CN116124928A - 凝胶渗透色谱法测定低分子量糖胺聚糖的分子量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凝胶渗透色谱法测定低分子量糖胺聚糖的分子量的方法，所述糖胺聚糖为透明质酸或者硫酸软骨素或者肝素，包括如下步骤：(1)校准物溶液的制备；(2)供试品溶液的配制：(3)基于寡糖的锯齿状色谱峰获得校准曲线I：(4)获得标准校准表II；(5)重新进行凝胶色谱分析，并推导获得MW vs.RT的校准曲线II；(6)供试品测定：(7)供试品分子量计算。本发明解决了目前没有通用的且实用的低分子量CS和HA的测定方法的技术问题。本发明方法在校准时采用两根或三根或四根或更多色谱柱串联，测定时用单柱普通条件即可。采用多色谱柱串联，可以分辨出更多的锯齿状峰，分子量的可信范围大大增加。
Description
技术领域
本发明属于化学检测和药物分析技术领域，涉及物质的分子量检测，具体涉及一种凝胶渗透色谱法测定低分子量糖胺聚糖的分子量的方法。
背景技术
透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、肝素(Hep)是糖胺聚糖(GAG)的三个重要成员。多种生理活性，优异的生物相容性使其成为医药，美容和膳食补充剂等领域的重要材料。研究表明，GAG的生物学功能和性质在很大程度上受其分子量的影响，并且低分子量(LMW)GAG被认为可以改善几种生物活性和药理学性质。低分子量透明质酸(LMW-HA)和低分子量硫酸软骨素(LMW-CS)在医药、美容、保健等领域显示出巨大潜力，激发了医疗和化妆品公司日益增长的兴趣，许多产品和原材料已经大规模商业化。而低分子肝素(LMW-Hep)已成为重要的抗血凝药物。毫无疑问，分子量(MW)和分子量分布的评估是表征LMW-GAG的最重要方面之一。
然而，到目前为止，既没有统一标准，也没有普遍接受的简单实用的方法，来测定LMW-GAG(LMW-HA或LMW-CS)的平均分子量及其分子量分布。大多数测定LMW-GAGs分子量分布的技术都使用凝胶渗透色谱(GPC)，其结果的合理性主要取决于对GPC系统校准的准确性。一些研究使用了一系列水性GPC的商品校准标准品进行校准，包括PEO、普鲁兰多糖标准品和右旋糖酐标准品。然而，结果不可避免地不准确，因为任何类型的大分子的校准品在结构上都应尽可能接近要表征的样品。有的还采用了分子量分布较窄的HA或CS级分，但在实际操作中，需要花费相当多的时间和精力才能生产出这么多级分作为校准品。此外，GPC与多角度激光散射(MALLS)检测器联用也用于测定分子量，克服了对分子量校准品的关键依赖性；但MALLS检测器的缺点包括平衡时间长、小分子灵敏度低、价格昂贵等，阻碍了其推广和应用。显然，对于LMW-HA或LMW-CS行业，开发一种可靠且实用的分子量测量方法至关重要。
发明内容
GAG是基于简单二糖重复单元的线性多糖，它们可以通过肝素酶、透明质酸酶、软骨素酶等GAG水解酶的作用降解为偶数寡糖。研发中发现，这些低聚糖沿其GPC折射率(RI)分布有规则的锯齿状峰，每个锯齿状峰都可以准确地对应某个具有确定MW的偶数寡糖分子。通过一系列锯齿状峰的MWs及其保留时间(RT)可以得出具有MW计算可靠性的校准曲线，不需要进一步复杂的校准，也不需要其他检测器或仪器的帮助。基于这一发现，发明人开发了一种可靠且方便的测定LMW-GAG(特别是LMW-HA或LMW-CS)分布的方法。
基于此，本发明保护如下技术方案：
一种凝胶渗透色谱法测定低分子量糖胺聚糖的分子量的方法，所述糖胺聚糖为透明质酸或者硫酸软骨素或者肝素，包括如下步骤：
(1)校准物溶液的制备
HA或CS校准物溶液：采用透明质酸酶或软骨素酶酶解HA或CS，得到部分解聚的HA和CS，用流动相配制为校准物溶液；优选采用透明质酸酶酶解；
Hep校准物溶液：采用常规Hep标准物质配制；
(2)供试品溶液的配制：将LMW-HA或LMW-CS或LMW-Hep供试品用流动相配制为供试品溶液；
(3)基于寡糖的锯齿状色谱峰获得校准曲线I：
①将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用至少两根凝胶渗透色谱柱串联，取制备的校准物溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到校准物溶液的锯齿状凝胶渗透色谱图I；
所述色谱柱中，其中一根色谱柱的蛋白质分子量线性分析范围为5000-150000，其余色谱柱的蛋白质分子量线性分析范围为10000-700000；
液相色谱分析条件为：
流动相流速：0.1～1.0ml/min，优选0.3～0.5ml/min或者0.40ml/min；
柱温：25～45℃或者30～40℃或者32～37℃，优选35℃；
进样量：1～100ul，优选10～60ul或15～35ul或20～30ul或25ul；
②获得单分散寡糖的绝对MW和对应的RT的标准表I：步骤①得到的凝胶渗透色谱图I，其中的锯齿状峰的每一个峰即对应一个单分散寡糖，将每一个峰对应的保留时间RT和该峰对应的单分散寡糖分子的绝对分子量对应起来即生成标准表I；
③用得到的标准表I，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，拟合分子量MW-保留时间RT标准曲线，即获得校准曲线I；
(4)获得标准校准表II
基于校准曲线I及校准物的凝胶渗透色谱图I，在MW 400-18500范围内选取若干个MW，通过GPC软件的切片功能，找到每个MW对应的累积峰面积百分比，从而生成MW与其对应的累积峰面积百分比的标准标准表II；
(5)重新进行凝胶色谱分析，并推导获得MW vs.RT的校准曲线II
将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用单根色谱柱，取制备的校准物溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到校准物溶液的凝胶渗透色谱图II；
所述色谱柱的球蛋白质分子量线性分析范围为5000-150000；
液相色谱分析条件为：
流动相流速：0.1～1.5ml/min，优选0.4～0.6ml/min或者0.5ml/min；
柱温：25～45℃或者30～40℃或者32～37℃，优选35℃；
进样量：1～100ul，优选10～60ul或15～35ul或20～30ul或25ul；
通过GPC软件的切片功能，计算凝胶渗透色谱图II中校准物的每个点的累积峰面积百分比，确定与标准校准表II中累积峰面积百分比最接近点的保留时间及对应的分子量，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，拟合分子量MW-保留时间RT标准曲线，建立校准曲线II；
(6)供试品测定：
将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用与步骤(5)中相同的色谱柱，取步骤(2)制备的供试品溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到供试品色谱图，液相色谱分析条件与步骤(5)中校准曲线II制备的液相色谱条件相同；
(7)供试品分子量计算：
根据步骤(6)得到的供试品色谱图以及步骤(5)得到的校准曲线II，计算得到分子量结果，所述分子量结果包括Mw、Mn、Mp、Mz；
所述流动相为硝酸锂或乙酸铵溶液，优选0.1-0.5M硝酸锂溶液，优选0.05～0.5M乙酸铵；优选流动相为乙酸铵溶液。
在上述技术方案中，步骤(1)中所述酶解的方法为：
将HA或CS溶解在80～120mM醋酸钠/130～170mM NaCl中，调节pH至5.0～5.4，加入透明质酸酶35～39℃温育1.5～2.5小时，停止反应，离心去除变性蛋白质，沉淀解聚的HA或CS，洗涤去除盐，干燥，得到部分解聚的HA和CS；
优选所述醋酸钠/NaCl溶液中HA或CS的浓度为23～25g/L。
优选地，透明质酸酶的使用量为每克HA使用20～4000mg透明质酸酶，每克CS使用10～200mg透明质酸酶；采用乙醇沉淀解聚的HA或CS并用乙醇洗涤；
优选所述透明质酸酶为400-1000单位/mg；
优选每克HA使用60～180mg或80～140mg或100～120mg透明质酸酶；
优选每克CS使用15～140mg或20～80mg或25～50mg或32～40mg透明质酸酶。
优选地，所述校准物溶液及供试品溶液的浓度为1～30mg/ml，优选6～20mg/ml或8～12mg/ml或10mg/ml。
在上述技术方案中，所述低分子量是指质量平均相对分子质量小于8000，并且分子量小于8000的级分不低于60％。
优选地，液相色谱分析采用的色谱柱是Shodex protein kw-800系列凝胶柱；
步骤(3)中液相色谱分析采用两根或三根或四根色谱柱串联：
两根色谱柱串联是指采用KW803+KW802.5串联；
三根色谱柱串联是指采用KW803+KW803+KW802.5串联；
四根色谱柱串联是指采用KW804+KW803+KW803+KW802.5或者KW803+KW803+KW803+KW802.5串联；优选KW803+KW803+KW803+KW802.5串联。
在上述技术方案中，所述步骤(4)中获得标准校准表II的具体方法是：基于校准曲线I及校准物的凝胶渗透色谱图I，在MW 400-18500范围内选取5-30个MW，优选10-20个，选取的若干个MW，它们的分子量从小到大间隔排列，相邻的两个MW的分子量大小相差400-3000；通过GPC软件的切片功能，找到每个MW对应的累积峰面积百分比，从而生成MW与其对应的累积峰面积百分比的标准标准表II。
在上述技术方案中，步骤(5)和步骤(6)中液相色谱分析采用的色谱柱是ShodexKW802.5；
色谱分析的洗脱液为乙酸铵溶液。
在上述技术方案中，步骤(3)的步骤②中所述单分散寡糖分子的绝对分子量是将步骤(1)中制备的校准物溶液采用HPLC结合MS进行分析得到的，或者通过所得到的校准物的RT-RI色谱图的锯齿状窄峰的峰形、数目、起始位置分析得到。使用透明质酸酶酶解得到的低分子GAG的最小级分是四糖，GPC分析时保留时间最长的锯齿状峰(不包括溶剂峰)即是四糖的峰。由于锯齿峰都为偶数个寡糖的峰，因此锯齿峰从左到右可以依次归属为4，6，8，10…寡糖，这些寡糖的结构是明确的，其MW也是明确的。因此就可以根据所得到的校准物的RT-RI色谱图的锯齿状窄峰的峰形、数目、起始位置结合这些已知知识分析得到单分散寡糖分子的绝对分子量。
在上述技术方案中，所述凝胶渗透色谱图是采用GPC分析软件得到的；
所述校准曲线I和校准曲线II是采用GPC软件或者其他常规数据分析软件，拟合三次方程建立得到；
所述步骤(7)中利用GPC软件计算得到分子量结果；
所述凝胶渗透色谱图I和凝胶渗透色谱图II为RT-RI色谱图。
名词术语:
峰面积：指峰高与保留时间的积分值。
本发明的有益效果是：
本发明解决了目前没有通用的且实用的低分子量CS和HA的测定方法的技术问题。本发明方法在校准时采用两根或三根或四根或更多色谱柱串联，测定时用单柱普通条件即可。采用多色谱柱串联，可以分辨出更多的锯齿状峰，分子量的可信范围大大增加。而由于采用多柱串联其测试时间太长，柱压较高，对柱子损害较大，基于发明人验证的分子量与其对应的峰面积百分比的关系在多柱串联和单柱测定时是固定的假设，确立了分子量与其对应的峰面积百分比的关系之后，推算建立出一根柱条件下的标准曲线，在供试品测定时可以在单柱普通条件下进行。
相较于采用肝素作为标准品，由于肝素结构比较复杂，选用的分子量间隔是600，是一个约数。但是透明质酸(HA)和软骨素(CS)结构较单一，所以分子量会更精确。
本发明方法简单、可靠，在整个校准和测定过程中，唯一需要的仪器是带有RI检测器的GPC，不需要昂贵的仪器，如MALLS、MS、UV检测器。此外，MW校准物的制备非常容易且便宜，仅使用市售的透明质酸酶来酶解HA或CS，或者使用低分子量Hep标准物质。最重要的是，我们已经证明了这种方法的可靠性。标准曲线的相关系数高于0.9999，置信MW范围足够宽，最高的HA、CS、Hep的置信度MW分别不低于14490、14663、14400，可以覆盖LMW-HA、LMW-CS、LWM-Hep的MW范围。至关重要的是，仅使用一根色谱柱几乎不会影响测量结果，这将每个样品的测量时间缩短到仅不到30分钟。尽管缺乏直接参考，但其他手段包括与LMW-Hep的药典测定结果对照、MALLS检测器、手动MW计算，表明我们方法的结果是可靠的。本发明方法还被证明是一种测量非常低MW HA/CS的好方法，在LMW-HA和LMW-CS行业具有很好的实用性和可用性。
附图说明
图1是CSMC的不同色谱柱串联组合的GPC色谱图(A:KW802.5；C:KW803+KW802.5；E:KW803+KW803+KW802.5；G:KW804+KW803+KW803+KW802.5；I:KW803+KW803+KW803+KW802.5)以及对左侧色谱图中虚线之间的部分的一阶导数(B、D、F、H、J)。图2是以Na2SO4为洗脱液盐的CS(A)和HA(B)的Δdp2峰以及以NH4OAc为洗脱液盐的CS(C)和HA(D)的Δdp2峰附近的GPC色谱图的扩展部分。
图3是HAMC(A)和CSMC(B)在四根色谱柱的优化条件下获得的GPC色谱图，虚线框内的部分被转换为插图中的一阶导数。
图4是HAMC的a峰和b峰的质谱图。
图5是CSMC的a峰和b峰的质谱图。
图6是四柱条件下HMC、亭扎肝素、帕肝素、依诺肝素和达肝素的GPC色谱图，虚线框内的HMC部分被转换为插图中的一阶导数。
图7是HAMC、CSMC和HMC的校准曲线I。
图8是HAMC和CSMC的校准曲线II(A.)；HMC校准曲线II和根据HMC的ChP方法构建的校准曲线(HMC ChP)(B.)。
图9是使用一根色谱柱的方法获得的具有eHA-1(A)、eCS-1(B)、eHA-2(C)、oHA-2(D)、oCS-1(E)的峰积分的GPC色谱图，和通过使用四根色谱柱的方法获得的具有eHA-1(F)的峰积分的GPC色谱图。
图10是eHA-1(A)和eCS-1(B)的GPC-MALLS和RI色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用试剂和材料，如无特殊说明，均为本领域常规试剂和材料，均可通过商购获得。
本发明提供的一种凝胶渗透色谱法测定低分子量糖胺聚糖的分子量的方法，所述糖胺聚糖为透明质酸或者硫酸软骨素或者肝素，低分子量是指质量平均相对分子质量小于8000，并且分子量小于8000的级分不低于60％。本实施例中液相色谱分析采用的色谱柱是Shodex protein kw-800系列凝胶柱。
按照如下步骤操作：
(1)校准物溶液的制备
HA或CS校准物溶液：采用透明质酸酶或软骨素酶酶解HA或CS，得到部分解聚的HA和CS，用流动相配制为校准物溶液；优选采用透明质酸酶酶解；
Hep校准物溶液：采用常规Hep标准物质配制；
校准物溶液的浓度为1～30mg/ml。
酶解的方法为：将HA或CS溶解在80～120mM醋酸钠/130～170mM NaCl中，调节pH至5.0～5.4，醋酸钠/NaCl溶液中HA或CS的浓度为23～25g/L，加入透明质酸酶35～39℃温育1.5～2.5小时，停止反应，离心去除变性蛋白质，沉淀解聚的HA或CS，洗涤去除盐，干燥，得到部分解聚的HA和CS。透明质酸酶的使用量为每克HA使用20～4000mg透明质酸酶，每克CS使用10～200mg透明质酸酶；采用乙醇沉淀解聚的HA或CS并用乙醇洗涤；透明质酸酶为400-1000单位/mg。
(2)供试品溶液的配制：将LMW-HA或LMW-CS或LMW-Hep供试品用流动相配制为供试品溶液；供试品溶液的浓度为1～30mg/ml。
(3)基于寡糖的锯齿状色谱峰获得校准曲线I：
①将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用至少两根色谱柱串联，取制备的校准物溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到校准物溶液的锯齿状凝胶渗透色谱图I(RT-RI色谱图)。
所述色谱柱中，其中一根色谱柱的蛋白质分子量线性分析范围为5000-150000，其余色谱柱的蛋白质分子量线性分析范围为10000-700000；
液相色谱分析条件为：
流动相流速：0.1～1.0ml/min，优选0.3～0.5ml/min或者0.40ml/min；
柱温：25～45℃或者30～40℃或者32～37℃，优选35℃；
进样量：1～100ul，优选10～60ul或15～35ul或20～30ul或25ul；
优选地，液相色谱分析采用两根或三根或四根色谱柱串联：
两根色谱柱串联是指采用KW803+KW802.5串联；
三根色谱柱串联是指采用KW803+KW803+KW802.5串联；
四根色谱柱串联是指采用KW804+KW803+KW803+KW802.5或者KW803+KW803+KW803+KW802.5串联；优选KW803+KW803+KW803+KW802.5串联。
②获得单分散寡糖的绝对MW和对应的RT的标准表I：步骤①得到的凝胶渗透色谱图I，其中的锯齿状峰的每一个峰即对应一个单分散寡糖，将每一个峰对应的保留时间RT和该峰对应的单分散寡糖分子的绝对分子量对应起来即生成标准表I。
单分散寡糖分子的绝对分子量是将步骤(1)中制备的校准物溶液采用HPLC结合MS进行分析得到的，或者通过所得到的校准物的RT-RI色谱图的锯齿状窄峰的峰形、数目、起始位置分析得到。使用透明质酸酶酶解得到的低分子GAG的最小级分是四糖，GPC分析时保留时间最长的锯齿状峰(不包括溶剂峰)即是四糖的峰。由于锯齿峰都为偶数个寡糖的峰，因此锯齿峰从左到右可以依次归属为4，6，8，10…寡糖，这些寡糖的结构是明确的，其MW也是明确的。因此就可以根据所得到的校准物的RT-RI色谱图的锯齿状窄峰的峰形、数目、起始位置结合这些已知知识分析得到单分散寡糖分子的绝对分子量。
③用得到的标准表I，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，采用GPC软件拟合三次方程建立分子量MW-保留时间RT标准曲线，即获得校准曲线I。
(4)获得标准校准表II
基于校准曲线I及校准物的凝胶渗透色谱图I，在MW 400-18500范围内选取5-30个MW，优选10-20个，选取的若干个MW，它们的分子量从小到大间隔排列，相邻的两个MW的分子量大小相差400-3000；通过GPC软件的切片功能，找到每个MW对应的累积峰面积百分比，从而生成MW与其对应的累积峰面积百分比的标准标准表II。
(5)重新进行凝胶色谱分析，并推导获得MW vs.RT的校准曲线II
将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用单根色谱柱(Shodex KW802.5)，取制备的校准物溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到校准物溶液的凝胶渗透色谱图II(RT-RI色谱图)；
所述色谱柱的球蛋白质分子量线性分析范围为5000-150000；
液相色谱分析条件为：
流动相流速：0.1～1.5ml/min，优选0.4～0.6ml/min或者0.5ml/min；
柱温：25～45℃或者30～40℃或者32～37℃，优选35℃；
进样量：1～100ul，优选10～60ul或15～35ul或20～30ul或25ul；
通过GPC软件的切片功能，计算凝胶渗透色谱图II中校准物的每个点的累积峰面积百分比，确定与标准校准表II中累积峰面积百分比最接近点的保留时间及对应的分子量，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，采用GPC软件拟合三次方程建立得到分子量MW-保留时间RT标准曲线，即校准曲线II。
(6)供试品测定：
将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用与步骤(5)中相同的色谱柱，取步骤(2)制备的供试品溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到供试品色谱图，液相色谱分析条件与步骤(5)中校准曲线II制备的液相色谱条件相同。
(7)供试品分子量计算：
根据步骤(6)得到的供试品色谱图以及步骤(5)得到的校准曲线II，利用GPC软件计算得到分子量结果，所述分子量结果包括Mw、Mn、Mp、Mz。
在上述方法中，流动相为硝酸锂或乙酸铵溶液，优选0.1-0.5M硝酸锂溶液，优选0.05～0.5M乙酸铵；优选流动相为乙酸铵溶液。色谱分析的洗脱液为乙酸铵溶液。
在本实施例方法中，凝胶渗透色谱图是采用GPC分析软件得到的。
实施例1
1 材料和方法
1.1 材料
CS A(硫酸软骨素A)和HA购自上海源叶生物科技有限公司(中国)。用于分子量校准的低分子量肝素购自中国食品药品检定研究院(中国北京)。依诺肝素(enoxapari)、达肝素(dalteparin)、帕肝素(parnaparin)和亭扎肝素(tinzaparin)购自欧洲药典(EP)标准。酶促合成的LMW-HA和LMW-CS样品分别表示为eHA和eCS。eHA-1和eCS-1获自青岛万源山生物科技有限公司(中国)。eHA-2购自华熙生物科技有限公司(中国北京)。本研究中使用的其他化学品购自Sigma-Aldrich Reagent,Co.(美国)。
1.2透明质酸酶制备部分解聚的HA和CS
HA(1.0g)以25g/L溶解在100mM醋酸钠/150mM NaCl中，用醋酸调节至pH 5.2，并在37℃下与110mg透明质酸酶(I-S型，400-1000单位/mg)一起温育2小时。通过煮沸10分钟停止反应。将样品在5℃下以10 000g离心30分钟以去除变性蛋白质。通过向上清液中加入三倍体积的乙醇沉淀解聚的HA，并在乙醇中洗涤以除去盐。将沉淀真空干燥以获得白色粉末状产物(910mg，91％产率)。CS的降解以类似方式进行，但透明质酸酶的剂量为36mg。
1.3GPC分析
GPC是在Shimadzu LC-20AD HPLC(Shimadzu，Kyoto，日本)上进行的，与RI检测器(RID-20A，Shimadzu，Kyoto，日本)结合使用。使用了Shodex protein kw-800系列凝胶柱(Shodex，日本)、KW802.5(8.0×300mm)、KW803(8.0×300mm)和KW804(8.0×300mm)。使用0.2M硫酸钠或0.1M乙酸铵作为洗脱液。使用一根或两根色谱柱时流速为0.5ml/min，使用三根或四根色谱柱时流速为0.4ml/min。柱温为35℃。以10mg/ml取样，每个样品注入25ul。
对于含有游离硫酸盐杂质的样品，在GPC测试之前，通过使用BaCl2沉淀除去硫酸根离子。将20ul BaCl2(500mg/ml)溶液加入1ml待测样品中，混合并放置过夜，然后以12000g离心去除沉淀。
1.4单分散寡糖的制备及LC-MS分析
采用半制备型强阴离子交换(SAX)-HPLC分离单分散寡糖。使用从0.2到2M NaCl(pH 4)的60分钟线性梯度以3.0ml/min的流速从柱子(9.4×250mm,Zorbax SAX,Agilent,USA)中洗脱样品。通过215nm处的吸光度监测洗脱曲线。汇集主要峰并冷冻干燥，然后在Superdex 30柱(10/300GL，Cytiva，Sweden)上脱盐。
纯化的HA和CS寡糖级份通过反相离子配对-HPLC结合ESI MS进行分析，ESI MS方法参考文献“Volpi,N.(2007).On-Line HPLC/ESI-MS Separation and Characterizationof Hyaluronan Oligosaccharides from 2-mers to 40-mers.Analytical Chemistry,79(16),6390-6397”。在Eclipse Plus C18柱(Agilent Technologies，USA)上进行HPLC分离。使用Agilent 1520q-tof(Agilent Technologies,USA)获得ESI质谱。
1.5LMW-HA和LMW-CS样品的制备
为了避免像二糖和四糖这样的非常低分子量的片段的损失，所有的低分子GAG制备都没有进行透析步骤。
通过酸解制备的LMW-HA和LMW-CS样品分别表示为aHA和aCS。将1g CS溶解在50mL0.4M HCl水溶液中，并在磁力搅拌下在65℃下孵育24h。用NaOH将溶液调节至pH 7，并浓缩至10ml。加入3倍体积的乙醇沉淀产物，用乙醇重复洗涤3次。将产物真空干燥，得到灰棕色粉末，为aCS-1(518mg，51.8％产率)。以相同方式获得aHA-1，得到白色粉末(450mg，45％产率)。
通过氧化解聚制备的LMW-HA和LMW-CS样品分别表示为oHA和oCS。oCS-1的制备方法为：将1g CS和30mg FeSO4七水合物溶解在20mL去离子水中，并在溶液中加入0.15mL30％过氧化氢；将溶液在磁力搅拌下在50℃下孵育10小时；然后，用三倍体积的乙醇沉淀样品并通过离心(8000rpm)收集，并用乙醇重复洗涤3次；将沉淀真空干燥，得到浅棕色粉末，为oCS-1(825mg，82.5％产率)。其他是按照类似的方法用不同量的过氧化氢合成的。oCS-2和oCS-3分别用0.1ml和0.25ml H2O2(30％)获得。oHA-1和oHA-2分别用0.25ml和0.15mlH2O2(30％)获得。
1.6GPC-MALLS分析
GPC-MALLS分析是使用AKTApurifierTM 10(GE Healthcare,PA,USA)结合WyattDAWN HELEOS 18角激光光散射检测器和Wyatt Optilab T-rEX差示折光仪(WyattTechnologies Corp.,Goleta,CA,美国)进行的。使用的色谱柱是Shodex KW802.5。流动相为0.1M乙酸铵。流速为0.5mL/min。进样量为100μL(10mg/ml)。使用的折射率(dn/dc)对于CS为0.14，对于HA为0.17。
1.7手动MW计算
对于使用四根串联色谱柱获得的eHA-1色谱图，峰完全分离，每个峰对应于具有明确的MW的多糖分子。
Mw由以下公式计算：
Mn由以下公式计算：
其中RIi是洗脱峰i的折射率；Mi是对应于峰i的MW。
2结果
目前LMW-HA和LMW-CS的MW分布定义不明确，因此我们需要在研究开始时定义MW分布范围。借用欧洲药典(EP)和中国药典(Chp)中LMW-Hep的定义，我们定义了LMW-HA和LMW-CS的质量平均相对分子质量小于8000，并且总质量的至少60％的相对分子质量小于8000。
2.1候选校准物的制备和GPC方法的参数优化
候选校准物是部分解聚的HA和CS，它们分别通过市售HA和CSA的部分酶促降解获得。如前所述，校准曲线的建立是基于GPC谱的锯齿状寡糖峰，因此曲线的MW覆盖率和可靠性完全取决于锯齿状峰的分辨率。
为了提高分辨率，预先评估了透明质酸酶剂量的效果。
GPC分析在Shodex KW 802.5色谱柱上进行，以0.2M硫酸钠作为流动相。
结果表明，不同剂量对峰分辨率的影响不大，所有条件对HA和CS的低分子量低聚糖都有足够的分辨率，而对高分子量低聚糖则没有。考虑到与LMW-肝素的结构相似性，选择与LMW-肝素参考标准具有相似RT的部分解聚HA和CS作为以下研究的校准物。此处使用的LMW-肝素参考标准是ChP的用于分子量校准的低分子量肝素(简称为HMC)，它具有宽MW分布并提供标准表(BST)。HA校准物和CS校准物分别被命名为透明质酸分子量校准物(HAMC)和硫酸软骨素分子量校准物(CSMC)。
为了在GPC中获得更大寡糖分子的更多分离峰，加入了具有更大排除限的KW803和KW804色谱柱。图1展示了LMW-CS不同色谱柱组合的GPC色谱图，两者均显示锯齿状峰随着MW的增加而逐渐减小。对于难以直接区分的部分，通过一阶导数的变换可以挑出峰。图1中右侧的图是对GPC图谱中虚线之间标记的部分的一阶导数的转换图。仅使用KW802.5时可以识别大约12个峰(图1A、B)，当在KW802.5前面连接一个KW803时可以清楚地区分第13到第20个峰(图1C、D)。当添加第二个KW 803时，分辨的最大峰增加到大约26个(图1E、F)。为了进一步分离较大的寡糖，KW804连接在两个KW803和一个KW802.5的前面，但出乎意料的是，它的峰减少到约23个(图1G，H)。当连接另一个KW803而不是KW804(组件的第三个KW803)时，识别出29个峰(图1I、J)，仅比图1E多3个峰。
此外，在图1I中，色谱图的末端锯齿峰为四糖(dp4)峰，这是由透明质酸酶产生的最小级分，其与硫酸钠的峰存在部分重叠。可以预见的是，硫酸钠对低分子量HA或CS的分子量计算造成严重影响。通过评估双糖(dp2)峰和盐峰的RT，优化了洗脱液中盐的类型。通过软骨素酶ABC获得部分解聚的CS和HA，在用于图1I的相同条件下，获得其GPC色谱图。图2A显示了CSΔdp2峰局部放大的GPC色谱图部分，该峰是被软骨素酶ABC部分解聚的CS的主要部分，但几乎与硫酸钠峰重叠。HA Δdp2的峰值显示出更长的RT，如图2B所示。优化了流动相的盐类。当醋酸铵用作具有较小分子尺寸的替代盐时，二糖和盐的峰完全分离(图2C和D)。重要的是，较高寡糖的分辨率不受乙酸铵的影响。此外，还评估了其他GPC色谱条件，包括25至45℃的柱温、样品浓度和进样量，但证明对分离度提高没有明显影响。
2.2使用锯齿峰生成校准曲线
图3a-b分别描绘了在优化条件下进行的HAMC和CSMC的RI曲线。两种曲线都整体呈宽丘状，宽丘表面有许多尖锐的锯齿峰。随着运行时间的推移，锯齿状的峰从靠近丘顶的地方开始变得明显，到顶后逐渐变大、分离。为了确保每个峰的绝对分子量，扫描结束时的两个峰(图3中标记的a和b)被分离并通过LCMS进行分析。在峰谱中，在m/z＝775.3处观察到一部分HAMC(图4)阴离子，接近HAdp4的去质子化盐的计算值[(M-H)-＝775.23)]。在m/z＝576.7处观察到峰b的信号，对应于HA dp6[(M-2H)2-＝576.67]。CSMC峰a和b的光谱如图5，可分别指定为CS dp4和dp6。现在可以清楚地识别校准物中的dp4和dp6峰，随后的峰以渐进方式跟随，因此可以指定八糖(dp8)及以上。虚线框包围了峰难以识别的部分，并将它们转化为一阶导数(在图3的插图中)。变换后，曲线的波浪变得更加明显。对于无法直接辨别出的寡糖峰，从峰到谷的中间点被作为其RT。
鉴定的寡糖峰及其相应的MW和RT列于表1的校准表I中。由于寡糖呈钠盐形式，因此MW含有钠离子。Δdp2的RT也被填充，通过在相同条件下运行软骨素酶降解的寡糖获得。如图3所示，至少可以识别72个HA糖单元(HA dp72)和58个CS糖单元(CS dp58)，它们对应的MW分别为14454和14605，足以覆盖LMW-HA和LMW-CS的MW范围。图3中红点线之间的部分表示可以清楚识别MW的区域。
表1.鉴定的寡糖峰的绝对MW和RT
HMC在GPC上运行，色谱条件与HAMC和CSMC完全相同(图6)。众所周知，LMW-Hep的MW测定已被许多国家或组织的药典规定，并且测定结果已被众多研究很好地交叉验证。由于基本的结构相似性，我们的方法的可靠性可以通过比较LMW-Hep的MW测量结果与药典方法的结果来间接检验。根据先前的报告，对LMW-Hep的MW分配从600开始，其余的以600为间隔递增的方式进行(也在表1中列出)。最大的可识别单元达到Hep-dp48，对应MW＝14400。
建立校准曲线(图7)，绘制MW的对数(y轴)与相应的RT(x轴)。发现所有曲线(称为曲线I)具有>0.999的高度相关系数，HAMC(0.99997)和CSMC(0.99995)的相关系数甚至更高。有趣的是，HAMC和CSMC的曲线显示出相似的形状，但HMC的曲线在较低的MW上略有偏移。
2.3基于曲线I的MW测定
对四种市售的LMW-Heps进行了GPC，叠加色谱图如图6所示。虚线之间的可靠MW区域几乎涵盖了依诺肝素、达肝素和帕肝素的所有MW分布范围(>99.0％)，和大约96.0％的亭扎肝素。因此，MW测定的可靠性被认为是高的。表2显示了基于HMC曲线I(表2中的方法A)的LMW-Hep的数均值(Mn)和重均值(Mw)分子量。
表2.三种方法得到的依诺肝素、达肝素、帕肝素和亭扎肝素的MW值
*注：A,曲线I；B,曲线II；C,ChP；
a.Mw误差是方法B和C获得的Mw之间的相对偏差。
分析LMW-HA和LMW-CS样品以确定MW。采用酸解、酶解和氧化解聚这三种制备LWM-GAG的主要方法制备样品，并对其进行不同程度的降解以获得不同的MW分布。其中，eCS-1、eHA-1、eHA-2为商业的酶解产品。LC-MS对其结构进行表征，发现eCS-1和eHA-2是从Δdp2开始的不饱和寡糖，eHA-1是从dp2开始的饱和寡糖。表3显示了LMW-HA和LMW-CS样品的两个MW值[即数均值(Mn)和重均值(Mw)]。在表3的结果中，可靠的MW区域覆盖了>96.2％的oCS-2，>92.0％的eHA-2，以及几乎所有其他样品的MW分布范围(>99.0％)。
表3.曲线I法、曲线II法和GPC-MALLS法得到的LMW-HA和LMW-CS样品的MW值
*注：ND：不确定。
2.4广泛标准校准表的生成和GPC系统的校准
目前使用四根GPC色谱柱的操作条件不太可能成为最终方法，因为测量时间长，每个样品测试时间长达135分钟。我们需要缩短运行时间并减少使用的GPC色谱柱数量。假定无论柱的类型和数量，MW与其对GPC积分面积的贡献的关系是不变的。基于校准曲线I，生成了一个MW与该MW的累积积分面积百分比的表格，如表4所示的校准表II。在该表中，选择了一组MW的值在600和18000之间的18个MW，与来自Chp的BST相同(也显示在表4中)。同样，选择了具有偶数寡糖的CS/HA的18个MW值，它们生成了HAMC/CSMC的BST。标准MC的色谱图在新条件下仅使用一根色谱柱(Shodex KW802.5)重新进行，运行时间为30分钟。使用表4中的BST，根据其对应的积分面积百分比确定色谱图中的RT，并推导出MW vs.RT的第二条校准曲线(称为曲线II)，这与目前广泛使用的BST方法一样被EP、ChP和USP等药典采用。所有这些曲线也给出了非常高的相关系数(>0.999)，而没有任何线性偏差。与曲线I一致，HAMC和CSMC的曲线II显示出相似的形状(图8A)。HMC的曲线II显示在图8B中，并且根据ChP方法也构建了HMC的校准曲线(图8B)。图中两条曲线上的点在<7200的MW高度重合。但在8400的较高MW上略有偏移，这可能由不同的计算方法产生。即便如此，HMC的曲线显示出与ChP曲线非常接近的形状。
表4.HAMC、CSMC、HMC标准校准表II
2.5基于曲线II的MW测定
以上测量的LMW样品在新条件下重新分析并使用曲线II计算MW值。图9显示了LMW-HA/CS样品的几个代表性色谱图，并显示了峰积分。对于表2和表3中的所有样品，通过曲线I和曲线II获得的Mw和Mn的MW值之间的差异非常小。因此，谱带展宽和柱效等不确定因素对MW与其GPC积分面积之间的关系影响不大。这一关键结果验证了我们的假设，即用于生成BST的候选校准物可以通过使用多个串联色谱柱的分离锯齿峰进行校准，并在普通GPC条件下分析样品；从而进一步提高该方法的实用性。
根据HMC的结果(表2)，通过曲线II测量MWs值，Mw、Mn、Mp(峰的MW)与ChP测量的一致性非常好。Mw的准确度在1.3％和2.0％之间变化。同时，结果与EP提供的值非常接近。MW分布也几乎没有观察到差异，特别是对于MW为<3000的链的百分比值，绝对差异仅为0.1-0.2％。曲线II的MW在3000到8000之间的百分比始终低于Chp，绝对差异也仅为1-2％，其对Mw或Mn的影响不太重要或可以忽略不计。
可以看出，我们研究中的方法给出了可靠的MW结果。此外，我们认为在测定LMW-HA和LMW-CS时可能更准确，因为用于校准的HAMC和CSMC的MW值更明确，而不是使用600的整数倍作为肝素的近似MW值。
由于缺乏商业LMW-CS或LMW-HAMW标准，这些MW结果由GPC-MALLS额外确认，获得的Mw以及误差范围也列在表3中。对于除eHA-1和eCS-1之外的大多数样品，GPC-MALLS测得的MW值接近曲线II结果。对于主要包含非常低的MW(<1000)分数的样品eHA-1和eCS-1，MALLS出乎意料的高误差范围表明MALLS的测试结果不太可能是有效的。eHA-1和eCS-1的色谱图如图10所示，其中GPC-MALLS和GPC-RI重叠。仪器软件获得的MALLS的典型摩尔质量与洗脱时间关系图也在该图中，其线性很差。不寻常的结果反映了MALLS检测器对非常低MW分子的低灵敏度。同样，表中其他GPC-MALLS的结果始终略高于GPC结果，这也可能源于MALLS对极低MW寡糖的低估，这与之前许多报道的结果一致。因此，表明GPC-MALLS在测量极低MW的HA/CS的应用中可能不是理想的测量仪器。实际上，非常低的MW的HA/CS往往受到许多化妆品公司的青睐，因为他们声称低于1000的分子由于其分子尺寸较小，更有利于被皮肤吸收和利用。我们使用GPC软件根据曲线II计算了图9中一些特征峰的MW，获得的结果(在图9A-C中标记)与理论MW值非常一致。此外，在四柱条件下，eHA-1的峰完全分离(图9F)。因此我们完全能够根据公式(1)和(2)手动计算Mw和Mn。表5中提供了每个标记峰的积分面积百分比值和理论MW。计算出的Mw＝971和Mn＝826与表3中的结果非常吻合。从通过多种方式获得的这些结果来看，使用我们的方法测量低MW HA/CS的值与预期的一样可靠。
表5.每个标记峰的积分面积百分比值和理论MW
3分析与结论
在本研究中，一种简单而可靠的测定LMW-HA/CS/Hep分子量的方法已成功开发和验证。在整个校准和测定过程中，唯一需要的仪器是带有RI检测器的GPC，不需要昂贵的仪器，如MALLS、MS甚至UV检测器。此外，MW校准物的制备非常容易且便宜，仅使用市售的透明质酸酶来酶解HA或CS。最重要的是，我们已经证明了这种方法的可靠性。标准曲线的相关系数高于0.9999，置信MW范围足够宽，可以覆盖LMW-HA和LMW-CS的MW范围。至关重要的是，仅使用一根色谱柱几乎不会影响测量结果，这将每个样品的测量时间缩短到仅不到30分钟。尽管缺乏直接参考，但其他手段包括LMW-Hep测定、MALLS检测器、手动MW计算，表明我们方法的结果是可靠的。此外，它已被证明是一种测量非常低MW的好方法。本研究方法在LMW-HA和LMW-CS行业具有很好的实用性和可用性。
Claims (10)
1.一种凝胶渗透色谱法测定低分子量糖胺聚糖的分子量的方法，其特征在于，所述糖胺聚糖为透明质酸或者硫酸软骨素或者肝素，包括如下步骤：
(1)校准物溶液的制备
HA或CS校准物溶液：采用透明质酸酶或软骨素酶酶解HA或CS，得到部分解聚的HA和CS，用流动相配制为校准物溶液；优选采用透明质酸酶酶解；
Hep校准物溶液：采用常规Hep标准物质配制；
(2)供试品溶液的配制：将LMW-HA或LMW-CS或LMW-Hep供试品用流动相配制为供试品溶液；
(3)基于寡糖的锯齿状色谱峰获得校准曲线I：
①将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用至少两根凝胶渗透色谱柱串联，取制备的校准物溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到校准物溶液的锯齿状凝胶渗透色谱图I；
所述色谱柱中，其中一根色谱柱的蛋白质分子量线性分析范围为5000-150000，其余色谱柱的蛋白质分子量线性分析范围为10000-700000；
液相色谱分析条件为：
流动相流速：0.1～1.0ml/min，优选0.3～0.5ml/min或者0.40ml/min；
柱温：25～45℃或者30～40℃或者32～37℃，优选35℃；
进样量：1～100ul，优选10～60ul或15～35ul或20～30ul或25ul；
②获得单分散寡糖的绝对MW和对应的RT的标准表I：步骤①得到的凝胶渗透色谱图I，其中的锯齿状峰的每一个峰即对应一个单分散寡糖，将每一个峰对应的保留时间RT和该峰对应的单分散寡糖分子的绝对分子量对应起来即生成标准表I；
③用得到的标准表I，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，拟合分子量MW-保留时间RT标准曲线，即获得校准曲线I；
(4)获得标准校准表II
基于校准曲线I及校准物的凝胶渗透色谱图I，在MW 400-18500范围内选取若干个MW，通过GPC软件的切片功能，找到每个MW对应的累积峰面积百分比，从而生成MW与其对应的累积峰面积百分比的标准标准表II；
(5)重新进行凝胶色谱分析，并推导获得MW vs.RT的校准曲线II
将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用单根色谱柱，取制备的校准物溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到校准物溶液的凝胶渗透色谱图II；
所述色谱柱的球蛋白质分子量线性分析范围为5000-150000；
液相色谱分析条件为：
流动相流速：0.1～1.5ml/min，优选0.4～0.6ml/min或者0.5ml/min；
柱温：25～45℃或者30～40℃或者32～37℃，优选35℃；
进样量：1～100ul，优选10～60ul或15～35ul或20～30ul或25ul；
通过GPC软件的切片功能，计算凝胶渗透色谱图II中校准物的每个点的累积峰面积百分比，确定与标准校准表II中累积峰面积百分比最接近点的保留时间及对应的分子量，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，拟合分子量MW-保留时间RT标准曲线，建立校准曲线II；
(6)供试品测定：
将HPLC仪与RI检测器联合使用，采用与步骤(5)中相同的色谱柱，取步骤(2)制备的供试品溶液注入HPLC仪进行液相色谱分析，得到供试品色谱图，液相色谱分析条件与步骤(5)中校准曲线II制备的液相色谱条件相同；
(7)供试品分子量计算：
根据步骤(6)得到的供试品色谱图以及步骤(5)得到的校准曲线II，计算得到分子量结果，所述分子量结果包括Mw、Mn、Mp、Mz；
所述流动相为硝酸锂或乙酸铵溶液，优选0.1-0.5M硝酸锂溶液，优选0.05～0.5M乙酸铵；优选流动相为乙酸铵溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述酶解的方法为：
将HA或CS溶解在80～120mM醋酸钠/130～170mM NaCl中，调节pH至5.0～5.4，加入透明质酸酶35～39℃温育1.5～2.5小时，停止反应，离心去除变性蛋白质，沉淀解聚的HA或CS，洗涤去除盐，干燥，得到部分解聚的HA和CS；
优选所述醋酸钠/NaCl溶液中HA或CS的浓度为23～25g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
透明质酸酶的使用量为每克HA使用20～4000mg透明质酸酶，每克CS使用10～200mg透明质酸酶；采用乙醇沉淀解聚的HA或CS并用乙醇洗涤；
优选所述透明质酸酶为400-1000单位/mg；
优选每克HA使用60～180mg或80～140mg或100～120mg透明质酸酶；
优选每克CS使用15～140mg或20～80mg或25～50mg或32～40mg透明质酸酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述校准物溶液及供试品溶液的浓度为1～30mg/ml，优选6～20mg/ml或8～12mg/ml或10mg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述低分子量是指质量平均相对分子质量小于8000，并且分子量小于8000的级分不低于60％。
6.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
液相色谱分析采用的色谱柱是Shodex protein kw-800系列凝胶柱；
步骤(3)中液相色谱分析采用两根或三根或四根色谱柱串联：
两根色谱柱串联是指采用KW803+KW802.5串联；
三根色谱柱串联是指采用KW803+KW803+KW802.5串联；
四根色谱柱串联是指采用KW804+KW803+KW803+KW802.5或者KW803+KW803+KW803+KW802.5串联；优选KW803+KW803+KW803+KW802.5串联。
7.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中获得标准校准表II的具体方法是：基于校准曲线I及校准物的凝胶渗透色谱图I，在MW 400-18500范围内选取5-30个MW，优选10-20个，选取的若干个MW，它们的分子量从小到大间隔排列，相邻的两个MW的分子量大小相差400-3000；通过GPC软件的切片功能，找到每个MW对应的累积峰面积百分比，从而生成MW与其对应的累积峰面积百分比的标准标准表II。
8.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(5)和步骤(6)中液相色谱分析采用的色谱柱是Shodex KW802.5；
色谱分析的洗脱液为乙酸铵溶液。
9.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)的步骤②中所述单分散寡糖分子的绝对分子量是将步骤(1)中制备的校准物溶液采用HPLC结合MS进行分析得到的，或者通过所得到的校准物的RT-RI色谱图的锯齿状窄峰的峰形、数目、起始位置分析得到。
10.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述凝胶渗透色谱图是采用GPC分析软件得到的；
所述校准曲线I和校准曲线II是采用GPC软件或者其他常规数据分析软件，拟合三次方程建立得到；
所述步骤(7)中利用GPC软件计算得到分子量结果；
所述凝胶渗透色谱图I和凝胶渗透色谱图II为RT-RI色谱图。
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