CN104483451A

CN104483451A - 一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法

Info

Publication number: CN104483451A
Application number: CN201410797829.9A
Authority: CN
Inventors: 孙军勇; 陆健; 樊世英
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2015-04-01

Abstract

本发明公开了一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法，属于黄酒生产工艺领域。本发明是先向黄酒中添加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用Tricine-SDS-PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量，根据MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白是否与混浊敏感蛋白一致，并通过凯氏定氮法测定酒体中蛋白质减少的量，从而评价混浊敏感蛋白是否得到去除以及去除的效果大小。该方法可以直接、准确的评价澄清剂对混浊敏感蛋白的去除效果。

Description

一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法

技术领域

本发明涉及一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法，属于黄酒生产工艺领域。

背景技术

在黄酒的沉淀物中，蛋白质占有较大的比例，一般在30％～50％。然而黄酒稳定性与蛋白质总量没有直接的因果关系，可能与酒中的某类蛋白质呈正相关，我们称此类蛋白为混浊敏感蛋白，去除混浊敏感蛋白将是提高黄酒稳定性的的最佳途径。因此，一种能够准确、直接评价混浊敏感蛋白去除效果的方法就尤为重要。

目前应用比较广泛的评价黄酒非生物稳定性的方法有：自然存放法、低温存放法和强制老化法。这些方法间接地反映了混浊敏感蛋白的多少。自然存放法当然是最准确反映黄酒非生物稳定性的方法，它是将酒在自然条件下长期存放，肉眼判断其出现沉淀时间的长短和沉淀量的多少，但是，自然存放法实验周期长，并且判断方法随意，不便于实验研究；低温存放法是在较低的温度下存放一段时间后比较其冷浑浊的情况；强制老化法则是通过冷热胶体的方法促进黄酒混浊的形成，相当于快速的自然存放。这些预测方法都可以一定程度的反映出黄酒稳定性的好坏，但是每一种方法实施的具体时间和温度非常随性，缺乏一个比较统一的标准。

发明内容

本发明利用离心、盐析、透析、真空冷冻干燥制备混浊蛋白和澄清剂吸附蛋白样品，并且利用Tricine-SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOF MS技术分析蛋白质分子量分布及种类，通过比较两者是否一致来确定混浊敏感蛋白是否得到特异性去除，并且通过凯氏定氮法分析混浊敏感蛋白减少的量。

本发明的目的是提供一种能够客观、直接、准确评价黄酒混浊敏感蛋白的去除效果的方法。

本发明所述混浊敏感蛋白是指：将黄酒自然存放出现的混浊沉淀中的总的蛋白，统称为混浊敏感蛋白。

本发明提供一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法，是先向黄酒中添加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用Tricine-SDS-PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量。

所述评价方法是指如果MALDI-TOF/TOF MS鉴定结果表明混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类一致，说明混浊蛋白得到特异性去除，反之没有，同时根据总氮含量降低的量来衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。

所述收集澄清剂吸附的蛋白是指离心经澄清剂处理的黄酒，收集沉淀、洗涤沉淀、氨水溶解沉淀，离心去除澄清剂后于上清中添加硫酸铵来沉淀蛋白，将沉淀悬浮、脱盐透析、冷冻干燥，得到的蛋白质样品即为澄清剂吸附的蛋白。

所述氨水溶解沉淀，在本发明的一种实施方式中，是采用体积分数0.1％-2％的氨水进行溶解。

所述氨水溶解沉淀，在本发明的一种实施方式中，是选用体积分数2％的氨水进行溶解。

所述氨水溶解沉淀，在本发明的一种实施方式中，加入氨水的体积为沉淀体积的3-5倍。

所述硫酸铵来沉淀蛋白，在本发明的一种实施方式中，是缓慢添加硫酸铵至饱和度达到60％-100％。

所述脱盐透析，在本发明的一种实施方式中，是采用截留分子量为1000～8000Da的透析袋进行脱盐透析。

所述离心，在本发明的一种实施方式中，是指黄酒添加澄清剂后静置2～5天，倾去上层清液，然后在相对离心力为8000～17800g下，离心10～30min。

所述使用Tricine-SDS-PAGE技术，在本发明的一种实施方式中，先将采用Bradford法测定澄清剂吸附的混浊蛋白浓度。

所述Tricine-SDS-PAGE技术，在本发明的一种实施方式中，使用的分离胶浓度为16％，浓缩胶浓度为5％。

所述与澄清剂吸附的蛋白进行比较的混浊敏感蛋白，在本发明的一种实施方式中，其获取方式是：黄酒自然存放至出现混浊沉淀，收集沉淀物、洗涤沉淀、氨水溶解沉淀，然后用硫酸铵沉淀蛋白后经脱盐透析、冷冻干燥，即得到混浊敏感蛋白样品。

所述评价方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括：

(1)向黄酒中添加澄清剂，静置2～5天后，倾去上层清液，将剩下的黄酒用力与沉淀混匀，在相对离心力为8000～17800g时离心10～30min，收集沉淀；

(2)用3～5倍体积的去离子水洗涤沉淀，离心收集沉淀，再用3～5倍体积的2％(V/V)氨水溶解澄清剂吸附的蛋白；

(3)离心除去澄清剂，向上清液中缓慢添加硫酸铵直至饱和度达到80％，离心收集沉淀；

(4)将沉淀悬浮于3～5倍体积的去离子水中，将混悬液盛入截留分子量为1000～8000Da的透析袋进行脱盐透析，冷冻干燥，得到蛋白质样品；

(5)将得到的蛋白质样品溶于蛋白裂解液，Bradford法测定混浊蛋白浓度，通过Tricine-SDS-PAGE技术分析黄酒混浊蛋白质和澄清剂吸附的蛋白质分子量分布；

(6)然后利用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白是否与混浊敏感蛋白一致，从而评价混浊敏感蛋白是否得到特异性去除；

(7)利用凯氏定氮法测定黄酒酒体中的总氮含量，并且根据总氮含量降低的量来衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。

本发明还提供一种黄酒澄清剂的选择方法，是根据上述评价方法来判断一种以上澄清剂对黄酒混浊敏感蛋白的特异性去除效果，选择相对效果最好的澄清剂。

本发明提供了一种能客观、直接、准确评价黄酒混浊敏感蛋白去除效果的方法，为黄酒蛋白质浑浊的控制和澄清剂的选择工作奠定了基础。

附图说明

图1：混浊敏感蛋白与澄清剂吸附蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中M代表Marker，泳道1为-混浊敏感蛋白，泳道2～5分别代表使用硅胶1、单宁、Polyclar^R Brewbrite、硅胶2吸附的蛋白，a1～a5代表类燕麦蛋白，b1～b5代表二聚α-淀粉酶抑制剂。

具体实施方式

实施例1

(1)单宁处理样品

先将单宁配制成1％单宁溶液，然后向待澄清酒样中添加单宁溶液，使最终单宁浓度达到70mg/L，搅拌混匀，静置五天后，取上清过滤，灌装。收集下层沉淀，用2％氨水溶解后，缓慢添加硫酸铵使其相对饱和度达到80％，混合搅拌形成沉淀，离心收集沉淀后，透析脱盐，冷冻干燥得到单宁吸附蛋白样品。

(2)混浊敏感蛋白收集

未添加单宁的酒样自然存放一段时间，直至出现混浊沉淀，离心收集沉淀物，再将沉淀物悬浮于超纯水，离心，重复上述过程，收集沉淀，超纯水洗涤两次，用2％氨水溶解，用80％饱和硫酸铵盐析，然后用1000～8000Da的透析袋于4℃下脱盐48h，冷冻干燥，即得到混浊敏感蛋白样品。采用硫酸铵沉淀法能够盐析出溶液中的大部分蛋白质。

(3)Tricine-SDS-PAGE

将混浊蛋白和澄清剂吸附蛋白溶于0.05MTris中，Bradford法测定蛋白浓度。配制Tricine-SDS-PAGE胶，分离胶浓度16％，浓缩胶浓度5％点样，40V电泳半小时，70V电泳至结束。染色、脱色、拍照、分析。Tricine-SDS-PAGE电泳图如图1所示。

(4)MALDI-TOF/TOF MS

切取凝胶上可见的蛋白条带，经脱色、酶解、浓缩后点样于样品靶，干燥后运用质谱仪对样品进行肽质量指纹图谱分析。一级质谱数据采集模式采用正离子反射模式与自动获取数据模式，扫描范围为700～3500Da。选取5～10个信号强度较好的一级质谱峰进行二级质谱分析，使用BioTools软件进行整合，Mascot软件用于质谱数据搜索。搜索数据库为NCBI，物种属为全物种，切割酶为胰酶。各条带的MALDI-TOF/TOF MS鉴定结果如表1所示。

(5)取10ml澄清酒样，加入5～7滴浓硫酸，220℃碳化1.5h，冷却后加入5～6g催化剂，420℃消化2h，定氮。

(6)通过Tricine-SDS-PAGE分析分子量分布、MALDI-TOF/TOF MS鉴定后，单宁吸附蛋白质与混浊敏感蛋白分子量分布与种类一致，说明单宁能够特异性吸附混浊敏感蛋白。

(7)定氮结果如表2所示。

使用单宁多次分别处理同一酒样，得到的蛋白质分子量、种类一致，说明本方法的可重复性高。表2的结果表明，总氮减少的量为68mgN/L。

经70mg/L单宁处理后的酒样，再进行自然存放，酒样的混浊敏感蛋白显著降低，说明本方法准确性高。

实施例2

(1)向待澄清酒样中添加硅胶1号和2号，使最终硅胶浓度达到500mg/L，搅拌混匀，静置1h后，取上清过滤，灌装。收集下层硅胶，用2％氨水洗脱硅胶吸附蛋白，离心去除硅胶。向上清中缓慢添加硫酸铵使其相对饱和度达到80％，混合搅拌形成沉淀，离心收集沉淀后，透析脱盐，冷冻干燥得到硅胶1、2吸附蛋白样品。所述硅胶1号是指购自美国PQ公司的A100硅胶，硅胶2号是指购自德国Stabifix公司的干硅胶。

(2)混浊敏感蛋白收集、Tricine-SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOF MS参考实施例1

(3)通过Tricine-SDS-PAGE分析分子量分布、MALDI-TOF/TOF MS鉴定后，硅胶吸附蛋白质与混浊敏感蛋白一致，说明硅胶能够特异性吸附混浊敏感蛋白。

(4)定氮结果表明，硅胶1、2总氮减少的量分别为16mgN/L、46mgN/L。

实施例3

向待澄清酒样中添加Polyclar^R Brewbrite，使最终Polyclar^R Brewbrite浓度达到200mg/L，搅拌混匀，静置1h后，取上清过滤，灌装。收集下层沉淀物，用2％氨水洗脱吸附蛋白，离心去除Polyclar^R Brewbrite。向上清中缓慢添加硫酸铵使其相对饱和度达到80％，混合搅拌形成沉淀，离心收集沉淀后，透析脱盐，冷冻干燥得到Polyclar^R Brewbrite吸附蛋白样品。所述Polyclar^R Brewbrite购自美国国际特品公司。

(2)混浊敏感蛋白收集、Tricine-SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOF MS参考实施例1.

(3)通过Tricine-SDS-PAGE分析分子量分布、MALDI-TOF/TOF MS鉴定后，Polyclar^RBrewbrite吸附蛋白质与混浊敏感蛋白一致，说明Polyclar^R Brewbrite能够特异性吸附混浊敏感蛋白。

(4)定氮结果表明，总氮减少的量为8mgN/L。

表1为使用不同澄清剂吸附蛋白的MALDI-TOF/TOF MS鉴定结果。

从实施例1、2、3结果以及表1、表2、图1数据可知，单宁、硅胶1号、硅胶2号、Polyclar^RBrewbrite都能去除混浊敏感蛋白，且在实施例中的添加量下，去除效果以单宁最好，硅胶2号次之，再次是硅胶1号，Polyclar^R Brewbrite效果最差。

表1各条带的MALDI-TOF/TOF MS鉴定结果

表2澄清剂处理前后酒体中总氮含量

注：用t检验法进行分析。同一列中试验组与对照组相比。**表示差异极显著(P<0.01)。*表示差异显著(P<0.05)

实施例4

向黄酒中添加单宁至单宁的终浓度为100mg/L，静置后，倾去上层清液，将剩下的黄酒用力与沉淀混匀，在相对离心力为8000～17800g时离心10～30min，收集沉淀；用3～5倍体积的去离子水洗涤沉淀，离心收集沉淀，再用3～5倍体积的氨水体积分数为0.1％的氨水溶解单宁吸附的蛋白。

离心除去澄清剂，向上清液中缓慢添加硫酸铵直至饱和度达到60％，离心收集沉淀；将沉淀悬浮于3～5倍体积的去离子水中，将混悬液盛入截留分子量为1000～8000Da的透析袋进行脱盐透析，冷冻干燥，得到蛋白质样品。

将得到的蛋白质样品溶于蛋白裂解液，Bradford法测定混浊蛋白浓度，通过Tricine-SDS-PAGE技术分析黄酒混浊蛋白质和单宁吸附的蛋白质分子量分布；然后利用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白与混浊敏感蛋白，利用凯氏定氮法测定黄酒酒体中的总氮含量。结果发现单宁吸附的蛋白质与黄酒混浊敏感蛋白质的分子量大小一致、种类一直，说明混浊敏感蛋白得到特异性去除。同时总氮含量降低了82mgN/L。

实施例5

向黄酒中添加澄清剂，静置后，倾去上层清液，将剩下的黄酒用力与沉淀混匀，在相对离心力为8000～17800g时离心10～30min，收集沉淀；用3～5倍体积的去离子水洗涤沉淀，离心收集沉淀，再用3～5倍体积的氨水体积分数为1％的氨水溶解单宁吸附的蛋白。

离心除去澄清剂，向上清液中缓慢添加硫酸铵直至饱和度达到100％，离心收集沉淀；将沉淀悬浮于3～5倍体积的去离子水中，将混悬液盛入截留分子量为1000～8000Da的透析袋进行脱盐透析，冷冻干燥，得到蛋白质样品。

将得到的蛋白质样品溶于蛋白裂解液，Bradford法测定混浊蛋白浓度，通过Tricine-SDS-PAGE技术分析黄酒混浊蛋白质和单宁吸附的蛋白质分子量分布；然后利用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白与混浊敏感蛋白是否一致，从而评价混浊敏感蛋白是否得到特异性去除；

利用凯氏定氮法测定黄酒酒体中的总氮含量，并且根据总氮含量降低的量来衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法，其特征在于，所述方法是先向黄酒中添加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用Tricine-SDS-PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量；所述评价方法是指如果MALDI-TOF/TOF MS鉴定结果表明混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类一致，说明混浊蛋白得到特异性去除，反之没有，同时根据总氮含量降低的量来衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集澄清剂吸附的蛋白是指离心经澄清剂处理的黄酒，收集沉淀、洗涤沉淀、氨水溶解沉淀，离心去除澄清剂后于上清中添加硫酸铵来沉淀蛋白，将沉淀悬浮、脱盐透析、冷冻干燥，得到的蛋白质样品即为澄清剂吸附的蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氨水溶解沉淀是采用体积分数0.1％～2％的氨水进行溶解。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵来沉淀蛋白是缓慢添加硫酸铵至饱和度达到60％～100％。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱盐透析是采用截留分子量为3500～8000Da的透析袋进行脱盐透析。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心是指黄酒添加澄清剂后静置2～5天，倾去上层清液，然后在相对离心力为8000～17800g下，离心10～30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用Tricine-SDS-PAGE技术先将采用Bradford法测定澄清剂吸附的混浊蛋白浓度；所述Tricine-SDS-PAGE技术使用的分离胶浓度为16％，浓缩胶浓度为5％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与澄清剂吸附的蛋白进行比较的混浊敏感蛋白的获取方式是：黄酒自然存放至出现混浊沉淀，收集沉淀物、洗涤沉淀、氨水溶解沉淀，然后用硫酸铵沉淀蛋白后经脱盐透析、冷冻干燥，即得到混浊敏感蛋白样品。

9.根据权利要1-7任意所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：

(2)用3～5倍体积的去离子水洗涤沉淀，离心收集沉淀，再用3～5倍体积的氨水体积分数为0.1％～2％的氨水溶解澄清剂吸附的蛋白；

(3)离心除去澄清剂，向上清液中缓慢添加硫酸铵直至饱和度达到60％～100％，离心收集沉淀；

10.一种黄酒澄清剂的选择方法，其特征在于，所述方法是指用权利要求1所述评价方法来评价一种以上澄清剂对黄酒混浊敏感蛋白的特异性去除效果，选择相对效果最好的澄清剂。