CN104483418A - 一种rp-ip-hplc法收集依诺肝素寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，涉及一种RP-IP-HPLC法收集依诺肝素寡糖的方法。本发明所述的方法，包括以下步骤：a.从依诺肝素中收集出总四糖组分：取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法分离，得到总四糖组分；b.采用RP-IP-HPLC从总四糖组分中收集出单四糖组分：取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱进行分离提纯；c.将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种RP-IP-HPLC法收集依诺肝素寡糖的方法。
背景技术
依诺肝素(Enoxaparin)属于低分子肝素的一种，由肝素苄酯经过碱性β-消除反应而来，是一种由许多链长不一的肝素小分子组成的混合物，结构非常复杂。目前依诺肝素在临床上主要用于预防深静脉血栓形成及肺栓塞、治疗已形成的静脉血栓、预防血液透析时体外循环中血栓的形成以及治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗等。
作为一种由粘多糖聚合物组成的复杂混合物，依诺肝素含有许许多多的寡糖链。大部分的寡糖链在其非还原端含有4,5不饱和糖醛酸结构，有15％-25％的寡糖链在其还原端含有1,6酐环的结构，由此决定了依诺肝素具有链长的多分散性、双糖单元及其在寡糖链中分布顺序的多样性、寡糖链中末端修饰的双糖单元多样性等特点。
鉴于依诺肝素结构的高度复杂性，要改进依诺肝素的生产工艺就必须在其分子细节结构上进行定向修饰和分析鉴定，而在进行依诺肝素的寡糖结构分析前就必须收集数量足够多且纯度高的寡糖成分。
目前对于依诺肝素中寡糖的常规收集方法主要包括有酶降解-HPLC收集法和超滤收集法。其中酶降解-HPLC法主要将多糖降解成寡糖后再使用HPLC进行收集，一般只能收集到单糖、双糖和三糖等短链寡糖，收率较低且纯度不高，并需要经过多次分离才能获得，同时由于该方法对依诺肝素的寡糖链进行了切割，使得寡糖的序列受到了破坏；超滤法只能截留一定分子量范围的物质，是一种比较粗放的方法，虽然可结合使用HPLC进行精制，但收集流程比较长，效率低同时纯度也不高，不适用一般的分析实验使用。
本发明提出一种采用凝胶渗透色谱法及高效液相色谱连接质谱技术，从依诺肝素中分离收集完整的四糖子组分并进行确认的方法，这种方法对依诺肝素钠的各寡糖特别是短链的寡糖分离效果良好，不仅能分出四糖、六糖等含量高的偶数寡糖，对于含量较低的奇数寡糖也能分离，例如四糖后面的三糖、四糖和六糖之间的五糖，并可进一步应用在达肝素、那曲肝素等其他低分子肝素的寡糖收集和鉴定工作。本方法严谨、科学，具有极高的实际使用价值和长远深刻的社会意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种收集、检测依诺肝素寡糖的方法。
本发明的方法是通过采用GPC和RP-IP-HPLC联合分离法收集依诺肝素钠中的寡糖总组分及其子组分，并通过电喷雾质谱(ESI-MS)对所收集的寡糖子组分结构进行解析确认。
本发明所述的寡糖包括但不限于，三糖、四糖、五糖、六糖。
本发明以收集四糖组分为例，所述收集方法包括以下步骤：
a、从依诺肝素中收集出总四糖组分(即四糖组分的混合物)：取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法(GPC)分离，得到总四糖组分。
b、采用RP-IP-HPLC从总四糖组分中收集出单四糖组分：取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱(RP-IP-HPLC)进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱(RP-IP-HPLC)进行分离提纯。
c、将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析。
其中，步骤a中所述的凝胶渗透色谱法，其色谱条件如下表1：
表1
| 柱系统 | 两根玻璃柱(5x96cm)串联，填料Biogel P10 |
| 流动相 | 流动相A |
| 流速 | 2.0ml/min |
| 洗脱类型 | 等度洗脱 |
| 总排阻体积 | 1000ml(工作标准品G3000Mw＝14000Da) |
| 总渗透体积 | 4000ml(工作标准品K2CrO4Mw＝194.2g/mol) |
| 进样体积 | 10ml |
| 检测器 | UV 210nm，离线 |
| 收集模式 | 按峰收集 |
| 起始收集斜率 | 10mAU/min |
| 结束收集斜率 | 2mAU/min |
| 最小峰收集时间 | 20min |
| 运行时间 | 900min |
其中，步骤b中所述的采用RP-IP-HPLC收集出单四糖组分法，是指采用两级梯度分离的操作方法，该方法与常规的一次HPLC分离法相比，可大大提高分辨率。
将a步骤所得到的总四糖组配制成浓度为10mg/ml水溶液后，用反向离子对液相色谱(RP-IP-HPLC)进行两次分离，两次分离的操作条件分别见下表2和表3：
表2
表3
| HPLC系统 | HPLC-UV岛津LC-6AD |
| 组分收集器 | 岛津FRC-10A |
| 柱子 | C18(250x4.6mm) |
| 流动相 | 流动相F、流动相G |
| 运行时间 | 30min |
| 流速 | 0.8ml/min |
| 进样体积 | 35-50μl |
| 收集模式 | 按峰收集 |
| UV检测器 | 232nm |
步骤c中所述的ESI-MS法，其操作条件见如下表4：
表4
| 条件内容 | 名称/指标 | 条件内容 | 名称/指标 |
| 质谱仪 | Waters Xevo G2-S QTOF | 脱溶剂气体温度 | 400℃ |
| 模式 | Negative Resolution Mode | 锥孔气流 | 50L/Hr |
| 毛细管电压 | 2.5kV | 脱溶剂气体流量 | 800L/Hr |
| 采样锥电压 | 25V | 开始质量 | 200 |
| 源补偿电压 | 80V | 结束质量 | 2000 |
| 初始温度 | 120℃ | ---- | ---- |
本发明所述收集方法中，所用溶液的配制：
依诺肝素钠样品溶液的配制：称取1000mg的依诺肝素钠样品于洁净的试管中，加入15ml的超纯水溶解，混匀。
10mg/ml的总四糖组分溶液配制：称取15mg收集到的总四糖组分样品于洁净的试管中，加入1.5ml的超纯水溶解，混匀。
1mg/ml的预分离的四糖组分溶液的制备：称取3mg预分离的四糖子组分样品于洁净的试管中，入3ml的超纯水溶解，混匀。
1mg/ml的四糖三种子组分溶液的制备：分别取1mg四糖各种三步分离子组分样品于洁净的试管中，加入1ml,混匀。
溶液A：称取二丁胺1.03g，冰乙酸0.6128g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。
溶液B：称取乙酸0.674g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。
流动相A的配制：称取14.71g氯化铵，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，得到0.25M NH4Cl溶液。
流动相B的配制：取溶液A 60ml于100ml容量瓶中，加入40ml甲醇，混匀。
流动相C的配制：取溶液A 57ml于100ml容量瓶中，加入43ml甲醇，混匀。
流动相D的配制：取溶液A 50ml于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，混匀。
流动相E的配制：取溶液A 20ml于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，混匀。
流动相F的配制：取溶液B 90ml于100ml容量瓶中，加入10ml甲醇，混匀。
流动相G：称取乙酸0.674g，加入约800m甲醇溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。
优选的，本发明的收集方法，包括以下步骤：
a)从依诺肝素中收集出总四糖组分
取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法(GPC)分离，收集总四糖组分。
b)从依诺肝素总四糖组分中收集的单四糖组分
取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱进行分离提纯。
c)将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析。
其中，步骤a)所述色谱条件：
柱系统：两根玻璃柱串联，每根玻璃柱5x96cm，填料Biogel P10
流动相：流动相A，
流速：2.0ml/min
洗脱类型：等度洗脱
进样体积：10ml
检测器：UV 210nm，
收集模式：按峰收集
起始收集斜率：10mAU/min
结束收集斜率：10mAU/min
最小峰收集时间：20min
运行时间：900min
其中，步骤b)，预分离过程中，色谱条件：
HPLC系统：HPLC岛津LC-6AD
柱子：C-18，250x16mm
流动相：流动相B、流动相C、流动相D、流动相E进行梯度洗脱
梯度洗脱：
流速：5ml/min
进样体积：100μl
收集模式：按时间收集
收集组分：组分1：14.0-25.5min；组分2：25.5-31.5min；组分3：31.5-37.6min；组分4：37.6-48.8min
检测器：UV 210/232nm
运行时间：70min
其中，步骤b)，第2次分离过程中，色谱条件：
HPLC系统：HPLC-UV岛津LC-6AD
组分收集器：岛津FRC-10A
柱子：C18，250x4.6mm、
流动相：流动相F、流动相G进行梯度洗脱
流速：0.8ml/min
进样体积：35-50μl
收集模式：按峰收集
UV检测器：232nm
其中，步骤c)，ESI-MS法，其操作条件如下：
本发明的方法中，各个步骤中的色谱条件都是经过筛选得到的，筛选过程如下：
在总四糖组分中收集单四糖组分步骤时，分别考察了不同的液相梯度洗脱条件和不同流速对单四糖组分的分离效果。筛选结果表明：
采用两级梯度的分离条件与一次梯度的分离条件相比，可大大提高单四糖组分的分离度，且当选择本说明书中的预分离过程和第2次分离过程中的液相梯度洗脱条件时，单四糖组分的分离效果最好；同时，随着流速的增加，单糖组分的分离个数逐渐减少，各单糖组分的分离度逐渐降低，若降低液相流速，将增加梯度洗脱时间，在保证检测分离度的情况下尽量缩短检测时间，预分离过程中选择流速为5.0ml/min，第2次分离过程中选择色谱条件为0.8ml/min。
本发明和现有收集方法相比较，其优点主要表现在：本发明的方法，操作简单，收集时间短，收集到的单糖收率高、纯度高，同时本发明的方法避免寡糖序列被破坏，对低分子肝素的各寡糖组分均可进行分离、收集。
附图说明
图1、GPC分级依诺肝素钠的洗脱图
根据出峰顺序，各峰依次为＞dp18，dp18，dp16，dp12，dp10，dp8，dp6，dp5，dp4，dp3及＜dp3。其中dp3代表三糖，dp4代表四糖，依次类推。
图2、依诺肝素中四糖组分–dp4子组分收集示意图
图3、三种分离子组分各自收集的UV232nm图
图3A、组分2的UV232nm图
图3B、组分3的UV232nm图
图3C、组分4的UV232nm图
图4、单四糖组分MS图
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1：
依诺肝素钠寡糖成分收集各步骤中溶液的配制
依诺肝素钠样品溶液的配制：称取1000mg的依诺肝素钠样品于洁净的试管中，加入15ml的超纯水溶解，混匀。
10mg/ml的总四糖组分溶液配制：称取15mg收集到的总四糖组分样品于洁净的试管中，加入1.5ml的超纯水溶解，混匀。
1mg/ml的预分离的四糖组分溶液的制备：称取3mg预分离的四糖子组分样品于洁净的试管中，入3ml的超纯水溶解，混匀。
1mg/ml的四糖三种子组分溶液的制备：分别取1mg四糖各种三步分离子组分样品于洁净的试管中，加入1ml,混匀。
溶液A：称取二丁胺1.03g，冰乙酸0.6128g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。
溶液B：称取乙酸0.674g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。
流动相A的配制：称取14.71g氯化铵，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，得到0.25M NH4Cl溶液。
流动相B的配制：取溶液A 60ml于100ml容量瓶中，加入40ml甲醇，混匀。
流动相C的配制：取溶液A 57ml于100ml容量瓶中，加入43ml甲醇，混匀。
流动相D的配制：取溶液A 50ml于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，混匀。
流动相E的配制：取溶液A 20ml于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，混匀。
流动相F的配制：取溶液B 90ml于100ml容量瓶中，加入10ml甲醇，混匀。
流动相G：称取乙酸0.674g，加入约800m甲醇溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。
从依诺肝素中收集出总四糖组分(即四糖组分的混合物)
基于依诺肝素各寡糖链长度不同，取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法(GPC)分离，采用上述表1的色谱条件。根据表1的操作方法得到依诺肝素样品的GPC洗脱图见图1，收集其中峰“dp4”的组分为对应的总四糖组分。将分离得到的总四糖组分dp4用半透膜深入透析约20个小时后，进行减压干燥。
3、从依诺肝素总四糖组分中收集的单四糖组分
取收集到的总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液，用RP-IP-HPLC进行预分离，采用下面表5中的色谱条件。
表5
根据表5的操作方法得到预分离后的半制备四糖组分图谱见附图2。
取预分离的半制备四糖子组分配制成1mg/ml的水溶液用RP-IP-HPLC进行再分离提纯，分别采用表6中的色谱条件：
表6
根据表6的操作方法得到再分离的四糖组分(“dp4”子组分)的图谱见附图3。
依诺肝素四糖子组分分析
将根据不同HPLC出峰时间分离提纯得到的各四糖子组分配制成1mg/ml水溶液用ESI-MS进行分析，采用上述表4中的色谱条件。
根据表4的操作方法得到的单个四糖子组分的MS图谱见附图4。
根据MS检测结果对各四糖子组分结构进行分析
依诺肝素中含有的四糖的序列已有文献报道，我们结合相关文献建立了依诺肝素四糖序列的数据库。根据质谱图中被测物的质荷比以及同位素分布情况计算出分子量，通过该分子量在数据库中查询即可得到被测物可能的结构组成，本方法中各四糖子组分质谱峰的解析结果见下表7。
表7
综上，在经过GPC分离总四糖、反向离子对液相色谱预分离、RP-IP-HPLC分离提纯后，可以有效收集依诺肝素钠寡糖各成分。
实施例2：
将本发明收集方法和现有的酶降解-HPLC收集法及超滤收集方法，分别从收集范围、时间、寡糖收率、纯度及收集成本等方面进行比较，比较情况见下表8：
表8
从表8的比较结果可以看出，通过对收集范围、时间、寡糖收率、纯度及收集成本等方面进行综合考虑，本发明收集方法均较现有的酶降解-HPLC收集法及超滤收集方法更为经济、有效。
Claims (10)
1.一种收集依诺肝素寡糖的方法，包括以下步骤：
a、从依诺肝素中收集出总四糖组分：取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法分离，得到总四糖组分；
b、采用RP-IP-HPLC从总四糖组分中收集出单四糖组分：取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱进行分离提纯；
c、将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述色谱条件如下：
柱系统：两根玻璃柱串联，填料Biogel P10，
流动相：流动相A，流动相A的配制：称取14.71g氯化铵，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，得到0.25M NH4Cl溶液，
流速：2.0ml/min，
洗脱类型：等度洗脱，
进样体积：10ml，
收集模式：按峰收集，
起始收集斜率：10mAU/min，
结束收集斜率：2mAU/min，
最小峰收集时间：20min，
检测器：UV 210nm，
运行时间：900min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，预分离过程中，所述色谱条件如下：
HPLC系统：HPLC，岛津LC-6AD，
柱子：C-18，250x16mm，
流动相：流动相B、流动相C、流动相D、流动相E进行梯度洗脱，
流速：5ml/min，
进样体积：100μl，
收集模式：按时间收集，
收集组分：组分1：14.0-25.5min；组分2：25.5-31.5min；组分3：31.5-37.6min；组分4：37.6-48.8min，
检测器：UV 210/232nm，
运行时间：70min，
流动相B的配制：取溶液A 60ml于100ml容量瓶中，加入40ml甲醇，混匀，
流动相C的配制：取溶液A 57ml于100ml容量瓶中，加入43ml甲醇，混匀，
流动相D的配制：取溶液A 50ml于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，混匀，
流动相E的配制：取溶液A 20ml于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，混匀。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，第2次分离过程中，所述色谱条件如下：
HPLC系统：HPLC-UV岛津LC-6AD，
组分收集器：岛津FRC-10A，
收集模式：按峰收集，
柱子：C18，250x4.6mm，
流动相：流动相F、流动相G进行梯度洗脱，
流速：0.8ml/min，
进样体积：35-50μl，
UV检测器：232nm，
流动相F的配制：取溶液B 90ml于100ml容量瓶中，加入10ml甲醇，混匀，
流动相G的配制：称取乙酸0.674g，加入约800m甲醇溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程如下：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中，所述ESI-MS法，所用质谱仪为Waters Xevo G2-S QTOF。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中，所述ESI-MS法，操作条件如下：
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用溶液的配制方法如下：
依诺肝素钠样品溶液的配制：称取1000mg的依诺肝素钠样品于洁净的试管中，
加入15ml的超纯水溶解，混匀，
10mg/ml的总四糖组分溶液配制：称取15mg收集到的总四糖组分样品于洁净的
试管中，加入1.5ml的超纯水溶解，混匀，
1mg/ml的预分离的四糖组分溶液的制备：称取3mg预分离的四糖子组分样品于
洁净的试管中，入3ml的超纯水溶解，混匀，
1mg/ml的四糖三种子组分溶液的制备：分别取1mg四糖分离子组分样品于洁净的试管中，加入1ml,混匀，
溶液A：称取二丁胺1.03g，冰乙酸0.6128g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，
溶液B：称取乙酸0.674g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，
流动相A的配制：称取14.71g氯化铵，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，得到0.25M NH4Cl溶液，
流动相B的配制：取溶液A 60ml于100ml容量瓶中，加入40ml甲醇，混匀，
流动相C的配制：取溶液A 57ml于100ml容量瓶中，加入43ml甲醇，混匀，
流动相D的配制：取溶液A 50ml于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，混匀，
流动相E的配制：取溶液A 20ml于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，混匀，
流动相F的配制：取溶液B 90ml于100ml容量瓶中，加入10ml甲醇，混匀，
流动相G的配制：称取乙酸0.674g，加入约800m甲醇溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)溶液的配制
依诺肝素钠样品溶液的配制：称取1000mg的依诺肝素钠样品于洁净的试管中，加入15ml的超纯水溶解，混匀，
10mg/ml的总四糖组分溶液配制：称取15mg收集到的总四糖组分样品于洁净的试管中，加入1.5ml的超纯水溶解，混匀，
1mg/ml的预分离的四糖组分溶液的制备：称取3mg预分离的四糖子组分样品于洁净的试管中，入3ml的超纯水溶解，混匀，
1mg/ml的四糖三种子组分溶液的制备：分别取1mg四糖分离子组分样品于洁净的试管中，加入1ml,混匀，
溶液A：称取二丁胺1.03g，冰乙酸0.6128g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，
溶液B：称取乙酸0.674g，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，
流动相A的配制：称取14.71g氯化铵，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，得到0.25M NH4Cl溶液，
流动相B的配制：取溶液A 60ml于100ml容量瓶中，加入40ml甲醇，混匀，
流动相C的配制：取溶液A 57ml于100ml容量瓶中，加入43ml甲醇，混匀，
流动相D的配制：取溶液A 50ml于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，混匀，
流动相E的配制：取溶液A 20ml于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，混匀，
流动相F的配制：取溶液B 90ml于100ml容量瓶中，加入10ml甲醇，混匀，
流动相G的配制：称取乙酸0.674g，加入约800m甲醇溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。
2)从依诺肝素中收集出总四糖组分
取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法分离，将分离得到的总四糖组分用半透膜深入透析约20个小时后，进行减压干燥；
3)从依诺肝素总四糖组分中收集的单四糖组分
取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱进行分离提纯；
4)依诺肝素四糖子组分分析
将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析；
其中，步骤2)所述色谱分离的色谱条件：
柱系统：两根玻璃柱串联，每根玻璃柱5x96cm，填料Biogel P10，
流动相：流动相A，
流速：2.0ml/min，
洗脱类型：等度洗脱，
进样体积：10ml，
检测器：UV 210nm，
收集模式：按峰收集，
起始收集斜率：10mAU/min，
结束收集斜率：2mAU/min，
最小峰收集时间：20min，
运行时间：900min，
其中，步骤3)，预分离过程中，色谱条件：
HPLC系统：HPLC岛津LC-6AD，
柱子：C-18，250x16mm，
流动相：流动相B、流动相C、流动相D、流动相E进行梯度洗脱
梯度洗脱：
流速：5ml/min，
进样体积：100μl，
收集模式：按时间收集，
收集组分：组分1：14.0-25.5min；组分2：25.5-31.5min；组分3：31.5-37.6min；组分4：37.6-48.8min，
检测器：UV 210/232nm，
运行时间：70min，
其中，步骤3)，第2次分离过程中，色谱条件：
HPLC系统：HPLC-UV岛津LC-6AD，
组分收集器：岛津FRC-10A，
柱子：C18，250x4.6mm，
流动相：流动相F、流动相G进行梯度洗脱
流速：0.8ml/min
进样体积：35-50μl
收集模式：按峰收集
UV检测器：232nm，
其中，步骤4)，ESI-MS法，其操作条件如下：
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