CN104490986A - 一种甘遂活性组分及其制备方法与应用 - Google Patents

一种甘遂活性组分及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甘遂活性组分的制备方法，采用二维液相色谱技术，以正己烷－乙醇为流动相，以正相硅胶色谱柱为一维制备色谱柱，对甘遂提取物进行组分切割，收集目标组分为一维分离组分，再以X-Amide为二维制备色谱柱，对一维分离组分进行组分切割，收集，旋转蒸发浓缩而得到的，其制备过程重复性高，可操作性好，同时甘遂资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求。

Description

一种甘遂活性组分及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物生产领域，尤其是一种甘遂活性组分及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肺癌、乳腺癌、肝癌等癌症的高发区域，癌症死亡率去居高不下。
在过去的半个世纪中，大量的科研力量致力于抗肿瘤药物的研究，同时也有一些有效的药物上市造福肿瘤患者，但是仍有许多急待解决的问题，如对肿瘤细胞的选择性抑制较差，一些抗肿瘤药物在治疗患者所患癌症的同时却引发新的肿瘤的形成。所以，目前寻找具有更高选择性、更低毒性的抗癌药物仍是研究的热点，所以本发明研究甘遂提取物抗肿瘤活性旨在找出具有更好抗癌活性的新型药物。
甘遂为大戟科大戟属的植物，为中国的特有植物。分布于中国大陆的甘肃、山西、陕西、宁夏、河南等地，甘遂中主要含有巨大戟二萜醇类化合物和少量的三萜类化合物。神农本草经记载其有泄水逐饮的功效。现代研究表明,甘遂具有抗肿瘤、抗生育、抗病毒、抗胰腺炎、泻下和免疫抑制等作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种甘遂活性组分。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述甘遂活性组分的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述甘遂活性组分的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种甘遂活性组分，是由下述方法得到的：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粉末与乙酸乙酯的液料比按kg/L计为1:(3-8)用乙酸乙酯在60℃下浸泡5h，提取1-3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，溶于乙醇体积分数为40％-70％的正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为50-300mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱方式，0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7峰(18.6-20.7min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维分离组分；
(3)用乙醇体积分数为10-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为0.1-1.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；10-27％B梯度洗脱样品25min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7-3峰(13.8-15.5min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即得。
上述甘遂活性组分的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粉末与乙酸乙酯的液料比按kg/L计为1:(3-8)用乙酸乙酯在60℃下浸泡5h，提取1-3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，溶于乙醇体积分数为40％-70％的正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为50-300mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱方式，0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7峰(18.6-20.7min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维分离组分；
(3)用乙醇体积分数为10-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为0.1-1.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；10-27％B梯度洗脱样品25min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7-3峰(13.8-15.5min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即得。
上述甘遂活性组分的制备方法中对步骤(4)得到的各试验组分进行抗肿瘤活性实验，利用建立的体外细胞抗肿瘤筛选模型评估各试验组分的相对抗肿瘤能力，以等量的二甲基亚砜(DMSO)作为空白对照组，甘遂各试验组分与DMSO在相同浓度条件下作用于体外抗肿瘤药物筛选模型的细胞，通过实时监测试验组与对照组细胞的生长状况，选取得到相对抗肿瘤活性最好的组分GS-7-3即为本发明所述甘遂抗肿瘤活性目的组分。
优选的，上述甘遂活性组分的制备方法，所述步骤(2)中一维液相色谱分离采用的色谱柱为正相硅胶轴向加压色谱柱，填料为Agela Innoval silica(250mm×150mm；10μm,)，使用时柱温为室温或25-40℃；
优选的，上述甘遂活性组分的制备方法，所述步骤(4)中二维液相色谱采用的色谱柱为：Acchrom X-Amide(250mm×20mm；10μm，)色谱柱，使用时柱温为室温或25-40℃；
优选的，上述甘遂活性组分的制备方法，所述步骤(1)(2)(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.05-0.08Mpa、温度60℃。
上述甘遂活性组分在制备抗肿瘤药物或保健食品中的应用。
其中，该甘遂活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，该抗肿瘤活性组分作为有效成分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
本发明的有益效果是：
上述甘遂活性组分，采用二维液相色谱技术，以正己烷－乙醇为流动相，以正相硅胶色谱柱为一维制备色谱柱，对甘遂提取物进行组分切割，收集目标组分为一维分离组分，再以X-Amide为二维制备色谱柱，对一维分离组分进行组分切割，收集，旋转蒸发浓缩而得到的，其制备过程重复性高，可操作性好，同时甘遂资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求。
附图说明
图1所示的是本发明从甘遂中分离抗肿瘤活性组分的一维高效制备液相色谱图；
图2所示的是本发明从甘遂中分离抗肿瘤活性组分的二维高效制备液相色谱图；
图3为GS-7-3抑制人肺癌A549细胞生长的细胞实时检测图；
图4为GS-7-3抑制人肝癌Hep-G2细胞生长的细胞实时检测图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：
甘遂抗肿瘤活性组分的制备
以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在60℃水浴下,加热5h,连续提取三次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状。称取30g，溶于400mL乙醇体积分数为40％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为75mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innoval silica(250mm×150mm；10μm,)，流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为200mL/针，流动相流速为600mL/min，收集18-20分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分。用30％的乙醇-正己烷溶液溶解一维组分，浓度为80mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为Acchrom X-Amide色谱柱(250mm×20mm；10μm，)，流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，采用10-27％B梯度洗脱25min，100％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为0.6mL/针，流动相流速为13mL/min，收集19.5-21.5分钟的馏分，旋转蒸发至干，得受试组分，在一维制备粗品中的含量为10％。
实施例2：
甘遂抗肿瘤活性组分的制备
以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在60℃水浴下,加热5h,连续提取三次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状。称取35g，溶于500mL乙醇体积分数为50％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为70mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innoval silica(250mm×150mm；10μm,)，流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为230mL/针，流动相流速为600mL/min，收集17-19分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分。用35％的乙醇-正己烷溶液溶解一维组分，浓度为90mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为Acchrom X-Amide色谱柱(250mm×20mm；10μm，)，流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，采用10-27％B梯度洗脱25min，100％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为0.6mL/针，流动相流速为14mL/min，收集18.5-22分钟的馏分，旋转蒸发至干，得受试组分，在一维制备粗品中的含量为15％。
实施例3：
甘遂抗肿瘤活性组分的制备
以甘遂为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯在60℃水浴下,加热5h,连续提取三次，取上清减压蒸馏的方式进行浓缩，得到乙酸乙酯粗提物，呈浸膏状。称取58g，溶于1000mL乙醇体积分数为70％的乙醇-正己烷溶液，制得甘遂提取物溶液，浓度为58mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备，色谱柱为Innoval silica(250mm×150mm；10μm,)，流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为150mL/针，流动相流速为600mL/min，收集18.6-20.7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分(如图1所示)。用47％的乙醇-正己烷溶液溶解一维组分，浓度为60mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行二维液相色谱制备，色谱柱为AcchromX-Amide色谱柱(250mm×20mm；10μm，)，流动相采用二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇，采用10-27％B梯度洗脱25min。采用紫外检测器，检测波长210nm，制备温度为室温，进样量为0.4mL/针，流动相流速为16mL/min，收集13.8-15.5分钟的馏分(如图2所示)，旋转蒸发至干，得受试组分，在一维制备粗品中的含量为20％。
实施例4：
抑制人肺癌细胞A549生长的试验
将艾森生物(杭州)有限公司生产的八孔板(E-Plate L8)与iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪组合，向每孔中加入150ul的完全MEM培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中，将背景数据调至40—130之间。将甘遂各试验组分用DMSO完全溶解至50mg/mL，再用完全MEM培养基将其稀释成5mg/mL工作液，将培养好的人肺癌细胞A549用胰酶消化，并稀释成2×104/ml的活细胞悬液，接种于八孔板中，每孔345μL，加入各试验组分溶液5μL，使其终浓度为50μg/mL，对照孔则加入5μL1‰DMSO的完全MEM培养基，置于37℃，5％CO2的培养基中培养48小时。
GS-7-3(实施例3所得馏分)抑制人肺癌细胞A549生长的实时数据(48小时)如图3所示。
实施例5：
抑制人肝癌细胞Hep-g2生长的实验：
将艾森生物(杭州)有限公司生产的八孔板(E-Plate L8)与iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪组合，向每孔中加入150ul的完全F-12K培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中，将背景数据调至40-130之间。将甘遂各试验组分用DMSO完全溶解至50mg/mL，再用完全F-12K培养基将其稀释成5mg/mL工作液，将培养好的人肝癌细胞Hep-g2用胰酶消化，并稀释成4×104/ml的活细胞悬液，接种于八孔板中，每孔345ul，加入C310-6溶液5ul，使其终浓度为50μg/mL，对照孔则加入5μL1‰二甲基亚砜的完全F-12K培养基，置于37℃，5％CO2的培养基中培养48小时。
GS-7-3(实施例3所得馏分)抑制人肺癌细胞A549生长的实时数据(48小时)如图4所示。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合医药制备领域的普通市售产品。
上述参照具体实施方式对该一种甘遂活性组分的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种甘遂活性组分，其特征在于：是由下述方法得到的：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉，甘遂粉末与乙酸乙酯的液料比按kg/L计为1:(3-8)用乙酸乙酯在60℃下浸泡5h，提取1-3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，溶于乙醇体积分数为40％-70％的正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为50-300mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱方式，0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7峰(18.6-20.7min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维分离组分；
(3)用乙醇体积分数为10-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为0.1-1.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；10-27％B梯度洗脱样品25min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7-3峰13.8-15.5min作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即得。
2.权利要求1所述的甘遂活性组分的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)制备甘遂粗提物：以甘遂为原料，磨成粉末状得到干燥的甘遂粗粉， 甘遂粉末与乙酸乙酯的液料比按kg/L计为1:(3-8)用乙酸乙酯在60℃下浸泡5h，提取1-3次，静置过夜，取上清，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，溶于乙醇体积分数为40％-70％的正己烷-乙醇溶液中，进行减压抽滤，得到甘遂浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对所得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为50-300mL/针；流动相流速为600mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；梯度洗脱方式，0-37.5％B洗脱30min，100％B洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7峰(18.6-20.7min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维分离组分；
(3)用乙醇体积分数为10-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为0.1-1.0mL/针；流动相流速为10-18mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；10-27％B梯度洗脱样品25min；根据紫外吸收光谱收集其中的GS-7-3峰13.8-15.5min作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即得。
3.根据权利要求2所述的甘遂活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中一维液相色谱分离采用的色谱柱为正相硅胶轴向加压色谱柱，填料为Agela Innoval silica，使用时柱温为室温或25-40℃。
4.根据权利要求2所述的甘遂活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中二维液相色谱采用的色谱柱为：Acchrom X-Amide色谱柱，使用时柱温为室温或25-40℃。
5.根据权利要求2所述的甘遂活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)(2)(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.05-0.08Mpa、温度60℃。
6.权利要求1所述的甘遂活性组分在制备抗肿瘤药物或保健食品中的应用。
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