CN104490878B - 苦豆碱在制备治疗缺血性脑卒中的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了苦豆碱（aloperine，ALO）作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，通过建立氧糖剥夺模型从而探究苦豆碱对氧糖剥夺后的新生大鼠脑缺血的保护作用及可能的机制，本发明的实验结果表明在氧糖剥夺再灌注之后，它降低了细胞内的活性氧，丙二醛含量，增加了过氧化氢酶、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶三种抗氧化物酶的含量，提高了总抗氧化能力；除此之外，苦豆碱可以稳定线粒体膜电位，降低海马神经元的凋亡率以及钙离子浓度，说明苦豆碱的保护作用可能与抗氧化有关，这些结果证明苦豆碱对缺血性损伤有保护作用。

Description

苦豆碱在制备治疗缺血性脑卒中的药物的用途
技术领域
本发明涉及苦豆碱的应用，特别涉及苦豆碱在制备治疗缺血性脑卒中的药物的用途。
背景技术
缺血性脑病(ischemic brain disease)又称缺血性中风，目前已成为全球范围内主要致死、致残的疾病之一，严重威胁着人类的生命与健康。在近些年的研究中发现，脑缺血后有相当部分的血管能自然再通或经溶栓治疗后恢复再通，但随之而来的是进一步的脑损伤和功能障碍即缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)，因此抑制缺血再灌注损伤已成为目前治疗缺血性脑病的关键环节。
有关脑缺血再灌注损伤发生机制的研究近年来进展很快，研究认为脑血流中断和再灌注导致的脑细胞损伤是一个多因素、多机制、快速的恶性级联反应。这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。
随着对细胞抗氧化研究的进一步深入，人们逐渐认识到细胞抗氧化在继发于缺血性脑损伤发病机制中发挥着重要作用。目前，抗氧化机制参与脑缺血损伤已成为基础与临床研究的热点。
苦豆碱系豆科槐属植物苦豆子(sophord alopecuroides L)中的生物碱，苦豆子分布于我国宁夏等北方沙谟地区.苦豆碱(aloperine)对多种致炎剂I起的急性炎症和III型变态反应及佐剂关节炎均有显著的抑制作用.其抗炎、抗变态反应作用不依赖于垂体一肾上腺皮质系统，主要与其抑制WBC游走，稳定溶酶体膜促进自由基清除，抑制PG、组胺、淋巴因子等炎症介质的台成或释放及致炎活性有关。研究已经发现苦豆碱具有抗炎，抗癌的作用，但其对脑缺血神经损伤、神经退行性疾病等神经损伤性疾病的保护作用目前尚未见报道，将其发展为缺血性脑卒中治疗药物具有极高的潜在价值与社会意义。
发明内容
本发明的目的通过苦豆碱药理作用的研究，提供苦豆碱在制备治疗缺血性脑卒中的药物的用途。
本发明通过以下技术方案来实现发明目的：
苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，所述缺血性脑卒中为对氧糖剥夺后的急性期或修复期的缺血性脑卒中，所述苦豆碱的分子结构式如式(1)所示
具体地，所述缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中。
具体地，所述苦豆碱的单次应用量仅限于不引起血糖降低的剂量。
具体地，所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为25mg/L～100mg/L。
优选地，所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为25mg/L。
优选地，所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为50mg/L。
优选地，所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为100mg/L。
具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型或粉针剂型。
本发明公开的苦豆碱在制备治疗缺血性脑卒中的药物的用途，具有如下有益效果：
本发明通过建立氧糖剥夺模型从而探究苦豆碱对氧糖剥夺后的新生大鼠脑缺血的保护作用及可能的机制，在氧糖剥夺再灌注之后，它降低了细胞内的活性氧，丙二醛含量，增加了抗氧化物酶：过氧化氢酶、过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量，提高了总抗氧化能力，苦豆碱的保护作用可能与抗氧化有关，并且苦豆碱可以稳定线粒体膜电位，降低海马神经元的凋亡率以及钙离子浓度的升高，对缺血性损伤有保护作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明：
实施例1
苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其中，苦豆碱的分子结构式如式(1)所示
缺血性脑卒中为对氧糖剥夺后的急性期或修复期的缺血性脑卒中，苦豆碱的在细胞中单次应用量为25mg/L，药物的剂型为药剂学上允许的粉针剂型。
实施例2
苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其中，苦豆碱的分子结构式如式(1)所示
缺血性脑卒中为对氧糖剥夺后的急性期或修复期的缺血性脑卒中，苦豆碱的在细胞中单次应用量为50mg/L，药物的剂型为药剂学上允许的注射剂型。
实施例3
苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其分子结构式如式(1)所示
缺血性脑卒中为对氧糖剥夺后的急性期或修复期的缺血性脑卒中，苦豆碱的在细胞中单次应用量为100mg/L，药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型。
实施例1至3的效果可以通过下面的动物实验得到验证：
1实验材料
培养的新生大鼠海马神经元，甲氮甲唑蓝(MTT)购自广州化学试剂厂；酶标仪购自Thermo公司；乳酸脱氢酶LDH，丙二醛MDA，过氧化氢酶CAT，TAOC，超氧化物歧化酶SOD，谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX，ROS测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；钙离子，Hoechst，MMP试剂盒：碧云天试剂公司。
2实验方法
2.1实验分为模型组，苦豆碱不同浓度组(100mg/L、50mg/L、25mg/L)，尼莫地平阳性对照组和正常组，制作细胞氧糖剥夺再灌注模型组：海马神经元于培养第8d换以无糖EBSS平衡盐缓冲液充分冲洗若干次，使葡萄糖终浓度小于1mol/L，加入无糖Earle’s平衡盐溶液(EBSS液)，并放入缺氧盒内，持续缓慢通入含有N2的混合气体2h，取出并吸弃平衡盐缓冲液，换以完全培养基置入CO2培养箱孵育，模拟体内缺血再灌注的过程，孵育24h；苦豆碱不同浓度组：换以无糖EBSS液建立缺糖缺氧模型，在再灌注时间点前分别加入高、中、低(100mg/L、50mg/L、25mg/L)三个浓度的苦豆碱，其他处理同氧糖剥夺再灌注模型组；尼莫地平阳性对照组：换以无糖EBSS液以建立氧糖剥夺模型，在再灌注时间点前加入尼莫地平，其他处理同氧糖剥夺再灌注模型组；正常组：对细胞不做任何处理。
2.2苦豆碱对缺糖缺氧再灌注损伤海马神经元的LDH与细胞活力的影响：给予不同药物处理的细胞经氧糖剥夺恢复氧糖正常培养24h后，收集上清用于测定LDH；再加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜DMSO混匀，选择570nm波长测定各孔光吸收值，记录结果。细胞活力(％)＝实验组光吸收值/对照组光吸收值×100％。
2.3苦豆碱对缺糖缺氧再灌注损伤海马神经元保护作用的机制分析：原代培养海马神经元，每组8例，于培养第7d，制备各实验组缺糖缺氧再灌注损伤模型，依检测指标要求，进行预处理。分光光度计检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)、以及总抗氧化能力(TAOC)，用hoechst染色法检测细胞损伤程度，激光共聚焦显微镜(CLSM)测定海马神经元内Ca2+浓度和线粒体膜电位水平(MMP)。
3结果
3.1苦豆碱对氧糖剥夺后新生大鼠海马神经元的存活率和LDH漏出率的影响Mean±S.E.M
表1苦豆碱对氧糖剥夺后新生大鼠海马神经元的存活率和LDH漏出率的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；Mean±S.E.M，n＝6)
由表1结果可见，苦豆碱降低了氧糖剥夺再灌注后对海马神经元的损伤率，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，说明苦豆碱对其有保护作用。
1.3.2苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元凋亡率的影响
表2苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元凋亡率的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)由表2结果可以看出，与模型组相比，苦豆碱降低氧糖剥夺对大鼠海马神经元的凋亡率，并且随苦豆碱浓度的增大，海马神经元凋亡率降低，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，说明苦豆碱可以抗凋亡。
1.3.3苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元内Ca2+浓度的影响
表3苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元内Ca2+浓度的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；Mean±S.E.M，n＝6)
细胞内钙离子越多，荧光越强，细胞损伤越大，由表3结果可知，与模型组相比，苦豆碱组能明显降低大鼠海马神经元内的Ca2+浓度，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，说明苦豆碱能减少细胞损伤，对其有保护作用。
1.3.4苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元MMP的影响
表4苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元MMP的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；Mean±S.E.M，n＝6)
检测到的线粒体膜电位(MMP)越大，红绿荧光比值越小，细胞损伤的越严重，由表4结果可见，与模型组比较，苦豆碱可以稳定线粒体膜电位(MMP)，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05。
1.3.5苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元丙二醛含量的影响
表5苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元丙二醛含量的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；Mean±S.E.M，n＝6)
丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜指过氧化程度和植物对逆境地条件反应的强弱，细胞损伤越严重，丙二醛含量越大，由表5结果可见，与模型组相比，苦豆碱组降低了大鼠海马神经元细胞内的丙二醛含量，且随苦豆碱浓度的增大，丙二醛含量降低，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01。
1.3.6苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元抗氧物酶的影响
表6苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元抗氧物酶的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；Mean±S.E.M，n＝6)
细胞内抗氧化能力越强，说明细胞损伤越少，由表6结果可知，与模型组相比，苦豆碱组增加了氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元中的三种抗氧化物酶：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的含量，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，说明苦豆碱对细胞有保护作用。
1.3.7苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元总抗氧化能力(TAOC)的影响
表7苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元总抗氧化能力(TAOC)的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)
检测到氧糖剥夺后海马神经元的总抗氧化能力越高说明细胞活性越强，由表7结果可知，与模型组相比，苦豆碱组提高了总抗氧化能力(TAOC)，且呈浓度相关性，随着浓度的升高，抗氧化能力(TAOC)提高，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01。
1.3.8苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元总活性氧(ROS)的影响
表8苦豆碱对氧糖剥夺再灌注损伤大鼠海马神经元总活性氧(ROS)的影响
(与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；Mean±S.E.M，n＝6)
检测氧糖剥夺后海马神经元的活性氧，活性氧含量越大，细胞损伤越大，由表8的实验结果可见，与模型组相比，苦豆碱组可以降低大鼠海马神经元总活性氧(ROS)的含量，且在一定浓度范围内，随着苦豆碱浓度的升高，对大鼠海马神经元总活性氧(ROS)含量降低得越多，与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01。
上述所有实验结果都证明苦豆碱对氧糖剥夺后的新生大鼠海马神经元具有保护作用，其保护机制与抗氧化有关。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，所述缺血性脑卒中为对氧糖剥夺后的急性期或修复期的缺血性脑卒中，所述苦豆碱的分子结构式如式(1)所示,
2.根据权利要求1所述的苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其特征在于：所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为25mg/L～100mg/L。
3.根据权利要求2所述的苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其特征在于：所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为25mg/L。
4.根据权利要求2所述的苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其特征在于：所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为50mg/L。
5.根据权利要求2所述的苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其特征在于：所述苦豆碱的在细胞中单次应用量为100mg/L。
6.根据权利要求1～5任一项权利要求所述的苦豆碱作为唯一活性成分在制备治疗对氧糖剥夺后的缺血性脑卒中的药物的用途，其特征在于：所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型。
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