CN104487584A

CN104487584A - D-乳酸的生产方法、聚合物的生产方法和聚合物

Info

Publication number: CN104487584A
Application number: CN201380038822.2A
Authority: CN
Inventors: 宫泽大辅; 酒井智美; 高桥均; 大垣弘毅
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2012-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN104487584B; WO2014017469A1; JPWO2014017469A1

Abstract

通过在含有无机电解质和碳源、并且至少满足选自下述(a)、(b)、(c)和(d)中至少一个条件的无机盐培养基中对生产D－乳酸的大肠杆菌进行培养，从而生产D－乳酸，所述(a)、(b)、(c)和(d)为：(a)所述无机盐培养基中除所述碳源以外的有机物的含量在培养开始时为10g/L以下，(b)所述无机盐培养基中所述无机电解质的含量在培养开始时为11g/L以下，(c)所述无机盐培养基中硫胺素的含量为0.1mg/L以下，(d)所述无机盐培养基中过渡金属离子的含量为10mg/L以下。

Description

D-乳酸的生产方法、聚合物的生产方法和聚合物

技术领域

本发明涉及D－乳酸的生产方法、聚合物的生产方法和聚合物。

背景技术

乳酸是近年来作为聚合物原料及农药、医药的中间体而受到关注的有用物质。自然界中存在有乳酸菌、丝状菌等高效生产乳酸的微生物，在使用这些微生物的乳酸制造方法中，已知使用德氏乳杆菌(Lactbacillus delbrueckii)等作为高效生产L－乳酸的微生物的方法，以及使用芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus)属微生物等作为高效生产D－乳酸的微生物的方法。

D－乳酸作为与L－乳酸形成的立构复合型聚乳酸的原料、医药中间体，在近年来受到关注。在上述任一种用途中，对于作为原料的D－乳酸，都要求高的光学纯度。

D－乳酸在工业上一般通过利用以大肠杆菌为代表的微生物的发酵法制造。由于发酵工序是进行微生物的培养和以增殖的微生物作为催化剂的物质生产的步骤，因此对微生物的增殖而言，营养源是必需的。作为其营养源，在玉米加工过程中得到的玉米浆(cornsteep liquor)含有较多的氨基酸等，营养价值高，并且便宜，因此被用于D－乳酸的发酵原料。

由于该玉米浆含有L－乳酸，因此成为导致所得的D－乳酸的光学纯度下降的原因之一。从该观点考虑，例如在专利文献1中，以在有效地制造乳酸的同时还提高产品的光学纯度为目的，对快速分解原料中含有的L－乳酸进行了研究。

在这样的组合之外，正在进行在不使用玉米浆这种含有L－乳酸的原料的情况下有效地制造D－乳酸的情况。特别是对使用大肠杆菌的D－乳酸制造方法而言，在专利文献2中公开了在以下述的无机盐作为主成分的培养基中加入糖，并使用该培养基的D－乳酸的发酵生产方法。

另外，用于培养大肠杆菌的以无机盐为主成分的培养基，还记载于例如专利文献3和非专利文献1中。专利文献2、3和非专利文献1记载的培养基除了多种无机盐以外还含有硫胺素、以及钴、锌、铜等过渡金属等。由于这些硫胺素、过渡金属离子作为微生物细胞内酶所产生的生物化学反应的辅助因子而起到了重要的作用，因此可以认为是非常重要的成分。需要说明的是，在专利文献2、3中还记载了向以无机盐作为主成分的培养基中适当添加甜菜碱的内容。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2010/032697号小册子

专利文献2：日本特开2012－10715号公报

专利文献3：日本特开2009－261360号公报

非专利文献

非专利文献1：BMC Microbiology，Vol.11，Art.No.70(2011)

发明内容

然而，上述文献中没有记载关于由得到的D－乳酸能够获得何种D－乳酸聚合物的见解。

另外，由于专利文献2、3记载的培养基中多种成分是必需的，因此不仅在培养基的制备方面需要费工夫，而且由于还以某种规定的量使用多种成分，结果导致培养基成本的上升。

本发明在于提供一种更廉价并且高效地生产D－乳酸的方法。

本发明人为了解决上述问题而反复地进行了深入研究，结果发现通过用无机盐培养基对生产D－乳酸的大肠杆菌进行培养，聚合后可得到高品质的聚合物。另外还发现，通过使无机盐培养基中的成分为最小限度，可以更廉价并且高效地生产D－乳酸。

即，本发明如以下[1]～[17]所述。

[1]一种D－乳酸的生产方法，通过在含有无机电解质和碳源、并且满足选自下述(a)、(b)、(c)和(d)中的至少一个条件的无机盐培养基中对生产D－乳酸的大肠杆菌进行培养，从而生产D－乳酸，

(a)所述无机盐培养基中，除所述碳源以外的有机物的含量在培养开始时为10g/L以下，

(b)所述无机盐培养基中所述无机电解质的含量在培养开始时为11g/L以下，

(c)所述无机盐培养基中硫胺素的含量为0.1mg/L以下，

(d)所述无机盐培养基中过渡金属离子的含量为10mg/L以下。

[2]如[1]所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机盐培养基至少满足所述(c)或所述(d)中的任一个条件。

[3]如[1]或[2]所述的D－乳酸的生产方法，其用于生产作为聚合物原料的D－乳酸。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，培养开始时的所述无机盐培养基进一步满足下述(e)，

(e)所述无机盐培养基中所述过渡金属离子的含量为0.85mg/L以下。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述碳源为糖。

[6]如[5]所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述糖包含选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麦芽糖、蜜二糖酸(melibionic acid)、乳糖、麦芽三糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、岩藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N－乙酰葡糖胺中的一种以上化合物。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机电解质包含选自钾离子、磷酸根离子、铵离子、硫酸根离子和镁离子中的一种以上离子作为构成成分。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机电解质包含钾离子，

在培养开始时的所述无机盐培养基中，所述钾离子的浓度为5.8mmol/L以上且73mmol/L以下。

[9]如[1]～[8]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机盐培养基是将所述无机电解质溶解或混悬于水中而制备的液体。

[10]如[1]～[9]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机盐培养基进一步包含甜菜碱。

[11]如[1]～[10]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述生产D－乳酸的大肠杆菌为重组大肠杆菌。

[12]如[1]～[10]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其包括以下工序：在所述无机盐培养基中使所述生产D－乳酸的大肠杆菌与所述碳源接触，得到D－乳酸盐的工序；和

从含有所述D－乳酸盐的所述无机盐培养基中除去所述生产D－乳酸的大肠杆菌后，将所述D－乳酸盐脱盐，得到D－乳酸的工序。

[13]如[12]所述的D－乳酸的生产方法，其中，在得到所述D－乳酸盐的所述工序中，得到D－乳酸的碱土金属盐，

在得到所述D－乳酸的所述工序中，通过将D－乳酸的碱土金属盐脱盐，使含有碱土金属的无机盐析出。

[14]如[12]所述的D－乳酸的生产方法，其中，在得到所述D－乳酸盐的所述工序中，得到所述D－乳酸的碱金属盐，

在得到所述D－乳酸的所述工序中，通过电解透析处理将D－乳酸的碱金属盐脱盐。

[15]如[12]～[14]中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其进一步包括在将所述D－乳酸盐脱盐得到D－乳酸的所述工序后，进行D－乳酸纯化的纯化工序，

在所述纯化工序中，一边水解一边进行蒸馏。

[16]一种聚合物的生产方法，使用通过[1]～[15]中任一项所述的D－乳酸的生产方法得到的D－乳酸进行聚合反应。

[17]一种聚合物，是通过[16]所述的聚合物的生产方法得到的。

根据本发明，提供一种更廉价并且高效地生产D－乳酸的方法。

附图说明

上述目的及其他目的、特征和优点通过以下所述的优选实施方式以及附带的以下附图而进一步明确。

[图1]是表示用于本实施方式的D－乳酸的生产方法的发酵装置的一个例子的图。

[图2]是表示用于本实施方式的D－乳酸的生产方法的电渗析装置的一个例子的图。

具体实施方式

本实施方式的D－乳酸的生产方法中，通过在含有无机电解质和碳源、并且满足选自下述(a)、(b)、(c)和(d)中的至少一个条件的无机盐培养基中对生产D－乳酸的大肠杆菌进行培养，从而生产D－乳酸。由此，可以更廉价并且高效地生产D－乳酸。

(a)无机盐培养基中，除碳源以外的有机物的含量在培养开始时为10g/L以下。

(b)无机盐培养基中无机电解质的含量在培养开始时为11g/L以下。

(c)无机盐培养基中硫胺素的含量为0.1mg/L以下。

(d)无机盐培养基中过渡金属离子的含量为10mg/L以下。

在本实施方式的D－乳酸的生产方法中，无机盐培养基满足选自上述(a)、(b)、(c)和(d)中的1个以上的条件，优选满足选自上述(a)、(b)、(c)和(d)中的2个以上的条件，更优选满足选自上述(a)、(b)、(c)和(d)中的3个以上的条件，进一步优选满足上述(a)、(b)、(c)和(d)中的全部条件。由此，可以生产作为聚合物原料的D－乳酸。另外，根据本实施方式的D－乳酸的生产方法，可以得到适合于聚合物原料用途的D－乳酸。

以下，对本实施方式的D－乳酸的生产方法进行详细说明。

在本实施方式中，所谓碳源是生产D－乳酸的大肠杆菌在生产D－乳酸方面能够利用的发酵性的糖，更具体而言，优选包含选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麦芽糖、蜜二糖酸、乳糖、麦芽三糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、岩藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N－乙酰葡糖胺中的一种以上化合物。另外，还可以使用淀粉水解物、草木质分解产物、纤维素水解物等作为碳源。

需要说明的是，为了在进行D－乳酸生产时利用上述糖，还可以向大肠杆菌中导入需要的酶基因或提高利用效率的基因。作为具体的例子，可以举出如本申请实施例所记载的那样，利用导入了蔗糖酶的大肠杆菌从蔗糖进行的D－乳酸生产。

在本实施方式的无机盐培养基中，还包含除碳源以外的有机物。此处，除碳源以外的有机物是上述发酵性糖以外的有机物，例如，可以列举有机氮源。作为关于除碳源以外的有机物的更具体的例子，可以列举油渣类、大豆水解物、酪蛋白分解物、氨基酸类、玉米浆、酵母及酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等肽类、麦芽提取物、乳清、各种发酵菌体及其水解物、或它们所含的有机物成分等。另外，维生素类也是除碳源以外的有机物的一个例子。进而，为了提高无机盐培养基的pH缓冲作用而添加的作为缓冲剂的有机物，可以列举作为碳源以外的有机物的例子，例如，可以列举MOPS(3－(N－吗啉基)丙磺酸)、Tris(三(羟基甲基)氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)等。

当本实施方式中含有无机电解质和碳源的无机盐培养基中含有大量上述除碳源以外的有机物时，由于可能会产生以下不良情况：用于获得D－乳酸的纯化工序变得复杂、对聚合物的色调产生不良影响等，因此优选对无机盐培养基中含有的除碳源以外的有机物量进行限制。

在本实施方式中，无机盐培养基中除碳源以外的有机物含量，在培养开始时优选为10g/L以下，从聚合物色调的观点考虑，更优选为2g/L以下，进一步优选为0.6g/L以下。例如，在培养开始时的无机盐培养基中，除碳源以外的有机物的含量优选为0～10g/L的范围，更优选为0～2g/L，进一步优选为0～0.6g/L。另外，对于下限值，从聚合物色调的观点考虑，优选为0g/L以上。

需要说明的是，在本实施方式的D－乳酸的生产方法中，所谓“培养开始时”是指即将向培养基中接种生产D－乳酸的大肠杆菌之前。

另外，本实施方式的D－乳酸的生产方法中的“无机盐培养基”，是在使用微生物的乳酸发酵中，将包含微生物必需的元素中除碳源以外的元素作为构成成分的无机电解质溶解或混悬于水中而制备的液体培养基。

另外，在本实施方式的D－乳酸的生产方法中，无机电解质优选包含选自钾离子(K⁺)、磷酸根离子(PO₄ ^3－)、铵离子(NH₄ ⁺)、硫酸根离子(SO₄ ^2－)和镁离子(Mg²⁺)中的一种以上离子作为构成成分。通过这样，可以得到高品质的聚合物，可以更廉价并且高效地生产D－乳酸。需要说明的是，在培养开始时的无机盐培养基中，上述无机电解质的含量优选合计为11g/L以下，优选0～11g/L的范围。另外，对于下限值，优选为0g/L以上。

在无机盐培养基中含有K⁺作为构成成分时，使用的无机电解质没有特别限定，例如，可以选择使用选自磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、氢氧化钾(KOH)、磷酸三钾(K₃PO₄)和硫酸钾(K₂SO₄)中的至少一种以上。另外，无机盐培养基中的K⁺含量优选为5～50mmol/L，更优选为15～25mmol/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，K⁺含量优选为5mmol/L以上，更优选为5.8mmol/L以上，进一步优选为15mmol/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，K⁺含量的上限值优选为73mmol/L以下，更优选为50mmol/L以下，进一步优选为25mmol/L以下。

在无机盐培养基中含有PO₄ ^3－作为构成成分时，使用的无机电解质没有特别限定，例如，可以选择使用选自磷酸(H₃PO₄)、磷酸二氢铵(NH₄H₂PO₄)、磷酸氢二铵((NH₄)₂HPO₄)、磷酸三铵((NH₄)₃PO₄)、磷酸一氢镁(MgHPO₄)、磷酸镁(Mg₃(PO₄)₂)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、磷酸三钾(K₃PO₄)、磷酸铵镁(MgNH₄PO₄)、磷酸二氢镁(Mg(H₂PO₄)₂)、磷酸一氢镁(MgHPO₄)和磷酸镁(Mg₃(PO₄)₂)中的至少一种以上。无机盐培养基中的PO₄ ^3－含量，优选为2～40mmol/L，更优选为10～30mmol/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，PO₄ ^3－含量优选为2mmol/L以上，更优选为10mmol/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，PO₄ ^3－含量的上限值优选为40mmol/L以下，更优选为30mmol/L以下。

在无机盐培养基中含有NH₄ ⁺作为构成成分时，使用的无机电解质没有特别限定，例如，可以选择使用选自磷酸二氢铵(NH₄H₂PO₄)、磷酸氢二铵((NH₄)₂HPO₄)、磷酸铵((NH₄)₃PO₄)、磷酸铵镁(MgNH₄PO4)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和磷酸氢铵钾(NH₄KHPO₄)中的至少一种以上。无机盐培养基中的NH₄ ⁺含量，优选为20～120mmol/L，更优选为40～80mmol/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，NH₄ ⁺含量优选为20mmol/L以上，更优选为40mmol/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，NH₄ ⁺含量的上限值优选为120mmol/L以下，更优选为80mmol/L以下。

在无机盐培养基中含有SO₄ ^2－作为构成成分时，使用的无机电解质没有特别限定，例如，可以选择使用选自硫酸钾(K₂SO₄)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和硫酸镁(MgSO₄)中的至少一种以上。无机盐培养基中的SO₄ ^2－含量，优选为10～50mmol/L，更优选为20～40mmol/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，SO₄ ^2－含量优选为10mmol/L以上，更优选为20mmol/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，SO₄ ^2－含量的上限值优选为50mmol/L以下，更优选为40mmol/L以下。

在无机盐培养基中含有Mg²⁺作为构成成分时，使用的无机电解质没有特别限定，例如，可以选择使用选自磷酸氢镁(MgHPO₄)、磷酸二氢镁(Mg(H₂PO₄)₂)、磷酸镁(Mg₃(PO₄)₂)、磷酸铵镁(MgNH₄PO₄)和硫酸镁(MgSO₄)中的至少一种以上。无机盐培养基中的Mg²⁺含量，优选为0.2～2mmol/L，更优选为0.5～1.4mmol/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，Mg²⁺含量优选为0.2mmol/L以上，更优选为0.5mmol/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，Mg²⁺含量的上限值优选为2mmol/L以下，更优选为1.4mmol/L以下。

另外，本实施方式中的“无机盐培养基”还可以含有硫胺素、过渡金属离子。当无机盐培养基中含有硫胺素、过渡金属离子时，从廉价并且高效地生产D－乳酸的观点考虑，优选至少满足上述(c)或上述(d)中的任一方，从更简便地进行纯化的观点考虑，进一步优选满足上述(c)和上述(d)两方。

在培养开始时的无机盐培养基中，硫胺素含量优选为0.1mg/L以下，更优选为0.02mg/L以下。进而，作为无机盐培养基，更优选使用不含硫胺素的培养基。因此，在培养开始时的无机盐培养基中，硫胺素含量优选为0～0.1mg/L，更优选为0～0.02mg/L。另外，对于下限值，优选为0mg/L以上。

另外，过渡金属离子没有特别限定，例如，可以使用选自铁离子、钴离子、铜离子、锌离子和钼酸根离子中的至少一种以上离子。并且，在培养开始时的无机盐培养基中，过渡金属离子的含量优选为10mg/L以下，更优选为0.85mg/L以下。进而，作为无机盐培养基，优选使用实质上不含过渡金属离子的培养基。因此，无机盐培养基中过渡金属离子的含量优选为0～10mg/L，更优选为0～0.85mg/L。

另外，在本实施方式的D－乳酸的生产方法中，培养开始时的无机盐培养基优选进一步满足下述(e)。通过这样，可以得到更高品质的聚合物，可以更廉价并且高效地生产D－乳酸。

(e)无机盐培养基中过渡金属离子的含量为0.85mg/L以下。

另外，本实施方式中的“无机盐培养基”优选为将无机电解质溶解或混悬于水中而制备的液体。通过向将该无机电解质溶解或混悬于水中而制备的液体中加入碳源，可以以碳源作为原料通过发酵生产D－乳酸。另外，作为碳源使用的发酵性的糖，没有特别限定，例如，可以列举选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麦芽糖、蜜二糖酸、乳糖、麦芽三糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、岩藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N－乙酰葡糖胺中的一种以上的化合物。另外，还可以使用淀粉水解物、草木质分解产物、纤维素水解物等作为发酵性的糖(碳源)。考虑到高浓度的糖阻碍微生物的生长，培养开始时无机盐培养基中的糖含量以葡萄糖换算，相对于无机盐培养基的总质量优选为200g/L以下，更优选为150g/L以下。培养开始时无机盐培养基中的糖含量的下限优选为20g/L以上，更优选为50g/L以上。基于以上观点，在培养开始时无机盐培养基中的糖含量优选为20～200g/L，更优选为50～150g/L。

在本实施方式的“无机盐培养基”中，可以进一步含有甜菜碱。此处，本实施方式中的甜菜碱是CAS登记号107－43－7的化合物，也是作为三甲基甘氨酸、甘氨酸甜菜碱的名称已知的化合物。通过使用进一步含有该甜菜碱作为构成成分的无机盐培养基，生产D－乳酸的大肠杆菌可以进行良好的D－乳酸的发酵生产，因此优选。像这样，在无机盐培养基含有甜菜碱时，其含量在无机盐培养基中优选为0.01～5mmol/L，更优选为0.3～2mmol/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，甜菜碱含量优选为0.01mmol/L以上，更优选为0.3mmol/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，甜菜碱含量的上限值优选为5mmol/L以下，更优选为2mmol/L以下。

另外，在本实施方式的“无机盐培养基”中，还可以含有消泡剂。作为消泡剂，可以适当地使用已知的任何消泡剂。例如，可以列举ADEKANOL LG126(商品名，ADEKA公司制)等。相对于无机盐培养基的总质量，消泡剂的含量优选为0.01～1g/L，更优选为0.05～0.5g/L。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，消泡剂的含量优选为0.01g/L以上，更优选为0.05g/L以上。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，在培养开始时的无机盐培养基中，消泡剂含量的上限值优选为1g/L以下，更优选为0.5g/L以下。

在本实施方式中，在发酵生产D－乳酸时，在无机盐培养基中培养的菌体只要是具有由碳源、优选糖发酵生产D－乳酸的能力的生产D－乳酸的大肠杆菌，就没有特别限制，但作为生产D－乳酸的大肠杆菌，优选使用下述重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌中，通过基因重组使与对象大肠杆菌的乳酸生产活性相关的酶活性增加，或失活、活性降低，或通过它们的组合，提高了D－乳酸生产活性和/或D－乳酸光学纯度。

关于本实施方式中“通过基因重组”的用语，只要是相对于原本基因的碱基序列插入其他的DNA，或者通过基因的某些部分的取代、缺失或它们的组合而使碱基序列上产生变化，则全部包含在内，例如，可以是由产生突变的结果得到的。作为提高了D－乳酸生产活性和/或D－乳酸光学纯度的重组大肠杆菌，例如，可以列举WO2005/033324、WO2010/032697、WO2010/032698记载的重组大肠杆菌等。

具体而言，生产D－乳酸的大肠杆菌优选为包含选自下述(i)～(v)中的一种以上基因重组的重组大肠杆菌，更优选包含(i)～(iii)的全部的基因重组的重组大肠杆菌。这样进行基因重组得到的重组大肠杆菌，在通气条件下生产D－乳酸时，与ldhA的表达未增强的情况相比，D－乳酸的蓄积量提高，杂质丙酮酸的浓度减少，同时能够提高D－乳酸的光学纯度。

(i)使大肠杆菌本来具有的FAD依赖性D－乳酸脱氢酶(Dld)活性失活或降低的基因重组

(ii)使大肠杆菌本来具有的丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性失活或降低的基因重组

(iii)增强来自大肠杆菌的NADH依赖性D－乳酸脱氢酶(LdhA)活性的基因重组

(iv)使大肠杆菌本来具有的苹果酸脱氢酶(Mdh)活性失活或降低的基因重组

(v)使大肠杆菌本来具有的天冬氨酸氨裂合酶(AspA)活性失活或降低的基因重组

(i)的Dld是指在作为辅酶的氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下，催化由D－乳酸生成丙酮酸的反应的酶的总称。

(ii)的Pfl是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被分类为酶编号2.3.1.54、并且也被称为甲酸乙酰基转移酶的酶。该酶是指可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反应的酶的总称。

(iii)的LdhA是指由丙酮酸和NADH生成D－乳酸和NAD的来自于大肠杆菌的酶。

(iv)的Mdh是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被分类为酶编号1.1.1.37，在作为辅酶的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可逆地催化由苹果酸生成草酰乙酸的反应的酶的总称。

(v)的AspA是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被分类为酶编号4.3.1.1、并且也被称为天冬氨酸酶的酶。该酶是指可逆地催化由L－天冬氨酸生成富马酸的反应的酶的总称。

关于上述(iii)的基因重组，可以列举以下方法：将编码LdhA的基因在与控制和糖酵解体系、核酸生物合成体系或氨基酸生物合成体系相关的蛋白质表达的基因的启动子连接的状态下并入到表达质粒中，再将该表达质粒导入大肠杆菌的方法；通过使用控制与糖酵解体系、核酸生物合成体系或氨基酸生物合成体系相关的蛋白质表达的基因的启动子，由大肠杆菌基因组中存在的编码来自于大肠杆菌的LdhA的基因表达LdhA的方法，并优选通过使用控制与糖酵解体系、核酸生物合成体系或氨基酸生物合成体系相关的蛋白质表达的基因的启动子，由大肠杆菌基因组中存在的编码LdhA的基因表达LdhA的方法。

此处，控制与糖酵解体系、核酸生物合成体系或氨基酸生物合成体系相关的蛋白质表达的基因的启动子，是指恒定性地在细菌内、优选在大肠杆菌内发挥作用的强启动子、并且即使在葡萄糖存在下其表达也不易受抑制的启动子。具体而言，作为控制与糖酵解体系、核酸生物合成体系或氨基酸生物合成体系相关的蛋白质表达的基因的启动子，可以列举甘油醛－3－磷酸脱氢酶的启动子、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)启动子等。

另外，生产D－乳酸的大肠杆菌中，选自由蔗糖非PTS基因群和FruK构成的组中的至少一个可以被增强，优选蔗糖非PTS基因群和FruK双方均被增强，更优选蔗糖非PTS基因群中的仅cscA和FruK一同被增强。

蔗糖水解酶(蔗糖酶，CscA)是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被分类为酶编号3.2.1.26，催化由蔗糖生成D－葡萄糖和D－果糖的反应的酶的总称。对于CscA的增强，例如可以通过将具有编码来自于大肠杆菌的CscA的基因的碱基序列的DNA导入大肠杆菌而实现。

果糖－1－磷酸激酶(FruK)是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被分类为酶编号2.7.1.56、并且也被称为磷酸果糖激酶1的酶。对于FruK的增强，例如可以通过将具有编码来自于大肠杆菌的FruK的基因的碱基序列的DNA导入大肠杆菌而实现。

本实施方式的D－乳酸的生产方法，包括使用生产D－乳酸的大肠杆菌，从碳源、优选从糖生产D－乳酸。即，包括使生产D－乳酸的大肠杆菌与碳源接触的工序，和回收通过接触得到的D－乳酸的工序。

具体而言，本实施方式的D－乳酸的生产方法包括：在无机盐培养基中使生产D－乳酸的大肠杆菌与碳源接触，得到D－乳酸盐的工序；和从含有D－乳酸盐的无机盐培养基中除去生产D－乳酸的大肠杆菌后，将D－乳酸盐脱盐，得到D－乳酸的工序。

另外，对于本实施方式的D－乳酸的生产方法，可以在得到上述D－乳酸盐的工序中，得到D－乳酸的碱土金属盐，然后在得到D－乳酸的工序中，通过将D－乳酸的碱土金属盐脱盐，使含有碱土金属的无机盐析出，也可以在得到D－乳酸盐的工序中，得到D－乳酸的碱金属盐，然后在得到D－乳酸的工序中，通过电渗析处理将D－乳酸的碱金属盐脱盐。

另外，本实施方式的D－乳酸的生产方法，进一步包括在将D－乳酸盐脱盐得到D－乳酸的工序后，进行D－乳酸纯化的纯化工序，在纯化工序中，优选一边水解一边进行蒸馏。通过这样，可以进一步提高蒸馏工序的D－乳酸回收率，可以更廉价并且高效地生产D－乳酸。

生产D－乳酸的大肠杆菌与碳源的接触，通过在上述无机盐培养基中培养生产D－乳酸的大肠杆菌而进行，由此可以得到含有D－乳酸的发酵液。

作为生产D－乳酸的大肠杆菌的培养条件，虽然随着使用的大肠杆菌、培养装置而变化，但培养温度优选为20℃以上、40℃以下，更优选为25℃以上、35℃以下。

另外，培养槽的压力在培养时优选为常压(0.1MPa)以上、0.5MPa以下，更优选为常压(0.1MPa)以上、0.2MPa以下。

另外，从提高大肠杆菌的发酵生产力的观点考虑，培养的pH优选可以为4.0以上、9.0以下，更优选为pH6.0以上、8.0以下，进一步优选为pH7.0以上、7.8以下。需要说明的是，对于pH的调整，优选一边生产D－乳酸、一边向培养槽中添加无机碱而进行。由此，可以用无机碱中和生产出的D－乳酸，形成乳酸盐。

作为无机碱，例如，可以使用选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铷等碱金属盐、氢氧化镁、氢氧化钙和氢氧化钡等碱土金属盐，以及氨中的至少一种。另外，通过选择无机碱的种类而对应于生产的D－乳酸的乳酸盐的抗衡离子，可以为锂离子、钠离子、钾离子、铷离子、镁离子、钙离子、钡离子、铵离子等任意的阳离子。

培养时间没有特别限定，只要是菌体充分增殖、并且生成D－乳酸所需要的时间即可。

一般情况下，培养时通常使用能够控制温度、pH、通气条件、搅拌速度、压力的培养槽，但在本实施方式的培养时并不限定于使用培养槽。需要说明的是，在使用培养槽培养时，需要将大肠杆菌接种到培养槽内的培养基中，但接种的量没有特别限定，对于使用的大肠杆菌，也可以使其在琼脂培养基中形成菌落，并通过铂环等将该菌落直接接种到培养槽中。

另外，也可以配制在烧瓶或其他培养槽等容器中进行了预培养的培养液，将其以必要量接种到培养槽内的培养基中。这时培养液的必要量没有特别限制，只要是将大肠杆菌以至少1个细胞接种到培养槽内的培养基中的量即可。具体而言，培养液的量优选为相当于培养槽内培养基液量的0.01％～40％的量，更优选为相当于0.1％～10％的量。另外，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，培养液的必要量优选为相当于0.01％以上的量，更优选为相当于0.1％以上的量。另一方面，从更高效地生产D－乳酸的观点考虑，培养液必要量的上限值优选为相当于40％以下的量，更优选为相当于10％以下的量。

另外，从乳酸生产效率的观点考虑，发酵工序中的通气量只要为0vvm以上即可，优选为0.001vvm以上，更优选为0.01vvm以上。另一方面，从乳酸生产效率的观点考虑，发酵工序中的通气量只要为5vvm以下即可，优选为2vvm以下，更优选为1vvm以下。

需要说明的是，本实施方式中的通气量，有时使用vvm的表述。本说明书中所谓的“vvm”，表示在1分钟内进行液体容量多少倍的通气，例如，相对于10L的发酵液进行5vvm的通气，是指每分钟进行50L的通气。

在向液体中通气时，由于根据内压、搅拌叶位置、搅拌叶形状、搅拌速度的组合，氧气在液体中的溶入速度发生变化，因此可以以D－乳酸的生产率以及除D－乳酸之外的有机酸量等为指标，设定各种条件。需要说明的是，设定的通气条件不需要从发酵初期到结束一直维持，即使在发酵工序的一部分中维持该条件，也能够得到优选的结果。通过如上所述进行通气，可以实现D－乳酸生产率的提高、D－乳酸以外的有机酸量的削减。

另外，从乳酸生产率的观点考虑，氧摄取速度(OUR)优选为0.0mmol/L/hr以上，更优选为1.0mmol/L/hr以上。另一方面，从乳酸生产率的观点考虑，氧摄取速度(OUR)的上限值优选为100.0mmol/L/hr以下，更优选为50.0mmol/L/hr以下，进一步优选为10.0mmol/L/hr以下，更进一步优选为5.0mmol/L/hr以下。

需要说明的是，关于OUR，只要在D－乳酸的生产期进行测定即可。此处，D－乳酸的生产期是指发酵开始后，经过大肠杆菌培养的适应期，大肠杆菌开始增殖并且生产D－乳酸的时期。另外，在将大肠杆菌的培养和乳酸生产分开实施时，是指乳酸生产工序。

在本实施方式中，所谓氧摄取速度(OUR)，是指每单位容积发酵液中的氧移动速度，即也可以说是大肠杆菌的氧摄取速度。OUR使用通过排气分析法由下式1求出的值。

(式1)

OUR＝7.22×10⁶/VL×(QiPiyi/Ti－QoPoyo/To)

VL：发酵槽中的液量(L)

Qi和Qo：空气入口和出口处的空气流量(L/min)

Pi和Po：空气入口和出口处的空气压(MPa)

Ti和To：空气入口和出口处的绝对温度(K)

yi和yo：空气入口和出口处的氧的摩尔分率

需要说明的是，在基于上述式1求出OUR时，当空气流量、空气压、绝对温度的值在空气入口和出口处的差异为可以忽略的程度时，也可以适用在1个位置的测定值。另外，本实施方式中所述的压力和空气压是指绝对压力。

OUR随着通气量、搅拌旋转速度、温度、压力、pH等而变化。因此，为了将OUR调整至上述范围内，只要适当调整通气流量、搅拌旋转速度等即可。

另外，上述OUR也可以换算为其他指标。作为该其他指标，可以列举液膜容量系数(K_La)。液膜容量系数(K_La)是通气量·搅拌旋转速度的函数，已知为以下关系(式2，Richards，J.W.1961，Prog.Ind.Micro.3，143－172)

(式2)

k_La∝(P_g/V)^0.4Vs^0.5N^0.5

P_g：通气搅拌槽的消耗动力

V：充满槽中的液量

V_S：表观的空气线速度(通气量/槽截面积)

N：搅拌旋转速度

图1表示在生产D－乳酸的大肠杆菌的培养中使用的发酵装置的一个例子。在发酵装置10中设置有发酵槽12。在该发酵槽12中，通过质量流量计14由空气入口供给空气(箭头A)，另一方面，通过冷凝器16将槽内的空气由排气口排出(箭头B)。在冷凝器16和排气口之间连接有槽内压力计18和排气分析计20，分别能够测定槽内的压力和出口的氧摩尔分压。在发酵槽12中，分别配置有温度传感器22、DO传感器24和pH传感器26，能够测定发酵槽12内的反应液中的温度、DO(溶解氧)和pH。另外，在发酵槽12中配置有作为搅拌机的盘式涡轮搅拌桨28，盘式涡轮搅拌桨28通过电动机44进行搅拌·控制。

另外，发酵槽12的周围是双层的，可以通过温水进行加热或冷却。在发酵槽12的外侧设置有填充了pH调节剂的pH调节部34。pH调节部34通过泵36从而能够向发酵槽12中供给pH调节剂。作为pH调节剂，可以使用前述的无机碱。

在发酵槽12中具备控制整体的控制器38，该控制器38与温度传感器22、DO传感器24和pH传感器26连接，能够输入来自各个传感器的信息。另外，控制器38根据来自各种传感器的信息，调节封套32的温度，控制发酵槽内的溶液温度，同时通过泵36的动作进行pH控制。

蓄积在发酵槽12中的D－乳酸，可以通过从无机盐培养基中分离·纯化而回收。具体而言，是从无机盐培养基中除去菌体等固体物质、脱盐、浓缩、纯化等工序，但其方法、顺序没有特别限制，但优选从发酵后的无机盐培养基中除去生产D－乳酸的大肠杆菌后，对D－乳酸盐进行脱盐，得到D－乳酸。

例如，对于菌体等固体物质的除去，可以列举离心分离、过滤等方法。

在纯化工序中，由D－乳酸盐转变为D－乳酸的方法，可以列举离子交换柱、电渗析等。也可以通过添加无机酸而脱盐为D－乳酸。例如，在D－乳酸盐的抗衡离子为碱土金属离子时，通过对D－乳酸盐进行脱盐，可以析出含有碱土金属的无机盐。例如，当D－乳酸盐的抗衡离子为钙离子时，通过添加硫酸，使硫酸钙析出到溶液中而脱盐，可以得到D－乳酸。

另外，当D－乳酸盐的抗衡离子为碱金属离子、优选钠离子或钾离子时，优选通过电渗析处理使D－乳酸盐脱盐。在电渗析处理中，可以使用水解电渗析装置。该装置是交替排列双极膜和阳离子交换膜，形成酸室和碱室的电渗析装置。作为其代表，可以列举“二室式水解电渗析装置”。在本实施方式中，将使用“水解电渗析装置”的电渗析操作定义为“水解电渗析工序”。并且，作为更具体的处理，代表性地可以举出“二室式水解电渗析工序”。

在水解电渗析工序中，对于得到的含有D－乳酸盐的发酵液，使用水解电渗析装置进行水解电渗析工序，分别回收D－乳酸和碱。也就是说，在使用双极膜和阳离子交换膜的水解电渗析装置中，供给D－乳酸盐溶液，进行水解电渗析工序，分别由酸室得到D－乳酸，由碱室得到碱。

作为双极膜，可以使用以往已知的双极膜，即具有将阳离子交换膜和阴离子交换膜贴合在一起的结构的已知的双极膜。另外，作为水解电渗析装置的阳离子交换膜，可以使用已知的阳离子交换膜。

图2表示在本实施方式中使用的水解电渗析装置的代表性方式的简图。即，在图2中，水解电渗析装置在阳极3和阴极4之间交替排列作为膜的双极膜B和阳离子交换膜C这两种膜，形成酸室8和碱室7两个室。在阳离子交换膜C和阳极3的空隙(阳极室5)以及阳离子交换膜C和阴极4的空隙(阴极室6)之间充满了电极液。此处，在双极膜B的阴离子交换体侧与阳离子交换膜C之间的室形成碱室7，在双极膜B的阳离子交换体侧与阳离子交换膜C之间的室形成酸室8。

上述水解电渗析装置的结构采用已知结构。

在本实施方式的D－乳酸的生产方法中，使用上述水解电渗析装置的水解电渗析工序优选采用下述方法：设置向酸室8、碱室7的各个室供给液体的外部槽(未图示)，一边在各个室和外部槽之间进行液体循环，一边进行电渗析的方法。

如上所述，在向酸室8中供给D－乳酸盐溶液进行电渗析时，酸室8中的D－乳酸盐在通电的同时转变为D－乳酸。即，被导入到酸室8中的D－乳酸盐的阳离子，透过阳离子交换膜C向碱室7移动，这时，与由双极膜B生成的OH离子结合形成碱。另外，在酸室8中由双极膜B生成的质子与D－乳酸阴离子结合形成非解离性的D－乳酸，就那样地留在酸室8中。

在本实施方式中，水解电渗析工序时各种液体的温度通常为5℃以上70℃以下，优选为20℃以上50℃以下。

如上所述，通过水解电渗析工序，可以分解D－乳酸盐，将D－乳酸和碱分离，回收D－乳酸。需要说明的是，分离的碱可以作为在D－乳酸等有机酸发酵中的中和剂进行再利用。

通过上述水解电渗析工序，可以得到纯度高的D－乳酸。

在浓缩和纯化工序中，例如，对于蛋白质、副产物有机酸等杂质的除去，可以列举活性炭处理、NF膜处理，对于离子性物质的除去，可以列举离子交换柱、阴离子/阳离子交换膜电渗析，对于利用蒸发的浓缩、纯化以及乳酸的回收，可以列举在脱盐后直接蒸馏的方法、水蒸气蒸馏的方法、形成丙交酯等进行蒸馏的方法、加入醇和催化剂进行酯化后蒸馏的方法、在有机溶剂中进行提取的方法、用色谱柱进行分离的方法、用离子交换柱进行分离的方法、通过阴离子/阳离子交换膜电渗析进行浓缩和回收的方法、通过晶析进行结晶化的方法。另外，这些方法还可以以任意的顺序进行适当地组合。

例如，优选对脱盐后得到的D－乳酸溶液进行活性炭处理。由此，可以除去着色成分，得到适合于聚合物化的用途的D－乳酸。活性炭处理可以如下实行，例如，添加相对于D－乳酸溶液的重量而言为0.2重量％以上、2重量％以下的活性炭，根据需要进行搅拌后，通过过滤除去活性炭。在以水的400nm的光透射率为100％时，活性炭处理后的D－乳酸溶液的400nm的光透射率可以为80％以上、99％以下。

另外，例如，在对脱盐后得到的D－乳酸溶液间歇或连续地进行蒸馏时，优选一边加水进行水解一边蒸馏。由此，可以抑制釜内液体的聚合，提高蒸馏收率。聚合度n优选为1以上、4以下，更优选为1以上、2以下，进一步优选为1以上、1.5以下。这时的蒸馏收率可以为70重量％以上、99.5重量％以下。此处所述的蒸馏收率是蒸馏工序中乳酸成分的回收率，所谓乳酸成分是指乳酸和乳酸低聚物。

另外，例如，在蒸发浓缩工序中进行聚合时，在蒸馏前事先进行水解、降低乳酸的聚合度n，对于蒸馏收率的提高也是有效的。

此处，本实施方式的聚合物的生产方法是使用通过本实施方式的D－乳酸的生产方法得到的D－乳酸进行聚合反应。以下，进行详细说明。

通过以在本实施方式的D－乳酸的生产方法中得到的D－乳酸作为原料进行聚合物聚合，可以得到着色少，高分子量的聚合物(聚乳酸、乳酸共聚物)。此处所述的聚乳酸，包括D－乳酸和L－乳酸的立构复合型聚合物和D－乳酸的均聚物。作为D－乳酸和L－乳酸的立构复合型聚合物的原料之一的L－乳酸，可以合适地使用已知的材料。L－乳酸的制法没有特别限定，例如，可以列举发酵法、有机合成法等。这些聚乳酸、乳酸共聚物可以用于通过各种成型加工方法进行加工的各种用途，所述成型加工方法例如为注射成型、膜成型、片材成型、挤出成型、吹塑成型、发泡成型等。作为用途，例如，可以列举利用生物分解性塑料的特性、耐热性等的包装容器、缓冲材料、各种电子·电气设备、办公设备、车辆部件、机械部件、其他农业材料、渔业材料、搬运容器、游戏用具和杂货等。

在本实施方式的聚乳酸的生产方法中，聚合的方法没有特别限定，可以采用已知的方法。例如，可以列举以下聚合方法：经由乳酸丙交酯的开环聚合；将乳酸、乳酸酯直接聚合的缩聚；将乳酸、乳酸酯直接聚合得到的低聚物通过多异氰酸酯等经由酰胺键、氨基甲酸酯键等进行扩链的聚合方法等。另外，作为聚合的形式，可以列举固相聚合、熔融聚合等。

在本实施方式的乳酸共聚物的生产方法中，排列顺序、聚合方法没有特别限定，可以采用已知的方法。例如，在排列顺序中，可以列举无规共聚、交替共聚、嵌段共聚、接枝共聚等，另外，在聚合方法中，可以列举自由基共聚、离子共聚、共缩合等。

这种通过本实施方式的方法得到的D－乳酸可以用于聚乳酸的制造。得到的聚乳酸的重均分子量(Mw)优选为5万以上、40万以下，更优选为8万以上、30万以下。

此处，聚合物的分子量分布通常用Mw/Mn表示，在聚乳酸等的缩聚反应中，一般来说，在临近反应结束时，分子量分布接近2(参见冈村诚三著高分子化学序论第2版p.210)。已知分子量分布会大大影响聚合物的流动性、机械性质，如果分子量分布变宽，即，Mw/Mn的值变大，则非牛顿特性变大，流动性提高，因此在成型加工的工序中树脂容易成型。由通过本实施方式的方法得到的D－乳酸制造的聚乳酸、乳酸共聚物，其分子量分布比一般的缩聚系聚合物更宽，其范围优选可以为3以上、20以下，更优选为5以上、15以下，进一步优选为8以上、12以下，具有容易成型的特性。进而，通过本实施方式的方法得到的D－乳酸，即使不经过大量的活性炭处理、复杂的纯化工序，也可以制造分子量分布宽的聚乳酸、乳酸共聚物。例如，在活性炭处理中，用0.2重量％以上、2重量％以下的少量活性炭进行处理，也可以制造分子量分布宽的聚乳酸、乳酸共聚物。

另外，由通过本实施方式的方法得到的D－乳酸制造的聚乳酸、乳酸共聚物的着色度(YI值)，YI值优选可以为10以下，更优选为5以下。

需要说明的是，此处所述的YI值，是以理想中的白色(完全漫反射面)作为0，表示与该白色的差距，并且从白色向黄色方向的色差用正数表示，向蓝色方向的色差用负数表示。因此，如果负数的值增大，则蓝色增加，如果正数的值增大，则黄色增加，两者均为色调变差的原因。

在作为颜色三原色的红、绿、蓝中，如果X为主要感觉到红色的值，Y为感觉到绿色的值，Z为感觉到蓝色的值，则YI值使用色差计(例如，岛津制作所紫外－可见分光光度计UV－2400PC)测定三个刺激值X、Y、Z，由式3算出。

YI值＝100×(1.28X－1.06Z)/Y (式3)

根据本实施方式的方法，可以提供一种更廉价并且高效地生产D－乳酸单体的方法，所述D－乳酸单体能够聚合成与色调、分子量等D－乳酸聚合物所要求的品质相符的D－乳酸聚合物。另外，可以提供一种在工业上的大量生产中，进一步削减了常常会出问题的废弃物、废盐的D－乳酸单体制造方法。

以上，对本发明的实施方式进行了说明，但这些都是本发明的例示，也可以采用上述以外的各种构成。

实施例

以下，通过实施例详细说明本发明。但本发明并不受这些实施例的任何限定。只要没有特别说明，则得到的D－乳酸的光学纯度均为100％ee。光学纯度使用HPLC通过常规方法测定(柱：SUMICHIRAL OA－5000(住化分析中心公司制)、洗脱液：含有异丙醇10g/L和无水硫酸铜(II)319.2mg/L的水溶液，检测波长：254nm)。

(制造例1)

与WO2005/033324的实施例23记载的方法同样地制作大肠杆菌株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/GAPldhA基因组插入株。

具体而言，通过以下方法，制作大肠杆菌株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/GAPldhA基因组插入株。

<制造1：大肠杆菌dld基因附近区域的克隆>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是已知的(GenBank登录号U00096)，编码大肠杆菌的FAD依赖性D－乳酸脱氢酶的基因(以下，有时简称为dld)的碱基序列也已被报道(Genbank登录号M10038)。

通过Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)记载的方法制备大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，使用得到的基因组DNA以及基于来自MG1655株的基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息制作的CAACACCAAGCTTTCGCG(序列号1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列号2)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列号3)和TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列号4)进行PCR。对于得到的片段，分别用限制酶HindIII和PstI、PstI和XbaI进行消化，由此分别得到约1140bp的片段。将该片段与使用HindIII、XbaI消化温度敏感性质粒pTH18cs1(Hashimoto－Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，pp185－191(2000))得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上进行培养，得到生长的转化体。将所得的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了目标dld基因附近区域的序列被插入。将该质粒命名为pTHΔdld。

<制造2：大肠杆菌MG1655株dld基因缺失株的制作>

将上述制造1中得到的质粒pTHΔdld转化到MG1655株中，得到于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长的转化体。将得到的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着将这些培养菌体涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长的菌落。

再重复一次得到在42℃下生长的单菌落的操作。

接着，将上述克隆接种到LB液体培养基(3ml/试管)中，在30℃下振荡培养3～4小时。将其适当稀释(10^－2～10^－6左右)以得到单菌落，并涂布在LB琼脂板上，在42℃下培养一夜，得到菌落。从出现的菌落中随机挑选100个菌落，使其分别在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长，选出只在LB琼脂板上生长的氯霉素敏感性克隆体。进而，通过PCR，从这些目标克隆体的染色体DNA选择dld基因区域缺失的株，将满足以上条件的克隆体作为dld缺失株，将得到的株命名为MG1655Δdld株。

需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可以从作为细胞·微生物·基因库的美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection)获得。

<制造3：大肠杆菌pfl基因附近区域的克隆>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是已知的(GenBank登录号U00096)，编码大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶(以下，有时称为pfl)的基因的碱基序列也已被报道(Genbank登录号AE000192)。为了对编码pfl的基因的碱基序列附近区域进行克隆，合成了4种序列号5、6、7和8所示的寡核苷酸引物。序列号6、7的引物在5’末端侧具有SphI识别位点。

通过Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)记载的方法制备大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，并利用得到的基因组DNA、以及具有序列号5的碱基序列的引物、具有序列号6的碱基序列的引物、具有序列号7的碱基序列的引物和具有序列号8的碱基序列的引物的组合，在通常的条件下进行PCR，由此扩增出约1.8kbp(以下有时称为pflB－L片段)及约1.3kbp(以下有时称为pflB－R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收该DNA片段，分别用HindIII和SphI消化pflB－L片段，用SphI和PstI消化pflB－R片段。利用T4DNA连接酶使该2种消化片段和温度敏感性质粒pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)(Hashimoto－Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，pp185－191(2000))的HindIII及PstI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上进行培养，得到生长的转化体。将所得的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的编码pflB的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段被插入。将该质粒命名为pTHΔpfl。

<制造4：大肠杆菌MG1655pfl、dld基因缺失株的制作>

将上述制造3中得到的质粒pTHΔpfl转化到MG1655Δdld株中，得到在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长的转化体。与上述制造2同样地对得到的转化体进行培养、选择，最终进行pfl基因缺失株的选择，由此获得pfl基因被破坏的MG1655Δdld株，将该株命名为MG1655ΔpflΔdld株。

<制造5：大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdh株的制作>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是已知的(GenBank登录号U00096)，大肠杆菌的mdh基因的碱基序列也已被报道(Genbank登录号AE000403)。为了对编码mdh的基因的碱基序列附近区域进行克隆，合成了4种序列号9、10、11和12所示的寡核苷酸引物。具有序列号9的碱基序列的引物在5’末端侧具有KpnI识别位点，具有序列号10、11的碱基序列的引物在5’末端侧具有BamHI识别位点，具有序列号12的碱基序列的引物在5’末端侧具有XbaI识别位点。

通过Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)记载的方法制备大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，并利用得到的基因组DNA、以及序列号9和序列号10、序列号11和序列号12的组合，在通常的条件下进行PCR，由此扩增出约800bp(以下有时称为mdh－L片段)及约1,000bp(以下有时称为mdh－R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收该DNA片段，分别用KpnI和BamHI消化mdh－L片段，用BamHI和XbaI消化mdh－R片段。利用T4DNA连接酶，使上述2种消化片段、和温度敏感性质粒pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)(Hashimoto－Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，pp185－191(2000))的KpnI和XbaI消化物进行反应，之后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上培养，得到生长的转化体。将所得的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的编码mdh的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段被插入。将该质粒命名为pTHΔmdh。

将质粒pTHΔmdh转化到MG1655ΔpflΔdld中，与上述制造2同样地进行培养、选择，最终进行mdh基因缺失株的选择，获得mdh基因被破坏的MG1655ΔpflΔdld株，将该株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdh株。

<制造6：大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株的制作>

大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是已知的(GenBank登录号U00096)，大肠杆菌的aspA基因的碱基序列也已被报道(Genbank登录号AE000486)。为了对编码aspA的基因的碱基序列附近区域进行克隆，合成了4种序列号13、14、15和16所示的寡核苷酸引物。

通过大肠杆菌MG1655株的基因组DNA、以及序列号13和序列号14、序列号15和序列号16的组合，在通常的条件下进行PCR，由此扩增约910bp(以下有时称为aspA－L片段)和约1,100bp(以下有时称为aspA－R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收该DNA片段。由于序列号14和序列号15包含互补的区域，因此将aspA－L片段和aspA－R片段混合，通过在不使用引物的情况下进行PCR反应，能够连接aspA－L片段和aspA－R片段。基于此，连接aspA－L片段和aspA－R片段，并利用琼脂糖电泳进行分离、回收。用DNA Blunting Kit(宝生物)将得到的DNA片段的末端平滑化后，使用T4多聚核苷酸激酶并通过常规方法将5’末端磷酸化。另一方面，对于温度敏感性质粒pTH18cs1，在SmaI消化后，用碱性磷酸酶进行脱磷酸化处理。用T4DNA连接酶使上述经磷酸化的2种片段和经脱磷酸化的质粒反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上培养，得到生长的转化体。将所得的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的编码aspA的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段被插入。将该质粒命名为pTHΔasp。

将质粒pTHΔasp转化到大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdh株中，与上述制造2同样地进行培养、选择，最终进行aspA基因缺失株的选择，获得aspA基因被破坏的MG1655ΔpflΔdldΔmdh株，将该株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株。

<制造7：将大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株的基因组上ldhA启动子替换为GAPDH启动子>

大肠杆菌的ldhA基因的碱基序列已经被报道(GenBank登录号U36928)。为了获得甘油醛3－磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列号17)以及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号18)，通过PCR法进行扩增，用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段，由此得到约100bp的编码GAPDH启动子的片段。

另外，大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是已知的(GenBank登录号U00096)，大肠杆菌的ldhA基因的碱基序列也已被报道(Genbank登录号U36928)。为了获得D－乳酸脱氢酶基因(ldhA)，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(序列号19)以及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列号20)，通过PCR法进行扩增，用限制酶EcoRI和HindIII对所得的DNA片段进行消化，由此得到约1.0kbp的D－乳酸脱氢酶(ldhA)基因片段。将上述2个DNA片段和使用限制酶EcoRI和HindIII消化质粒pUC18所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上生长的转化体。将所得的菌落于30℃在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，作为目标的编码GAPDH启动子和ldhA的基因被插入，得到了预计通过GAPDH启动子来表达ldhA的质粒。将该质粒命名为pGAP－ldhA。

使用基于来自大肠杆菌MG1655株的ldhA基因5’附近区域的基因信息制备的AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列号21)和GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列号22)，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR，由此扩增约1000bp的DNA片段。

另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的甘油醛3－磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子的序列信息制作的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列号23)和基于大肠杆菌MG1655株的ldhA基因的序列信息制作的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列号24)，以之前制作的载体pGAP－ldhA为模板进行PCR，得到由GAPDH启动子和ldhA基因的起始密码子附近区域形成的约850bp的DNA片段。

分别利用限制酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI消化如上所述得到的片段，将该片段与利用KpnI和PstI消化温度敏感性质粒pTH18cs1所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，得到于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长的转化体。将所得的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的编码ldhA的基因的5’上游附近片段以及GAPDH启动子和ldhA基因的起始密码子的附近区域被插入。将该质粒命名为pTHGAPldhA。

将质粒pTHGAPldhA转化到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株中，在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上培养一夜，得到转化体。将所得的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，于30℃培养一夜。接着，将这些菌体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长的菌落。将所得的菌落在30℃下在LB液体培养基中培养一夜，再涂布到LB琼脂板上，得到在42℃下生长的菌落。

从出现的菌落中随机挑选100个菌落，使其分别在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长，选出氯霉素敏感性克隆体。再通过PCR，从这些目标克隆体的染色体DNA，扩增出含有GAPDH启动子和ldhA基因的约800bp片段，选择ldhA启动子区域被替换为GAPDH启动子的株，将满足以上条件的克隆体命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。

[实施例1]利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/GAPldhA插入株的、在无机盐培养基中的D－乳酸生产

作为预培养，向锥形烧瓶中的100ml LB Broth,Miller培养液(Difco244620)中接种在制造例1中制作的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/pGAPldhA株，以120rpm搅拌培养一夜。对加入了475g由表1的组成形成的无机盐培养基的1L容量的培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ－01)进行高压釜灭菌，向其中移入预培养液25ml，进行培养。培养在大气压下，以通气量0.5vvm、搅拌速度300rpm、培养温度35℃、pH7.5(用20wt％氢氧化钙、80wt％纯水的浆料进行pH调节)的条件进行至葡萄糖枯竭。培养结束后，使用HPLC通过常规方法测定所得培养液中的D－乳酸蓄积量(柱：ULTRON PS－80H(信和化工)、洗脱液：高氯酸水溶液(pH＝2.1))。发酵结束时间为18小时，D－乳酸蓄积量为92.7g/L。所谓发酵结束时间，是添加的糖全部被消耗的时间，通过该时长可以评价生产率。

[表1]

表1：培养基组成

(g/L)

葡萄糖	120
		磷酸氢二钾	2
硫酸铵	5
		硫酸镁七水合物	0.25
甜菜碱	0.12
		消泡剂(ADEKA LG126，ADEKA)	0.2
纯水	剩余部分

[实施例2]在无机盐培养基中生产的D－乳酸的粗纯化

为了从实施例1中得到的D－乳酸发酵液中除去菌体，以8000×g进行离心分离。为了将离心分离上清液中的乳酸钙脱盐形成乳酸，添加95重量％硫酸直至上清液的pH为2.5。为了除去析出的硫酸钙，使用滤纸(Watman42)进行抽滤。为了进行脱色和粗纯化，添加滤液重量的0.5重量％份的活性炭，进行搅拌。为了除去活性炭，使用滤纸和0.45μm的膜滤器进行抽滤。以分光光度计中纯水在400nm波长处的透射率为100％时，除去活性炭后的滤液在400nm波长处的透射率为97.7％。

[比较例1]利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株的玉米浆培养基中的D－乳酸生产

作为预培养，向锥形烧瓶中的100ml LB Broth,Miller培养液(Difco244620)中接种在制造例1中制作的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株，以120rpm搅拌培养一夜。将25ml预培养液移入到加入了475g由表2的组成形成的玉米浆培养基的1L容量的培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ－01)中，进行培养。培养在大气压下，以通气量0.5vvm、搅拌速度300rpm、培养温度35℃、pH7.5(用氢氧化钙水溶液进行调节)的条件进行至葡萄糖枯竭。培养结束后，使用HPLC通过常规方法测定所得培养液中的D－乳酸蓄积量。D－乳酸蓄积浓度在20小时为90.7g/L。

[表2]

表2：培养基组成

(g/L)

葡萄糖	120
		玉米浆	50
消泡剂(ADEKA LG126，ADEKA)	0.2
		纯水	剩余部分

[比较例2]在玉米浆培养基中生产的D－乳酸的粗纯化

为了从比较例1中得到的D－乳酸发酵液中除去菌体，以8000×g进行离心分离。为了将离心分离上清液中的乳酸钙脱盐形成乳酸，添加95重量％硫酸直至上清液的pH为2.5。为了除去析出的硫酸钙，使用滤纸(Watman42)进行抽滤。为了进行脱色和粗纯化，添加滤液重量的0.5重量％份或3.0重量％份的活性炭，进行搅拌。为了除去活性炭，使用滤纸和0.45μm的膜滤器进行抽滤，得到粗纯化液。以分光光度计中纯水在400nm波长处的透射率为100％时，除去活性炭后的滤液在400nm波长处的透射率在0.5重量％活性炭时为78.7％，在3.0重量％活性炭时为97.7％。在使用玉米浆培养基的研究中显示，为了得到澄清的D－乳酸溶液，需要比无机盐培养基量多的活性炭。

[实施例3]在添加了过渡金属离子的无机盐培养基中的D－乳酸生产

在实施例1的培养条件下，向培养基中添加0.1体积％表3所示组成的含有过渡金属的水溶液。发酵结束时间、D－乳酸蓄积浓度与未添加含有过渡金属的水溶液的情况相同。

[表3]

表3：含有过渡金属的水溶液的组成

(g/L)

氯化铁四水合物	0.2
		无水硫酸铜(II)	0.04
硫酸锌七水合物	0.4
		钼酸钠二水合物	0.2
硼酸	0.5
		碘化钾	0.1
硫酸锰四水合物	0.2
		纯水	剩余部分

[实施例4]在添加了氯化钙和硫胺素的无机盐培养基中的D－乳酸生产

在实施例1的培养条件下，使用向实施例1的培养基中进一步添加了总共10mg/L的氯化钙和硫胺素而得的培养基，实施培养。发酵结束时间、D－乳酸蓄积浓度，与未添加氯化钙和硫胺素的情况相同。

[实施例5]在添加了过渡金属离子、氯化钙和硫胺素的无机盐培养基中的D－乳酸的生产和D－乳酸的粗纯化

向实施例1的培养基中进一步添加0.1体积％的表3所示组成的含有过渡金属的溶液，再向其中添加总共10mg/L的氯化钙和硫胺素，使用该培养基在实施例1的培养条件下实施培养。发酵结束时间、D－乳酸蓄积浓度与实施例1相同。

为了从得到的D－乳酸发酵液中除去菌体，以8000×g进行离心分离。为了将离心分离上清液中的乳酸钙脱盐形成乳酸，添加95重量％硫酸直至上清液的pH为2.5。为了除去析出的硫酸钙，使用滤纸(Watman42)进行抽滤。为了进行脱色和粗纯化，添加滤液重量的0.5重量％份或1重量％份的活性炭，进行搅拌。为了除去活性炭，使用滤纸和0.45μm的膜滤器进行抽滤。以分光光度计中纯水在400nm波长处的透射率为100％时，除去活性炭后的滤液在400nm波长处的透射率在0.5重量％活性炭时为93.7％，在1.0重量％活性炭时为98.1％。

[实施例6]在改变了甜菜碱含量的无机盐培养基中的D－乳酸的生产

在实施例1的培养条件下，以0～6g/L的含量向培养基中添加甜菜碱。在各个条件下的发酵结束时间示于表4。D－乳酸蓄积浓度在任意试验区中均相同。为了脱色和粗纯化，添加滤液重量的0.5重量％份的活性炭，进行搅拌。为了除去活性炭，使用滤纸和0.45μm的膜滤器进行抽滤。在任意甜菜碱量的情况下，以分光光度计中纯水在400nm波长处的透射率为100％时，除去活性炭后的滤液在400nm波长处的透射率在任意试验区中均为98.0％以上。

[表4]

[实施例7]在降低了硫酸铵含量的无机盐培养基中的D－乳酸的生产

在实施例1的培养条件下，使无机盐培养基中的硫酸铵含量为2g/L。发酵结束时间为34小时。D－乳酸蓄积浓度相同。

[实施例8]在降低了硫酸镁含量的无机盐培养基中的D－乳酸的生产

在实施例1的培养条件下，使无机盐培养基中的硫酸镁七水合物为0.1g/L。发酵结束时间为34小时。D－乳酸蓄积浓度相同。

[实施例9]在将磷酸氢二钾替换为磷酸二氢钾的无机盐培养基中的D－乳酸的生产

在实施例1的培养条件下，将无机盐培养基中的磷酸氢二钾以相同的含量(g/L)替换为磷酸二氢钾进行培养。发酵结束时间、D－乳酸蓄积浓度相同，确认了可以将磷酸氢二钾替换为磷酸二氢钾。

[实施例10]在降低了磷酸氢二钾含量的无机盐培养基中的D－乳酸的生产

在实施例1的培养条件下，使无机盐培养基中的磷酸氢二钾为0.5g/L。发酵结束时间为27小时。D－乳酸蓄积浓度相同。

(制造例2)与WO2010/032698的实施例9中记载的方法同样地制作大肠杆菌株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP－cscA－fruK株。

具体而言，通过以下方法，制作大肠杆菌株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP－cscA－fruK株。

<制造8：来自大肠杆菌O157的蔗糖酶基因、来自大肠杆菌MG1655的果糖－1－磷酸激酶基因表达载体以及该表达载体转化体的构建>

大肠杆菌O157的蔗糖酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码蔗糖酶的基因(cscA)被记载于GenBank登录号AE005174中所记载的大肠杆菌O157株基因组序列的3274383～3275816。

作为为了表达上述基因所必需的启动子的碱基序列，可以使用在GenBank登录号X02662的碱基序列信息中记录于397－440位的、来自大肠杆菌的甘油醛3－磷酸脱氢酶(以下有时称作GAPDH)的启动子序列。

为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，并利用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号29)、以及TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号30)，通过PCR法进行扩增，利用限制酶NdeI消化所得的DNA片段，由此得到约110bp的相当于GAPDH启动子的DNA片段。将所得的DNA片段与利用限制酶NdeI和PvuII消化质粒pBR322(GenBank登录号J01749)得到的片段混合，用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上生长的转化体。将所得的菌落于37℃在含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的GAPDH启动子序列被正确地插入。将该质粒命名为pBRgapP。

为了获得蔗糖酶基因，使用大肠杆菌O157的基因组DNA(SIGMA－ALDRICH：IRMM449)作为模板，并利用GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(序列号27)、以及ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列号28)，通过PCR法进行扩增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到约1.4kbp的蔗糖酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶XbaI和PshAI消化此前制作的质粒pBRgapP得到的片段混合，用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上生长的转化体。将所得的菌落在37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的cscA被正确地插入。将该质粒命名为pGAP－cscA。

大肠杆菌MG1655的果糖－1－磷酸激酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码果糖－1－磷酸激酶的基因(fruK)被记载于GenBank登录号U00096中所述的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2260387～2259449。

为了获得果糖－1－磷酸激酶基因，使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板，并利用ATGGTACCGGAGAAAGTCTTATGAGCAGACGTGTTGCTAC(序列号29)、以及TCGGATCCTTATGCCTCTCCTGCTGTCAG(序列号30)通过PCR法进行扩增，利用限制酶KpnI对所得的DNA片段进行消化，由此得到约1.0kbp的果糖－1－磷酸激酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶KpnI和EcoRV消化此前制作的质粒pGAP－cscA得到的片段混合，用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA－903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上生长的转化体。将所得的菌落在37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。通过测序确认对质粒的插入序列，确认了作为目标的fruK被正确地插入。将该质粒命名为pGAP－cscA－fruK。

将该质粒pGAP－cscA－fruK转化到上述制造7中制作的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株中，在37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth,Miller琼脂板上培养一夜，得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP－cscA－fruK株。

[实施例11]以蔗糖作为原料的D－乳酸的生产

对于大肠杆菌，使用在制造例2中制作的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP18－cscA－fruK株，在实施例1的培养条件下，将糖由葡萄糖改变为蔗糖，并且还改变了磷酸氢二钾和硫酸镁的含量。培养基中添加的磷酸氢二钾和硫酸镁的含量以及发酵结束时间示于表5。D－乳酸蓄积浓度为85～90g/L，与使用葡萄糖的试验几乎相同。

[表5]

表5：

[实施例12]

<种培养>

向锥形瓶中加入烧瓶容量的1/5量的LB培养基(Difco^TM LBBroth Miller)，在121℃下进行15分钟高压釜灭菌。在高压釜灭菌后的培养基中接种0.1体积％在制造例1中制作的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/GAPldhA基因组插入株。在35℃的恒温室中进行3小时的振荡培养，使种菌体增殖。

<预培养>

向3L锥形瓶中加入820g LB培养基(Difco^TM LB Broth Miller)，在121℃下进行15分钟高压釜灭菌。在高压釜灭菌后的培养基中接种100mL上述的种培养液。在35℃的恒温室中进行5小时的振荡培养，使种菌体增殖。

<D－乳酸发酵生产>

接着，分别对0.5L由63.2g/L磷酸氢二钾、158.0g/L硫酸铵形成的混合液和15.3L表6所示组成的培养基进行高压釜灭菌，然后加入到30L发酵槽(ABLE公司制BML－01PI)中，接种上述的预培养液820mL。对于发酵，控制为压力0.12MPa、搅拌旋转速度140rpm、空气通气量0.1vvm、发酵温度35℃、pH＝7.5(用20wt％氢氧化钙、80wt％纯水的浆料进行pH调节)，实施24小时。

[表6]

表6：培养基组成

(g/L)

在本实施例中，使用图1所示的发酵装置10。在本实施例中，空气入口和出口的空气流量为1.6L/min，空气入口和出口的空气压为0.12MPa，空气入口和出口的温度为35℃。另外，空气入口的氧摩尔分率为0.21，出口的氧摩尔分率采用测定的氧摩尔分率的值(0.21～0.18)。此处，使用每1分钟记录的各个值，并将根据上述式1算出的值在培养5小时以后的平均值作为OUR。这时，对于槽内的溶解氧浓度(DO)，在发酵开始3小时以后几乎为0ppm。需要说明的是，空气入口的空气流量采用质量流量计14的值，另外，对于出口的空气流量，因氧消耗而减少的量为可以忽略的范围，其也采用质量流量计14的值。同样地，空气入口和出口的空气压均采用槽内压力计18的值。另外，空气入口和出口的绝对温度均采用槽内的温度传感器22的值。空气入口的氧摩尔分率为0.21，出口的氧摩尔分率采用排气分析计20的值。

使用HPLC通过常规方法测定所得发酵液中的D－乳酸浓度(柱：ULTRON PS－80H、洗脱液：高氯酸水溶液(pH＝2.1))。

所得发酵液中的析出Ca成分如下测定。在250mL离心试管中称量200g发酵液，以100G、2分钟的离心条件进行离心。除去菌体浮游的上清液。再以2,400G、5分钟的离心条件进行离心。除去上清液，称量。测定该固体成分的水分量，将每1kg发酵液的固体成分量作为钙成分(析出Ca成分)。发酵24小时后的结果示于表7。

[实施例13]

除了以搅拌旋转速度220rpm、空气通气量0.013vvm、氮气通气量0.287vvm的条件进行之外，采用和实施例12同样的方法实施发酵，得到目标物。结果示于表7。

[实施例14]

除了以搅拌旋转速度350rpm的条件进行之外，采用与实施例13同样的方法实施发酵，得到目标物。结果示于表7。

[表7]

表7

[实施例15]

使用离心分离机对21.6kg实施例12中得到的培养液分离菌体，将上清液中残留的菌体通过过滤器进行完全除菌。向该上清液中添加硫酸，直至硫酸pH为2.5以下，析出硫酸钙。将析出的硫酸钙过滤，向所得的分离液中加入滤液重量的0.5重量％份的活性炭。将该浆液搅拌一夜后，再次过滤，除去活性炭。再将其通过阴离子交换柱、阳离子交换柱，分别将钙离子(Ca²⁺)和硫酸根离子(SO₄ ^2－)除去至50ppm以下，得到18.4kg D－乳酸8.8％的粗乳酸水溶液。蒸馏纯化该溶液，得到1.14kg乳酸浓度90重量％的纯化D－乳酸。

[实施例16]

将20g实施例15中得到的D－乳酸和0.083g氧化锡加入到200mL的反应瓶中，安装带有搅拌叶、温度计、Dean－Stark管的回流管。由回流管的上部连接至真空泵和氮气导入管。反复进行减压·氮气放压的操作，除去氧后减压至1kPa，并加热至140℃。在140℃下保持3小时，减压除去水分。除去水分后，返回至常温·常压。接着，向反应瓶中加入14.4g邻二氯苯(ODCB)。在Dean－Stark管中也加入不会溢出到反应瓶的程度的ODCB。除去氧后，减压至30kPa，加热至160℃。在160℃下共沸脱水6hr。这时，每2hr更换Dean－Stark管中的ODCB。共沸脱水后，返回至常温·常压。再向反应瓶中追加28.8g ODCB，向空的Dean－Stark管中加入10g分子筛3A，并加入不会溢出程度的ODCB。除去氧后，减压至30kPa，加热至160℃。在160℃下聚合30hr。放冷后进行抽滤，得到聚乳酸组合物。

将所得的聚乳酸组合物溶解于氯仿，用GPC测定分子量(柱：Shodex GPC LF－804，洗脱液：氯仿)。聚合后的分子量为数均分子量(Mn)2.1万。重均分子量(Mw)作为聚苯乙烯换算值算出，结果为20万。由此，得到分子量分布(Mw/Mn)为9.5、在成型性等中带来较好影响的分子量分布宽的聚合物。使用岛津制作所紫外－可见分光光度计UV－2400PC测定YI值。将聚乳酸组合物以1重量％的量溶解在二氯甲烷中，将其用于测定。通过上述式3算出的YI值为0.6。

[实施例17]发酵液的纯化

使用氢氧化钠水溶液作为pH调节剂，除此以外，与实施例1同样地进行培养，为了从得到的乳酸发酵液中除去菌体，以8000×g进行离心分离。向离心分离的上清液中添加滤液重量的0.5重量％的活性炭，在25℃下搅拌1小时。为了除去活性炭，使用滤纸和0.45μm的膜滤器进行抽滤。以分光光度计中纯水在400nm波长处的透射率为100％时，除去活性炭后的滤液在400nm波长处的透射率为98.0％。使用旋转式真空蒸发器(EYELA公司制)，在10～20hpa、50℃下对得到的滤液进行减压浓缩，得到乳酸钠浓度为19.7重量％的乳酸钠溶液。

使用图2所示的二室式水解电渗析装置进行乳酸钠的脱盐。在本实施例中，使用依次配置各10片(总有效膜面积为550cm²)的阳离子交换膜(ASTOM公司制，商品名：NEOSEPTA CMX)和双极膜(ASTOM公司制，商品名：NEOSEPTA BP－1)、并且形成了酸室和碱室的压滤型电渗析装置。在酸室中设置对应于活性炭处理后的1000g乳酸钠溶液的槽，在碱室中设置对应于1000g纯水的槽，进行供给、循环。需要说明的是，作为电极液，使用1000g 5％硫酸水溶液。使用这些装置，在30℃、恒定电压30V下进行电渗析。结果从酸室中得到920g乳酸浓度为20.3重量％的乳酸溶液。与上述同样地使用旋转式真空蒸发器将得到的乳酸溶液浓缩至乳酸浓度为90.0重量％。

向得到的浓缩液中加入水，调整水分浓度至30％后，将100g乳酸溶液加入到滴液漏斗中，并将滴液漏斗、温度计、冷却管安装到反应瓶上。加热至180℃，减压至10torr(1333Pa)。将滴加温度保持在100℃，以0.5mL/min的滴加速度进行滴加蒸馏，由此一边水解，一边进行蒸馏。通过蒸馏得到的乳酸溶液的聚合度n为1.1，这时的蒸馏收率为95重量％。

[实施例18]聚合

使用实施例17中得到的乳酸溶液，与实施例16同样地实施聚合。所得聚合物的分子量为数均分子量(Mn)2.1万，重均分子量(Mw)21万。由此，分子量分布(Mw/Mn)为10。YI值为0.5。

[实施例19]

使用在实施例3～实施例4、实施例6～实施例11中生产D－乳酸所使用的大肠杆菌和培养基，除此以外的条件与实施例12同样设定，进行D－乳酸发酵生产。与实施例15同样地将得到的D－乳酸盐纯化。

另外，使用在实施例5中生产D－乳酸所使用的大肠杆菌和培养基，除此以外的条件与实施例12同样设定，进行培养。使纯化所得D－乳酸盐时使用的活性炭量为滤液重量的1重量％，除此以外的条件与实施例15同样设定，进行纯化。

分别将上述所得的D－乳酸与实施例16同样地进行聚合，结果得到数均分子量(Mn)为1.9万～2.1万、重均分子量(Mw)为18万～25万、分子量分布为8.5～12、YI值为0.2～2的聚合物，在所有试验区中均能够得到良好的聚合物。

[比较例3]

将比较例2中用0.5重量％活性炭处理的D－乳酸溶液搅拌一夜，然后再次过滤，除去活性炭。再将其通过阴离子交换柱、阳离子交换柱，分别将钙离子(Ca²⁺)和硫酸根离子(SO₄ ^2－)除去至50ppm以下，得到D－乳酸8.5％的粗乳酸水溶液。蒸馏纯化该溶液，得到乳酸浓度99重量％的纯化D－乳酸。将所得的D－乳酸与实施例16同样地进行聚合，结果得到数均分子量(Mn)为4.4万、重均分子量(Mw)为8.0万、分子量分布(Mw/Mn)为1.8、YI值为15的聚合物。

[比较例4]

将比较例2中加入了3.0重量％活性炭的D－乳酸溶液搅拌一夜，然后再次过滤，除去活性炭。再将其通过阴离子交换柱、阳离子交换柱，分别将钙离子(Ca²⁺)和硫酸根离子(SO₄ ^2－)除去至50ppm以下，得到D－乳酸8.5％的粗乳酸水溶液。蒸馏纯化该溶液，得到乳酸浓度99重量％的纯化D－乳酸。将所得的D－乳酸与实施例16同样地进行聚合，结果得到数均分子量(Mn)为2.0万、重均分子量(Mw)为18.0万、分子量分布(Mw/Mn)为9.0、YI值为2的聚合物。

由比较例3、4可知，对于使用玉米浆培养基生产的D－乳酸而言，如果不增加活性炭处理工序的活性炭量，不提高纯化度，则无法获得高质量平均分子量、宽分子量分布的聚乳酸。

本申请要求以2012年7月23日申请的日本申请特愿2012－163028号作为基础的优先权，并且将其公开的全部内容引入至本申请中。

Claims

1.一种D－乳酸的生产方法，通过在含有无机电解质和碳源、并且满足选自下述(a)、(b)、(c)和(d)中至少一个条件的无机盐培养基中对生产D－乳酸的大肠杆菌进行培养，从而生产D－乳酸，

(c)所述无机盐培养基中硫胺素的含量为0.1mg/L以下，

(d)所述无机盐培养基中过渡金属离子的含量为10mg/L以下。

2.如权利要求1所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机盐培养基至少满足所述(c)或所述(d)中的任一个条件。

3.如权利要求1或2所述的D－乳酸的生产方法，其用于生产作为聚合物原料的D－乳酸。

4.如权利要求1～3中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，培养开始时的所述无机盐培养基进一步满足下述(e)，

5.如权利要求1～4中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述碳源为糖。

6.如权利要求5所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述糖包含选自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麦芽糖、蜜二糖酸、乳糖、麦芽三糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、岩藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N－乙酰葡糖胺中的一种以上的化合物。

7.如权利要求1～6中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机电解质包含选自钾离子、磷酸根离子、铵离子、硫酸根离子和镁离子中的一种以上离子作为构成成分。

8.如权利要求1～7中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机电解质包含钾离子，

在培养开始时的所述无机盐培养基中，所述钾离子的浓度为5.8mmol/L以上、且73mmol/L以下。

9.如权利要求1～8中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机盐培养基是将所述无机电解质溶解或混悬于水中而制备的液体。

10.如权利要求1～9中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述无机盐培养基进一步包含甜菜碱。

11.如权利要求1～10中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其中，所述生产D－乳酸的大肠杆菌为重组大肠杆菌。

12.如权利要求1～11中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其包括以下工序：

在所述无机盐培养基中使所述生产D－乳酸的大肠杆菌与所述碳源接触，得到D－乳酸盐的工序；和

13.如权利要求12所述的D－乳酸的生产方法，其中，在得到所述D－乳酸盐的所述工序中，得到D－乳酸的碱土金属盐，

在得到所述D－乳酸的所述工序中，通过将D－乳酸的所述碱土金属盐脱盐，使含有碱土金属的无机盐析出。

14.如权利要求12所述的D－乳酸的生产方法，其中，在得到所述D－乳酸盐的所述工序中，得到D－乳酸的碱金属盐，

在得到所述D－乳酸的所述工序中，通过电解透析处理将D－乳酸的所述碱土金属盐脱盐。

15.如权利要求12～14中任一项所述的D－乳酸的生产方法，其进一步包括在将所述D－乳酸盐脱盐得到D－乳酸的所述工序后，进行所述D－乳酸纯化的纯化工序，

在所述纯化工序中，一边水解一边进行蒸馏。

16.一种聚合物的生产方法，使用通过权利要求1～15中任一项所述的D－乳酸的生产方法得到的D－乳酸进行聚合反应。

17.一种聚合物，是通过权利要求16所述的聚合物的生产方法得到的。