),7.14(d,1H)；MS(ES+)m/z 382[M+H]+。
实施例2
(1r,4r)-6'-[(3,3-二氟环丁基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
将6'-[(3,3-二氟环丁基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮(中间体19,106mg,0.24mmol)置于微波管中。加入氨(7M的MeOH溶液)(2mL,14mmol)，并将混合物在微波反应器中在90℃加热30min。浓缩反应混合物，加入氨(7M的MeOH溶液)(2mL,14mmol)。通过微波将反应混合物在120℃加热30min。将此循环重复5次。浓缩所得混合物，通过反相制备型色谱分离标题化合物(7mg,7％产率)。1HNMR(500MHz,CDCl3)ppm 1.07-1.17(m,1H)1.27-1.44(m,3H)1.63-1.76(m,2H)1.95-2.08(m,2H)2.43-2.46(m,3H)2.46-2.50(m,1H)2.53-2.61(m,1H)2.65(s,2H)2.67-2.73(m,2H)3.04-3.12(m,2H)3.13-3.20(m,1H)3.34(s,3H)3.92(t,2H)6.37(d,1H)6.86(dd,1H)7.25(d,1H)8.33(s,2H)；MS(ES+)m/z 418[M+H]+。
实施例3
(1r,4r)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
将[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]亚氨基二碳酸二叔丁酯(中间体9,522mg,0.91mmol)、二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3-甲氧基-6-甲基联苯-2-基)膦(26mg,0.05mmol)、烯丙基氯化钯二聚体(7mg,0.02mmol)和Cs2CO3(443mg,1.36mmol)称入到管中。将顶部空间排空并用氩气回填。加入甲苯(3mL)和环丙基甲醇(0.143mL,1.81mmol)，将混合物加热至90℃，保持2h 40min。过滤反应混合物并加入7M甲醇氨(3.9mL,27mmol)。将所得溶液加热至85℃，保持15h。浓缩混合物，并使用0-5％0.2M甲醇氨/DCM的梯度，通过快速柱色谱进行纯化，接着通过制备型色谱进行纯化，得到标题产物(202mg,61％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 0.2-0.3(m,2H),0.5-0.5(m,2H),0.9(td,1H),1.1-1.3(m,3H),1.3-1.5(m,3H),1.7-1.9(m,2H),2.1(s,3H),2.8-2.9(m,1H),2.9-3.0(m,2H),3.2(s,3H),3.6(d,2H),6.0(d,1H),6.5(br.s.,2H),6.7(dd,1H),7.1(d,1H).MS(ES+)m/z 368[M+H]+。
实施例4
分离(1r,4r)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺的异构体
使用SFC Berger Multigram II系统(Chiralcel OD-H；20*250mm；5μm柱,由30％MeOH(含0.1％DEA)和75％CO2组成的流动相，流速为50mL/min)，对分成3份的(1r,4r)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(实施例3,147mg,0.40mmol)进行纯化，得到：
异构体1(1r,1'R,4R)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺，保留时间为1.58min(66mg,45％产率)：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 0.23-0.29(m,2H),0.47-0.54(m,2H),0.90(td,1H),1.07-1.26(m,3H),1.34-1.47(m,3H),1.80(d,2H),2.14(s,3H),2.81-2.88(m,1H),2.89-2.98(m,2H),3.18(s,3H),3.64(d,2H),6.03(d,1H),6.50(s,2H),6.70(dd,1H),7.14(d,1H).MS(ES+)m/z 368[M+H]+。
和异构体2(1r,1'S,4S)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺，保留时间为2.24min(65mg,44％产率)：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 0.26(m,2H),0.51(m,2H),0.90(td,1H),1.07-1.26(m,3H),1.34-1.48(m,3H),1.80(m,2H),2.14(s,3H),2.80-2.88(m,1H),2.88-2.98(m,2H),3.18(s,3H),3.64(d,2H),6.04(d,1H),6.50(s,2H),6.70(dd,1H),7.14(d,1H).MS(ES+)m/z 368[M+H]+。
实施例5
(1r,4r)-6'-[(2,2-二氟环丙基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
使用针对实施例3所述的操作，由[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]亚氨基二碳酸二叔丁酯(中间体9,200mg,0.35mmol)和(2,2-二氟环丙基)甲醇(75mg,0.69mmol)起始，制备标题化合物。先后通过硅胶柱色谱(0-100％(7M NH3的MeOH溶液/DCM 1:9)在DCM中的洗脱剂)和制备型HPLC对产物进行纯化，得到标题化合物(29mg,21％产率).1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 0.90(br.s.,1H),1.18(m,2H),1.42(m,4H),1.66(m,1H),1.80(d,2H),1.80(m,0H),2.11(m,1H),2.13(s,3H),2.85(d,1H),2.93(m,2H),3.18(s,3H),3.79(d,1H),4.00(m,1H),6.07(d,1H),6.50(br.s.,2H),6.74(dd,1H),7.16(d,1H)；MS(ES+)m/z 404.09[M+H]+。
实施例6
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
使用针对实施例2所述的操作，由(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″(3″H)-硫酮(中间体22,140mg,0.35mmol)起始，制备标题化合物。先后通过硅胶柱色谱(0-100％(7M NH3的MeOH溶液/DCM 1:9)在DCM中的梯度洗脱)和制备型色谱对产物进行纯化，得到标题化合物(44mg,28％产率)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm0.90(t,1H)1.17(m,2H)1.41(m,3H)1.82(m,9H)2.01(m,2H)2.14(s,3H)2.62(m,1H)2.90(m,3H)3.18(s,3H)3.78(m,2H)6.05(s,1H)6.46(br.s,2H)6.70(d,1H)7.14(d,1H)；MS(APCI+)m/z 382.2[M+H]+。
实施例7
分离(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺的异构体
使用SFC Berger Multigram II系统(OD-H；20*250mm；5μm柱,由30％MeOH(含0.1％DEA)和70％CO2组成的流动相，流速为50mL/min)，分离(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(实施例6,35mg)的异构体，得到：
异构体1：(1r,1'R,4R)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(12mg,34％产率)，保留时间为2.1min：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 0.90(d,1H),1.14(d,2H),1.41(m,3H),1.82(m,6H),2.01(m,2H),2.15(s,3H),2.62(m,1H),2.90(m,3H),3.18(s,3H),3.78(dd,2H),6.05(d,1H),6.50(br.s.,2H),6.70(dd,1H),7.14(d,1H),MS(APCI+)m/z 382[M+H]+。
和异构体2：(1r,1'S,4S)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺(12mg,34％产率)，保留时间为5.0min：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)ppm 0.90(m,1H),1.18(m,2H),1.43(m,3H),1.82(m,6H),2.01(m,2H),2.15(s,3H),2.62(m,1H),2.89(m,3H),3.18(s,3H),3.78(dd,2H),6.05(d,1H),6.50(s,2H),6.70(dd,1H),7.14(d,1H),MS(APCI+)m/z 382[M+H]+。
实施例8
(1r,4r)-6'-(2-环丙基乙氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺
将[(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-基]亚氨基二碳酸二叔丁酯(中间体9,210mg,0.36mmol)、二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3-甲氧基-6-甲基联苯-2-基)膦(10mg,0.02mmol)、烯丙基氯化钯二聚体(2.7mg,7.3μmol)、碳酸铯(178mg,0.55mmol)和2-环丙基乙醇(63mg,0.73mmol)的混合物上的顶部空间排空并用氩气回填。加入甲苯(1.3mL)并将混合物在90℃加热3天。在室温又两天后，经由注射器式滤器过滤反应混合物。用7M氨在甲醇中的溶液(1.56mL,10.9mmol)洗涤滤器。再加入7M氨在甲醇中的溶液(1.56mL,10.9mmol)并将所得溶液在85℃加热24h。冷却至室温后，浓缩混合物。将残余物在EtOAc和2M柠檬酸水溶液之间分配。分离各相，用2M柠檬酸水溶液萃取有机层两次。弃去有机层。将柠檬酸水相用NaOH(50％水溶液)碱化并用EtOAc萃取两次。用活性炭处理有机相，将其干燥(Na2SO4)，经硅藻土过滤并浓缩，使用CHCl3/MeOH的梯度(20:1-15:1-10:1)，通过快速硅胶色谱进行纯化，得到标题化合物(56mg,40％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 0.02-0.12(m,2H),0.34-0.45(m,2H),0.72-0.84(m,1H),0.90(td,1H),1.07-1.27(m,2H),1.35-1.48(m,3H),1.53(q,2H),1.80(d,2H),2.15(s,3H),2.81-2.88(m,1H),2.88-2.98(m,2H),3.18(s,3H),3.80-3.91(m,2H),6.06(d,1H),6.50(s,2H),6.71(dd,1H),7.15(d,1H)；MS(ES+)m/z 382.1[M+H]+。
生物学测定
化合物的活性水平使用以下方法来测试：
TR-FRET测定
用于TR-FRET的β-分泌酶如下制备：
人β-分泌酶的可溶性部分(AA 1-AA 460)的cDNA使用ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK哺乳动物表达载体来克隆。将基因与IgG1(亲和标签)的Fc结构域融合并稳定地克隆到HEK 293细胞中。经纯化的sBACE-Fc在-80℃贮存在50mM甘氨酸(pH 2.5)中，用1M Tris调节至pH 7.4且具有40％的纯度。
在反应缓冲液(乙酸钠,chaps,triton x-100,EDTA pH 4.5)中将酶(截短形式)稀释至6μg/mL(储备液1.3mg/mL)并将TruPoint BACE1底物稀释至200nM(储备液120μM)。将酶和化合物在二甲基亚砜(DMSO的终浓度为5％)中的溶液混合并在室温预孵育10分钟。然后加入底物并将反应混合物在室温孵育15分钟。反应通过加入0.35体积终止液(乙酸钠,pH 9)来停止。用Victor II读板器以340-485nm的激发波长和590-615nm的发射波长测量产物的荧光。酶的终浓度为2.7μg/ml；底物的终浓度为100nM(Km为约250nM)。二甲基亚砜对照品(而不是测试化合物)定义了100％活性水平且0％活性通过缺乏酶(替换为反应缓冲液)的孔或通过已知抑制剂即2-氨基-6-[3-(3-甲氧基苯基)苯基]-3,6-二甲基-5H-嘧啶-4-酮的饱和剂量来定义。在剂量响应测定中还使用了对照抑制剂且其IC50为约150nM。
稀释的TR-FRET测定
在稀释的TR-FRET测定中进一步测试了具有高亲和力的化合物，其中条件如以上就TR-FRET测定所述，但使用1/50酶量和在室温在暗处6.5小时长反应时间。
sAPPβ释放测定
在具有Glutamax、10％FCS和1％非必需氨基酸的DMEM/F-12中培养SH-SY5Y细胞，冷藏并以7.5-9.5×106个细胞/小瓶的浓度贮存在-140℃。解冻细胞并以约10000个细胞/孔的浓度在具有Glutamax、10％FCS和1％非必需氨基酸的DMEM/F-12中以100μL细胞悬浮液/孔接种在384孔组织培养板中。然后在37℃和5％CO2的条件下将细胞板孵育7-24小时。除去细胞培养基，然后加入30μL稀释在具有Glutamax、10％FCS、1％非必需氨基酸和1％PeSt的DMEM/F-12中的化合物(DMSO的终浓度为1％)。在37℃和5％CO2的条件下将化合物与细胞一起孵育17小时(过夜)。Meso ScaleDiscovery(MSD)板用于检测sAPPβ释放。将MSD sAPPβ板在1％BSA/Tris洗涤缓冲液(40μL/孔)中在室温和振荡下阻断1小时并在Tris洗涤缓冲液(40μL/孔)中洗涤1次。将20μL培养基转移到预先阻断并洗涤的MSD sAPPβ微量板中且细胞板在ATP测定中进一步用于测量细胞毒性。在室温和振荡下将MSD板孵育2小时并弃去培养基。每孔加入10μL检测抗体(1nM)，然后在室温和振荡下孵育2小时，然后弃去。每孔加入40μL读取缓冲液并在SECTOR成像仪中对板进行读取。
ATP测定
如在sAPPβ释放测定中所述，从细胞版中转移20μL培养基用于sAPPβ检测后，板用于分析细胞毒性，其中使用对总细胞ATP进行测量的ViaLightTM Plus细胞增殖/细胞毒性试剂盒(Cambrex BioScience)。测定按照厂商方案来进行。简言之，每孔加入10μL细胞溶解试剂。将板在室温孵育10min。加入25μL复溶的ViaLightTM Plus ATP试剂后2min，测量发光。毒性阈值为在对照品的75％以下的信号。
结果
本发明化合物的典型IC50值在约0.1至约100,000nM的范围内。具体实施例化合物的生物学数据在下表1中给出。
表1.
a来自稀释的FRET测定的IC50。

Claims (11)

1.式I化合物
其中
A为-O-或-CH2-；
n为0或1；
R1为C1-6烷基或C1-6卤代烷基；
R2为C1-6烷基或C1-6卤代烷基；其中所述C1-6烷基或C1-6卤代烷基取代有一个至三个独立地选自以下的基团：C3-6环烷基或C3-6卤代环烷基；
R5和R6独立地为氢、杂环基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基或C1-6烷基，其中所述杂环基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基或C1-6烷基任选地取代有一个或两个独立地选自以下的取代基：卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基或OR9；
或者R5和R6与它们所连接的碳一起形成环B，其为3-14元环烷基或杂环基单环，或9-14元二环环烷基或杂环基环；并且其中环B任选地被一个或两个独立地选自以下的取代基所取代：氧代、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基或OR7；
R7独立地为氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基或C0-6烷基C3-6环烷基；
R8为氢、卤素或甲基，
所述化合物为游离碱形式或其药用盐。
2.权利要求1的化合物或其药用盐，所述化合物选自：
(1r,4r)-4-甲氧基-5″-甲基-6'-[(1-甲基环丙基)甲氧基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-[(3,3-二氟环丁基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'R,4R)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'S,4S)-6'-(环丙基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-[(2,2-二氟环丙基)甲氧基]-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,4r)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'R,4R)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；
(1r,1'S,4S)-6'-(环丁基甲氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺；和
(1r,4r)-6'-(2-环丙基乙氧基)-4-甲氧基-5″-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2″-咪唑]-4″-胺。
3.一种药物组合物，其包含作为活性成分的治疗有效量的权利要求1或2的化合物或其药用盐及至少一种药用赋形剂、载体或稀释剂。
4.权利要求1或2的化合物或其药用盐，其用作药物。
5.权利要求1或2的化合物或其药用盐，其用于治疗或预防Aβ相关病理。
6.权利要求1或2的化合物或其药用盐，其用于治疗或预防Aβ相关病理，其中所述Aβ相关病理为唐氏综合征、β-淀粉样蛋白血管病、脑淀粉样蛋白血管病、遗传性脑出血、与认知缺损相关的病症、MCI(“轻度认知缺损”)、阿尔茨海默病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意力缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合型血管源性痴呆、变性源性痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森病相关的痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底变性。
7.权利要求1或2的化合物或其药用盐，其用于治疗或预防阿尔茨海默病。
8.在有此需要的患者中治疗或预防Aβ相关病理的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的权利要求1或2的化合物或其药用盐。
9.权利要求7的方法，其中所述Aβ相关病理为唐氏综合征、β-淀粉样蛋白血管病、脑淀粉样蛋白血管病、遗传性脑出血、与认知缺损相关的病症、MCI(“轻度认知缺损”)、阿尔茨海默病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意力缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合型血管源性痴呆、变性源性痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森病相关的痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底变性。
10.在有此需要的患者中治疗或预防阿尔茨海默病的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的权利要求1或2的化合物或其药用盐。
11.在有此需要的患者中治疗或预防Aβ相关病理的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的权利要求1或2的化合物或其药用盐及至少一种认知增强剂、记忆增强剂或胆碱酯酶抑制剂。
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