CN104492395B - 以pamam为间隔臂的仿生免疫吸附剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂,具有如下Gel‑PAMAM‑AA的化学结构:
Description
技术领域
本发明属于生物医疗器械,提供了一种血液净化用仿生免疫吸附剂的制备方法,特别是可用于血液灌流的免疫吸附剂及其制备方法。
背景技术
免疫吸附疗法是近二十年来发展起来的一种新技术,用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。目前临床上应用免疫吸附能通过特异性的清除自身抗体治疗多种自身免疫性疾病。如以蛋白A,G等为配基的蛋白类免疫吸附剂对免疫球蛋白(IgG)有很好的生物特异性亲和力,含有这类生物特异性配基的免疫吸附剂已证明能去除自身抗体并治疗各种自身免疫性疾病,因而在生物纯化及临床上得到了广泛应用。然而,蛋白类配基存在一些无法忽视的缺陷:蛋白质难以经受苛刻的灭菌过程并且较易从载体上脱落,这些脱落的配基会引起安全问题;蛋白类免疫吸附剂高昂的价格给患者造成了沉重的经济负担;蛋白质配基难以进行化学官能团的修饰,因而不能以最合适的角度偶联在载体上。为了解决这些问题,一批能选择性地结合IgG的仿蛋白质类的小分子配基得到了广泛的研究和发展。例如,氨基酸、多肽、染料、金属离子等这类具有高度物理化学稳定性和低廉价格的小分子,能作为蛋白质配基的替代品用于吸附IgG。在这些仿生配基中,氨基酸由于其无毒,价廉和对IgG的高选择性已代替蛋白质用于亲和色谱方面。有报道证明氨基酸能高效地从人血浆或血清中分离出IgG。
在常用的免疫吸附剂的制备方法中,配基通过氨基、羟基、羧基、醛基等反应基团偶联于载体上。但是,当配基上存在过多的化学官能团或者存在其它能参与偶联反应的基团时,载体与配基用于偶联反应的官能团间的选择性会减低,从而使配基的亲和力受到影响。因此,增加载体与配基在偶联反应时的选择性就显得尤为重要。如果一对官能团彼此间有很高的反应选择性并且它们对其它基团是惰性的,那么这样的官能团对就能大大提高免疫吸附剂的制备效率。而叠氮基和炔基正是这样的官能团对,二者的Huisgen 1,3-偶极环加成反应是点击化学反应里应用最广泛的。Cu(I)-催化的叠氮基和炔基的环加成反应具有高选择性,且对很多其它的化学官能团是惰性的,并在很广的反应条件下(溶剂、温度、pH等)都能保持稳定。这些特征使得点击化学在生物藕联方面显示出独特的优势,例如亲和色谱试剂的制备。专利CN201210152387.3中,通过分别制备了叠氮化的载体和炔化的配基,并且将二者通过点击反应偶联后制备了免疫吸附剂。其中,要制备叠氮化的载体,需将其先环氧化后再通过活化基团进行叠氮化,但该制备方法存在局限性,如叠氮化琼脂糖的叠氮基含量影响后续通过点击反应固载上的配基量,而叠氮基含量则直接受限于环氧基含量。通过专利(申请号:01103114.X)报道的环氧氯丙烷活化法所得到的活化载体,其环氧值约为60μmol/mL。而在尝试了多种环氧活化的优化方法后,发现活化载体的环氧值难以有明显的提高,配基固载量也难以进一步提高。因此,本发明采用了一种新的活化载体和吸附剂的制备方法,以提高载体的活性位点数,增加吸附剂的配基固载量,从而有效地提高吸附剂的吸附性能。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种安全、成本低廉,性能稳定可靠的以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂。本发明的第二目的在于提供以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂的制备方法。本发明的第三目的在于提供该类以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂在IgG分离中的应用。
本发明以琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇等含羟基的亲水凝胶球为载体,氨基酸为仿生配基,采用点击化学设计和制备一种以聚酰胺-胺树枝状高分子物质(PAMAM)为间隔臂的免疫吸附剂,对IgG具有高选择性,且成本低廉,性能稳定可靠,效果与蛋白A吸附材料相当。以树枝状聚合物为间隔臂可克服线形间隔臂的缺点并增大载体对配基的固载量。聚酰胺-胺树状高分子既具有树状大分子的共性,又有自身特色:PAMAM是以乙二胺为核心,通过Michael加成和酰胺化缩合反应来进行的,整个反应的产率非常高;在凝胶载体上连接PAMAM型树枝状大分子,充分利用其大量活性位点的优势进行配基的固定化,偶联这种树枝状间隔臂后的载体比偶联线形间隔臂的载体的外表面具有更多的活性位点,更易于配基的键合,大大提高配基固载效率,增加免疫吸附剂的吸附能力。琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇等载体具有良好的化学稳定性和机械强度,对蛋白质呈化学隋性,其亲水性和血液相容性也比较好,容易活化并在比较温和、简单的条件下可进行配基的固载反应。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂,具有如下Gel-PAMAM-AA的化学结构:
其中,Gel代表含羟基的亲水载体;AA代表氨基酸;n=0,1,2或3;PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状高分子,所述亲水载体为琼脂糖、纤维素或聚乙烯醇,所述氨基酸为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
本发明中载体为琼脂糖、纤维素或聚乙烯醇,载体与氨基酸配基的偶联方法为Huisgen 1,3-偶极环加成反应。先以3-叠氮基丙胺为核心,合成1.0~4.0代端基炔化的PAMAM(即G1.0PAMAM、G2.0PAMAM、G3.0PAMAM和G4.0PAMAM,n分别为0、1、2和3);再将端基炔化的PAMAM与氨基酸配基结合成活性化合物;最后将带有PAMAM间隔臂且端基叠氮化的配基偶联到炔化的载体表面制备免疫吸附剂。所述的仿生免疫吸附剂的制备方法,具体采用下述方案制备而成:
(1)炔化载体的制备
(2)PAMAM树枝状聚合物的合成
a、以3-叠氮基丙胺为起始原料,与丙烯酸C1~C4烷基酯进行Michael加成反应
b、G0.5PAMAM与乙二胺进行胺化反应
c、重复Michael加成反应和胺化反应n次,n=0~3的整数
(3)氨基酸甲酯盐酸盐的制备
(4)氨基酸修饰的PAMAM的制备
(5)以PAMAM为间隔臂的免疫吸附剂的制备
其中,(2)和(3)的顺序可以任意,(1)可以在(2)、(3)和(4)之前或之后。
其中,(1)的具体过程为:
向载体的水溶液中加入3-卤代丙炔和环状冠醚类相转移催化剂,每克载体中加入3-卤代丙炔3~15mmol和环状冠醚类相转移催化剂0.2~1.0mmol,20~60℃反应6~60h后,水洗,抽干;其中,所述3-卤代丙炔为炔丙溴、炔丙氯或炔丙碘。
优选地,所述环状冠醚类相转移催化剂为18-冠醚-6、15-冠醚-5、环糊精等中的一种或多种。
其中,(2)的具体过程为:
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加3-叠氮基丙胺,丙烯酸C1~C4烷基酯与3-叠氮基丙胺的摩尔比为5~15:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~50℃反应12~50h,将反应产物进行减压蒸馏,得G 0.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的醇溶液中滴加G0.5PAMAM,乙二胺与G0.5PAMAM的摩尔比为10~30:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~50℃反应12~50h,将反应产物进行减压蒸馏得第一代产物G1.0PAMAM;
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加G1.0PAMAM,丙烯酸C1~C4烷基酯与G1.0PAMAM的摩尔比为10~30:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~60℃反应15~60h,将反应产物进行减压蒸馏,得G1.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的醇溶液中滴加G1.5PAMAM,乙二胺与G1.5PAMAM的摩尔比为30~50:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~60℃反应15~60h,将反应产物进行减压蒸馏得第二代产物G2.0PAMAM;
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加G2.0PAMAM,丙烯酸C1~C4烷基酯与G2.0PAMAM的摩尔比为30~50:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~70℃反应18~66h,将反应产物进行减压蒸馏,得G 2.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的醇溶液中滴加G2.5PAMAM,乙二胺与G2.5PAMAM的摩尔比为70~90:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~70℃反应18~66h,将反应产物进行减压蒸馏得第三代产物G3.0PAMAM;
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加G3.0PAMAM,丙烯酸C1~C4烷基酯与G3.0PAMAM的摩尔比为70~90:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~80℃反应24~72h,将反应产物进行减压蒸馏,得G3.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的甲醇溶液中滴加G3.5PAMAM,乙二胺与G3.5PAMAM的摩尔比为150~170:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~80℃反应24~72h,将反应产物进行减压蒸馏得第四代产物G4.0PAMAM。
其中,(3)的具体过程为:
将氨基酸置于甲醇溶液中,加入三甲基氯硅烷,所述三甲基氯硅烷与氨基酸的摩尔比为1~3:1,回流至溶液澄清后旋蒸干燥;所述氨基酸置于甲醇溶液中,每1mmol氨基酸中甲醇加入量为1~3ml。所述氨基酸为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
其中,(4)的具体过程为:
将氨基酸甲酯盐酸盐溶于水中,并加入三乙胺及第一~第四代PAMAM产物中任意一种的水溶液,氨基酸甲酯盐酸盐、三乙胺与第一~第四代PAMAM产物的摩尔比为1~10:1~10:1;磁力搅拌下20~90℃反应24~96h,透析并冷冻干燥得氨基酸修饰的PAMAM产物,表示为PAMAM-AA;所述第一~第四代PAMAM产物为G1.0PAMAM、G2.0PAMAM、G3.0PAMAM和G4.0PAMAM;所述氨基酸甲酯盐酸盐溶于水中,每1mmol氨基酸甲酯盐酸盐加入水0.25~4ml。
其中,(5)的具体过程为:
将氨基酸修饰的PAMAM产物溶于水后,加入炔化载体,每克炔化载体加入1~10mmol氨基酸修饰的PAMAM产物,然后依次加入硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂,硫酸铜、抗坏血酸钠与氨基酸修饰的PAMAM产物的摩尔比为0.01~0.05:0.02~0.1:1,并于20~90℃反应24~96h,洗涤抽干得目标产物Gel-PAMAM-AA。
应当理解的是,硫酸铜可以由五水硫酸铜提供。
G 1.0PAMAM末端含2个氨基,其化学结构如步骤(b)所示G 1.0或结构通式中n=0时的结构。
G 2.0PAMAM末端含4个氨基,其化学结构如步骤(b)所示结构通式中n=1时的结构。
G 3.0PAMAM末端含8个氨基,其化学结构如步骤(b)所示结构通式中n=2时的结构。
G 4.0PAMAM末端含16个氨基,其化学结构如步骤(b)所示结构通式中n=3时的结构。
G 0.5PAMAM、G 1.5PAMAM、G 2.5PAMAM和G 3.5PAMAM分别为制备第一~第四代PAMAM产物G 1.0PAMAM、G 2.0PAMAM、G 3.0PAMAM和G 4.0PAMAM时的中间产物。
本发明提供以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂在IgG分离中的应用。
相对于现有技术,本发明具有如下优点和有益效果:
(1)以廉价,安全,稳定且具有可修饰性的氨基酸小分子为仿生配基代替常用的蛋白A制备免疫吸附剂,可避免蛋白A类免疫吸附剂昂贵,易脱落,安全性不高等缺陷。并可对配基的结构进行适宜的设计和修饰,使经修饰的配基保持其分子上用于与IgG等物质发生专一性结合的活性位点的完整并维持一定的空间结构。
(2)提出将反应条件温和、高效、高选择性的点击化学反应——Huisgen1,3-偶极环加成反应用于载体-配基的偶联,设计和制备非蛋白A类的免疫吸附剂的研究思路,可望大大提高载体与配基之间的偶联效果,避免副反应的发生,最大限度地保护配基上对IgG等物质发生专一性结合的活性位点,为非蛋白A类的免疫吸附剂的制备探索一条具有工业化前景的新途径。
(3)以树枝状的大分子PAMAM为间隔臂,使引入该类间隔臂后的载体比引入线形间隔臂的载体的外表面具有更多的活性位点,便于偶联更多的配基,从而增加了配基密度,提高所制备的免疫吸附剂的吸附性能。
(4)活化载体的制备方法更简便高效,提供了更多的活性位点供配基固载,从而提高了吸附剂的吸附效果。
(5)新的炔化载体和叠氮化PAMAM的制备方法使所得免疫吸附剂的结构更优化,如调整了三唑环的位置和方向,使其离分子结构紧凑、空间位阻大的树状PAMAM更远,更利于目标物质的吸附。
以上的优势将进一步提高吸附剂的临床治疗效果、安全性和可靠性。体外血浆吸附试验数据表明,本发明的仿生免疫吸附剂对人血浆中免疫球蛋白IgG具有特异性吸附。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,以更好地理解本发明。
实施例1
炔化琼脂糖凝胶的制备
在100mL锥形瓶中将0.05g 18-冠醚-6溶于15ml水,再加入4.0g琼脂糖,待琼脂糖分散均匀后加入0.3mL炔丙溴,20℃搅拌反应60h。反应完毕,洗涤抽干得炔化琼脂糖凝胶:
Gel在本实施例中为琼脂糖。
G3.0PAMAM树枝状聚合物的合成
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加丙烯酸甲酯(23.42g,272mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为0℃,然后在1h内连续滴加含有3-叠氮基丙胺(2.7g,27.2mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在0℃下反应1.5h,之后升温至35℃反应36h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 0.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加乙二胺(30.65g,510mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为0℃,然后在1h内连续滴加含有G 0.5的PAMAM(5.8g,25.5mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在0℃下反应1.5h,之后升温至35℃反应36h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G1.0PAMAM:
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加丙烯酸甲酯(24.45g,284mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为0℃,然后在1h内连续滴加含有G1.0(4.02g,14.2mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在0℃下反应1.5h,之后升温至40℃反应42h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 1.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加乙二胺(30.05g,500mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为0℃,然后在1h内连续滴加含有G1.5的PAMAM(7.85g,12.5mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在0℃下反应1.5h,之后升温至40℃反应42h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G2.0PAMAM:
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加丙烯酸甲酯(24.79g,288mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为0℃,然后在1h内连续滴加含有G 2.0(5.33g,7.2mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续0℃下反应1.5h,之后升温至55℃反应54h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 2.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加乙二胺(26.44g,440mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为0℃,然后在1h内连续滴加含有G 2.5的PAMAM(7.86g,5.5mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在0℃下反应1.5h,之后升温至55℃反应54h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏。所得黄色的粘稠体,即为G 3.0PAMAM:
组氨酸甲酯盐酸盐的制备
取50mmol L-组氨酸于500ml单口圆底烧瓶中,并加入150ml甲醇和150mmol三甲基氯硅烷。回流至溶液变澄清,旋蒸干燥即得组氨酸甲酯盐酸盐:
组氨酸修饰的G 3.0PAMAM的制备
将24mmol组氨酸甲酯盐酸盐溶于24ml水并置于150ml单口圆底烧瓶中,加入24mmol三乙胺及22ml溶有1mmol G 3.0PAMAM的水溶液,在磁力搅拌下70℃连续反应70h,透析袋透析除去未反应完全的小分子,冷冻干燥得到G 3.0-His,其中His表示L-组氨酸:
点击法制备以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂
将4.0mmol G 3.0-His的水溶液15ml置于100ml单口圆底烧瓶中,加入1.0g炔化琼脂糖。搅拌均匀后,加入溶有48mg五水硫酸铜的水溶液2.5ml和溶有76mg抗坏血酸钠的水溶液2.5ml。60℃连续反应反应48h后,依次用水、EDTA和水洗涤抽干所得的琼脂糖凝胶,即得免疫吸附剂Gel-G3.0-His:
实施例2
炔化纤维素凝胶的制备
在100ml锥形瓶中将0.26g 18-冠醚-6溶于20ml水,再加入4.0g纤维素凝胶球,待纤维素分散均匀后加入1.2ml炔丙溴,40℃反应30h。反应完毕,洗涤抽干得炔化纤维素凝胶。
G2.0PAMAM树枝状聚合物的合成
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加丙烯酸甲酯(23.42g,272mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为10℃,然后在1h内连续滴加含有3-叠氮基丙胺(5.4g,54.4mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在10℃下反应0.5h,之后升温至20℃反应12h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G0.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加乙二胺(15.33g,255mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为10℃,然后在1h内连续滴加含有G0.5的PAMAM(5.8g,25.5mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在10℃下反应0.5h,之后升温至20℃反应12h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G1.0PAMAM。
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加丙烯酸甲酯(12.23g,142mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为10℃,然后在1h内连续滴加含有G1.0(4.02g,14.2mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在10℃下反应0.5h,之后升温至20℃反应15h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G1.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加乙二胺(22.54g,375mmol),在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为10℃,然后在1h内连续滴加含有G1.5的PAMAM(7.85g,12.5mmol)的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在冰水浴中反应0.5h,之后升温至20℃反应15h,使胺解反应充分进行。反应完毕,将产物进行减压蒸馏。所得黄棕色的油状物,即为G2.0PAMAM。
色氨酸甲酯盐酸盐的制备
取50mmol L-色氨酸于500ml单口圆底烧瓶中,并加入100ml甲醇和100mmol三甲基氯硅烷。回流至溶液变澄清,旋蒸干燥即得色氨酸甲酯盐酸盐。
色氨酸修饰的G 2.0PAMAM的制备
将4mmol色氨酸甲酯盐酸盐溶于16ml水并置于100ml单口圆底烧瓶中,加入4mmol三乙胺,搅拌约15min后加入15ml溶有1mmol G2.0PAMAM的水溶液,在磁力搅拌下20℃连续反应24h,透析袋透析除去未反应完全的小分子,冷冻干燥得G 2.0-Trp,其中Trp表示L-色氨酸。
点击法制备以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂
将1.0mmol G 2.0-Trp的水溶液12ml置于100ml单口圆底烧瓶中,加入1.0g炔化纤维素。搅拌均匀后,加入溶有2.5mg五水硫酸铜的水溶液2.5ml和溶有4.0mg抗坏血酸钠的水溶液2.5ml。20℃连续反应反应24h后,依次用水、EDTA和水洗涤抽干所得的纤维素凝胶,即得免疫吸附剂Gel-G2.0-Trp。
实施例3
炔化PVA凝胶的制备
在100mL锥形瓶中将0.13g 18-冠醚-6溶于18mL水,再加入4.0g聚乙烯醇(PVA)凝胶球,待PVA分散均匀后加入0.6mL炔丙溴,60℃反应6h。反应完毕,洗涤抽干得炔化PVA凝胶。
G 4.0PAMAM树枝状聚合物的合成
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加300mmol丙烯酸甲酯,在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有20.0mmol 3-叠氮基丙胺的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在-10℃下反应1.5h,,之后升温至50℃反应50h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G0.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加465mmol乙二胺,在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有15.5mmol G0.5PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在-10℃下反应3h,之后升温至50℃反应50h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G1.0PAMAM。
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加426mmol丙烯酸甲酯,在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有14.2mmol G1.0PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在-10℃下反应3h,之后升温至60℃反应60h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G1.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加500mmol乙二胺,在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有10.0mmol G1.5PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在-10℃下反应3h,之后升温至60℃反应60h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 2.0PAMAM。
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加360mmol丙烯酸甲酯,在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有7.2mmol G 2.0PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续-10℃下反应3h,之后升温至70℃反应66h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 2.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加495mmol乙二胺,在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有5.5mmol G2.5PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在-10℃下反应3h,之后升温至70℃反应66h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 3.0PAMAM。
在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇70ml,再添加405mmol丙烯酸甲酯,在冰水浴中放置一段时间,使体系的温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有4.5mmol G3.0PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续-10℃下反应3h,之后升温至80℃反应72h。反应完毕,将产物进行减压蒸馏得G 3.5PAMAM;在250ml的圆底烧瓶中,先加入甲醇100ml,再添加510mmol乙二胺,在冰水浴中放置一段时间,使体系温度大约为-10℃,然后在1h内连续滴加含有3.0mmolG3.5PAMAM的甲醇溶液30ml,滴加完毕后继续在冰水浴中反应3h,之后升温至80℃反应72h,使胺解反应充分进行。反应完毕,将产物进行减压蒸馏。所得浅黄色的粘稠体,即为G4.0PAMAM。
苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备
取50mmol L-苯丙氨酸于500ml单口圆底烧瓶中,并加入50ml甲醇和50mmol三甲基氯硅烷。回流至溶液变澄清,旋蒸干燥即得苯丙氨酸甲酯盐酸盐。
苯丙氨酸修饰的G 4.0PAMAM的制备
将160mmol苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶于40ml水并置于250ml单口圆底烧瓶中,加入160mmol三乙胺,搅拌约15min后加入30ml溶有1mmol G4.0PAMAM的水溶液,在磁力搅拌下90℃连续反应96h,透析袋透析除去未反应完全的小分子,冷冻干燥得G4.0-Phe,其中Phe表示L-苯丙氨酸。
点击法制备以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂
将10mmol G4.0-Trp的水溶液30ml置于150ml单口圆底烧瓶中,加入1.0g炔化PVA。搅拌均匀后,加入溶有250mg五水硫酸铜的水溶液6ml和溶有400mg抗坏血酸钠的水溶液6ml。90℃连续反应反应96h后,依次用水、EDTA和水洗涤抽干所得的PVA凝胶,即得免疫吸附剂Gel-G4.0-Phe。
免疫吸附剂吸附性能研究
采用体外静态吸附方法来测试实施例1~3的吸附剂对人免疫球蛋白IgG的吸附性能:取健康人血浆在37℃下解冻,取1ml以灭菌生理盐水净化后的吸附剂,按照吸附剂:血浆=1:8(v/m)的比例,加入解冻后的血浆。将样品置于37℃的气浴恒温振荡槽中,以160rpm的转速吸附2h。吸附结束后,取出1ml上层血浆,采用免疫比浊法,使用罗氏全自动生化分析仪、免疫球蛋白IgG检测试剂盒检测吸附前后血浆中IgG的浓度变化,操作方法按试剂盒说明书进行。测试结果见表1。
表1 吸附剂对人免疫球蛋白IgG的吸附性能
吸附剂 | 吸附前(g/L) | 吸附后(g/L) | 吸附量(mg/g) |
实施例1 | 8.37 | 4.10 | 34.16 |
实施例2 | 8.37 | 4.72 | 29.20 |
实施例3 | 8.37 | 4.58 | 30.32 |
从表1的测试结果可以看出,本发明用于仿生免疫吸附剂对免疫球蛋白IgG具有优异的吸附性能,与蛋白A免疫吸附剂相当(吸附量22.97mg/g)。这是因为采用树枝状大分子为间隔臂后可以大大提高配基的固载量,从而使吸附剂的吸附容量相应地提高。此外,采用本方法制备的吸附剂的IgG吸附性能较专利CN201210152387.3有了进一步的提高,主要是因为采用本方法制备的活化载体的活性位点不会因多步反应而不断减少,更重要的是,所得炔化载体的活性位点较环氧化+叠氮化二步反应的更多,约为100μmol/mL,从而使得经点击反应后固载的氨基酸配基量增多,提高了吸附剂的吸附性能。此外,间隔臂结构的优化使得吸附剂的分子链柔性增加,进一步促进了其吸附性能。
由上述实例可知,本发明提供了一系列以不同亲水凝胶球为载体,不同代数的PAMAM为间隔臂、氨基酸为配基的仿生免疫吸附剂,它们能够特异性地从人血浆中吸附IgG,部分吸附剂的性能足以与蛋白A免疫吸附剂媲美,其低廉的价格和良好的性能使其具有取代蛋白A免疫吸附剂的潜能,并有望应用于临床。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂,具有如下Gel-PAMAM-AA的化学结构:
其中,Gel代表含羟基的亲水载体;AA代表氨基酸;n=0,1,2或3;PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状高分子,所述亲水载体为琼脂糖、纤维素或聚乙烯醇,所述氨基酸为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
2.一种如权利要求1所述的以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂的制备方法,其特征在于,采用下述方案制备而成:
(1)炔化载体的制备
(2)PAMAM树枝状聚合物的合成
a、以3-叠氮基丙胺为起始原料,与丙烯酸C1~C4烷基酯进行Michael加成反应
b、G0.5PAMAM与乙二胺进行胺化反应
c、重复Michael加成反应和胺化反应n次,n=0~3的整数
(3)氨基酸甲酯盐酸盐的制备
(4)氨基酸修饰的PAMAM的制备
(5)以PAMAM为间隔臂的免疫吸附剂的制备
其中,(2)和(3)的顺序可以任意,(1)可以在(2)、(3)和(4)之前或之后。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,(1)的具体过程为:
向载体的水溶液中加入3-卤代丙炔和环状冠醚类相转移催化剂,每克载体中加入3-卤代丙炔3~15mmol和环状冠醚类相转移催化剂0.2~1.0mmol,20~60℃反应6~60h后,水洗,抽干;其中,所述3-卤代丙炔为炔丙溴、炔丙氯或炔丙碘。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述环状冠醚类相转移催化剂为18-冠醚-6、15-冠醚-5、环糊精中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,(2)的具体过程为:
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加3-叠氮基丙胺,丙烯酸C1~C4烷基酯与3-叠氮基丙胺的摩尔比为5~15:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~50℃反应12~50h,将反应产物进行减压蒸馏,得G 0.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的醇溶液中滴加G0.5PAMAM,乙二胺与G0.5PAMAM的摩尔比为10~30:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~50℃反应12~50h,将反应产物进行减压蒸馏得第一代产物G1.0PAMAM;
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加G1.0PAMAM,丙烯酸C1~C4烷基酯与G1.0PAMAM的摩尔比为10~30:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~60℃反应15~60h,将反应产物进行减压蒸馏,得G1.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的醇溶液中滴加G1.5PAMAM,乙二胺与G1.5PAMAM的摩尔比为30~50:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~60℃反应15~60h,将反应产物进行减压蒸馏得第二代产物G2.0PAMAM;
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加G2.0PAMAM,丙烯酸C1~C4烷基酯与G2.0PAMAM的摩尔比为30~50:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~70℃反应18~66h,将反应产物进行减压蒸馏,得G 2.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的醇溶液中滴加G2.5PAMAM,乙二胺与G2.5PAMAM的摩尔比为70~90:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~70℃反应18~66h,将反应产物进行减压蒸馏得第三代产物G3.0PAMAM;
在温度为-10~10℃条件下,向丙烯酸C1~C4烷基酯的醇溶液中滴加G3.0PAMAM,丙烯酸C1~C4烷基酯与G3.0PAMAM的摩尔比为70~90:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~80℃反应24~72h,将反应产物进行减压蒸馏,得G3.5PAMAM;-10~10℃下,向乙二胺的甲醇溶液中滴加G3.5PAMAM,乙二胺与G3.5PAMAM的摩尔比为150~170:1,保温反应0.5~3h后,升温至20~80℃反应24~72h,将反应产物进行减压蒸馏得第四代产物G4.0PAMAM。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述丙烯酸C1~C4烷基酯为丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯或丙烯酸叔丁酯。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,(3)的具体过程为:
将氨基酸置于甲醇溶液中,加入三甲基氯硅烷,所述三甲基氯硅烷与氨基酸的摩尔比为1~3:1,回流至溶液澄清后旋蒸干燥;所述氨基酸置于甲醇溶液中,每1mmol氨基酸中甲醇加入量为1~3ml。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,(4)的具体过程为:
将氨基酸甲酯盐酸盐溶于水中,每1mmol氨基酸甲酯盐酸盐加入水0.25~4ml,并加入三乙胺及第一~第四代PAMAM产物中任意一种的水溶液,氨基酸甲酯盐酸盐、三乙胺与第一~第四代PAMAM产物的摩尔比为1~10:1~10:1;磁力搅拌下20~90℃反应24~96h,透析并冷冻干燥得氨基酸修饰的PAMAM产物,表示为PAMAM-AA;所述第一~第四代PAMAM产物为G1.0PAMAM、G2.0PAMAM、G3.0PAMAM和G4.0PAMAM。
9.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,(5)的具体过程为:
将氨基酸修饰的PAMAM产物溶于水后,加入炔化载体,每克炔化载体加入1~10mmol氨基酸修饰的PAMAM产物,然后依次加入硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂,硫酸铜、抗坏血酸钠与氨基酸修饰的PAMAM产物的摩尔比为0.01~0.05:0.02~0.1:1,并于20~90℃反应24~96h,洗涤抽干得目标产物Gel-PAMAM-AA。
10.权利要求1所述的以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂在IgG分离中的应用。
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