CN104483399A - 黄氏响声丸制剂的质量控制方法 - Google Patents
黄氏响声丸制剂的质量控制方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种黄氏响声丸制剂的质量控制方法，质量控制方法包括采用液相色谱法进行的含量测定，含量测定法中包括游离蒽醌与结合蒽醌、连翘酚、阿魏酸、甘草酸测定法，本发明质量控制方法，灵敏快捷，能准确及时地反映黄氏响声丸中非挥发性主要成分的质量，提高生产监控水平，在工业生产中更具有实际应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及黄氏响声丸制剂的质量控制方法。
技术背景
黄氏响声丸是根据著名喉科老中医黄莘农主任医师奉献的九代祖传秘方研制而成，可用于治疗急、慢性喉炎、声带小结、声带息肉初起、便秘等证。其质量标准收载于《中国药典》2010版一部第1064页，其中鉴别试验包括大黄、川芎、甘草，含量测定检测浙贝母中的贝母素甲和贝母素乙。
我国传统中药及中药制剂其质量控制方法多为显微鉴别、薄层鉴别与单一成分类型的含量测定，无法准确而全面的控制产品质量。中药制剂的多种成分及各种赋形剂会对质量检测带来多方面的干扰，样品的前处理程序若不进行科学的验证很可能会造成不准确的试验结果。所以寻找灵敏、准确、快捷和全面控制质量的检测方法，成为中药质量控制的关键。
本发明就是针对上述情况，在现有国家药典标准的基础上，利用液相色谱，制定了黄氏响声丸中主要非挥发性成分的质量控制方法。该制剂处方包括浙贝母、薄荷、酒大黄、连翘、川芎、蝉蜕、胖大海、儿茶、桔梗、诃子肉、甘草和薄荷脑十二种原材料中的有效成分。经查阅药典标准和文献药理资料，结合制剂中非挥发性成分的含量高低、药理活性及工艺生产中实际可操作性，本发明在已有的薄层色谱鉴别的基础上，采用高效液相色谱法对制剂中非挥发性成分进行含量控制，经过色谱条件的筛选，建立了酒大黄、连翘、川芎、甘草共四味药材有效成分的含量检测方法，对酒大黄中具有抗菌消炎疗效的游离蒽醌进行定量测定，还对结合蒽醌进行指标限制，兼顾了黄氏响声丸泻下的功效；对处方中抗炎抗菌效果极佳的连翘苷、阿魏酸和甘草酸进行含量测定，保证黄氏响声丸对急慢性咽喉炎的治疗效果。
发明内容
本发明公开了一种黄氏响声丸制剂的检测方法，其特征在于，包括以下成分的检测，游离蒽醌与结合蒽醌，连翘苷、阿魏酸和甘草酸，所述方法为高效液相色谱法，包括对照品溶液的制备，供试品溶液的制备，阴性对照溶液的制备，将对照品溶液和供试品溶液，阴性对照溶液注入谱仪测定，得到色谱图，根据色谱 图计算它们的含量。
其中所述游离蒽醌与结合蒽醌的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，取大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，取大黄酸对照品适量精密称定，加DMSO溶解后加甲醇制成每1ml含0.06mg的对照品溶液，取大黄酚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.08mg的对照品溶液.取大黄素甲醚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取1g黄氏响声丸加入体积比为5:1-1:1甲醇-盐酸混合液40-80ml后超声提取，取滤液用15-80ml氯仿萃取2-4次；合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，游离蒽醌样品：取1g黄氏响声丸加入30-100ml氯仿后回流提取30-60min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
阴性对照溶液的制备：取缺大黄药材的黄氏响声丸1g加入体积比为5:1-1:1甲醇-盐酸混合液40-80ml后超声提取，取滤液用15-80ml氯仿萃取2-4次；合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，游离蒽醌样品：取1g黄氏响声丸加入30-100ml氯仿后回流提取30-60min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
测定：分别吸取上述对溶液各10ul，注入液相色谱仪测定，根据色谱图计算分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的游离型及总蒽醌含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以30-70:70-30的乙腈-0.32％磷酸水溶液为流动相洗脱，检测波长为254nm，理论塔板数按大黄酚计算应不低于2000。
其中所述连翘苷的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.2mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取1g黄氏响声丸加入10-50ml甲醇后超声20-40min处理，过滤，取续滤液蒸至近干，取续滤液5-15ml加中性氧化铝0.5-3g拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(3-9g)上，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干， 残渣用流动相溶解，转移至容量瓶中定容即得，
阴性对照溶液的制备：取缺连翘药材的黄氏响声丸，加入10-50ml甲醇后超声20-40min处理，过滤，取续滤液蒸至近干，取续滤液5-15ml加中性氧化铝0.5-3g拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(3-9g)上，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至容量瓶中定容即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的连翘苷含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以16-26:84-74的乙腈-水为流动相，检测波长为277nm，理论塔板数按连翘苷计算应不低于2000。
其中所述阿魏酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量精密称定，加70％甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取1g黄氏响声丸加入10-50ml70％甲醇溶液后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺川芎药材的黄氏响声丸，加入10-50ml70％甲醇溶液后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以10-30:90-70的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相，检测波长为321nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000。
其中所述甘草酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.6mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取0.5g黄氏响声丸加入10-50ml流动相后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺甘草药材的黄氏响声丸，加入10-50ml流动相后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以20-40:80-60的乙腈-0.1％磷酸为流动相，检测波长为250nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000。
优选的，在蒽醌类含量测定中，液相色谱流动相梯度洗脱条件为：乙腈-0.32％磷酸水溶液38:62保持15分钟，调整为51:49，保持8分钟后调整为55:45，保持12分钟，总蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入体积比为3:1甲醇-盐酸混合液60ml后，超声提取2-3次，每次20min，合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml，合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得，游离蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入60ml氯仿后回流提取45min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得。
优选的，在连翘苷含量测定中，液相色谱流动相为乙腈-水21:79，供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入甲醇20ml，超声处理30min，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中定容即得。
优选的，在阿魏酸含量测定中，液相色谱流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液20:80，供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定后，加入20ml70％甲醇溶液后超声10min处理，过滤，取续滤液即得。
优选的，在甘草酸含量测定中，液相色谱流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液32:68，供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸0.5g，精密称定后，加入30ml流动相后超声20min处理，过滤，取续滤液即得。
本发明所述的检测方法，优选的，其中所述游离蒽醌与结合蒽醌的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，取大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，取大黄酸对照品适量精密称定，加DMSO溶解后加甲醇制 成每1ml含0.06mg的对照品溶液，取大黄酚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.08mg的对照品溶液.取大黄素甲醚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定，加入体积比为3:1甲醇-盐酸混合液60ml后，超声提取2-3次，每次20min，合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml，合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得，游离蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入60ml氯仿后回流提取45min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
阴性对照溶液的制备：取缺大黄药材的黄氏响声丸1g加入体积比为5:1-1:1甲醇-盐酸混合液40-80ml后超声提取，取滤液用15-80ml氯仿萃取2-4次；合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，游离蒽醌样品：取1g黄氏响声丸加入30-100ml氯仿后回流提取30-60min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
测定：分别吸取上述对溶液各10ul，注入液相色谱仪测定，根据色谱图计算分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的游离型及总蒽醌含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相梯度洗脱条件为：乙腈-0.32％磷酸水溶液38:62保持15分钟，调整为51:49，保持8分钟后调整为55:45，保持12分钟，
其中所述连翘苷的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.2mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定，加入甲醇20ml，超声处理30min，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中定容即得，
阴性对照溶液的制备：取缺连翘药材的黄氏响声丸，加入10-50ml甲醇后超声20-40min处理，过滤，取续滤液蒸至近干，取续滤液5-15ml加中性氧化铝 0.5-3g拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(3-9g)上，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至容量瓶中定容即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的连翘苷含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相为乙腈-水21:79，检测波长为277nm，理论塔板数按连翘苷计算应不低于2000，
其中所述阿魏酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量精密称定，加70％甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定后，加入20ml70％甲醇溶液后超声10min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺川芎药材的黄氏响声丸，加入10-50ml70％甲醇溶液后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液20:80，检测波长为321nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000，
其中所述甘草酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.6mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸0.5g，精密称定后，加入30ml流动相后超声20min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺甘草药材的黄氏响声丸，加入10-50ml流动相后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱 流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液32:68，检测波长为250nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程见实施例。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明在黄氏响声丸现有质量标准的基础上，采用高效液相色谱法，对制剂中非挥发性成分进行含量研究，增加了4个主要药效成分的含量测定方法，能有效控制处方中酒大黄、连翘、川芎和甘草四味药材的投料稳定性。
2.本发明采用同一流动相同时测定制剂中的总蒽醌含量及游离蒽醌含量，规定了游离蒽醌的含量及结合蒽醌的含量限度，同时兼顾了大黄在处方中的药效贡献，保证制剂疗效的有效性和稳定性，使质量控制更具现实意义。
3.本发明中结合蒽醌不是以具体的含量数据为控制限度，而是以含量的百分比为限度，这样就避免了高含量情况下，数值达到而百分比达不到的弊端，不论含量高低，其结合蒽醌与总蒽醌的比值可维持在一定限度范围内，从而保证疗效的稳定性。
4.本发明制备游离蒽醌和总蒽醌、连翘苷、阿魏酸和甘草酸等检测样品的制备方法，均通过试验验证，简便快捷而且能完整地从黄氏响声丸中提取出所需检测的化学成分，并通过快速可靠的高效液相色谱检测方法进行样品检测，更适用于中药现代化生产的时效性和质量监控的精准性。
5.该质量控制方法在现有质量标准基础上，进行了创新性的完善与提高，能准确及时地反映黄氏响声丸中非挥发性主要成分的质量，在工业生产中更具有实际应用意义，是对黄氏响声丸质量标准的有效补充。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚专属性图
图2芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚线性关系图
图3连翘苷专属性图
图4连翘苷线性关系图
图5阿魏酸专属性图
图6阿魏酸线性关系图
图7甘草酸专属性图
图8甘草酸线性关系图
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步地说明，以便对本发明作更详细的了解。
实施例1游离蒽醌和结合蒽醌的含量测定方法
1、色谱条件：
色谱仪：Waters H-class UPLC，色谱柱：Phonomenex Gemini-NX C18(150×4.6mm，5um)，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：乙腈-0.32％磷酸水溶液38:62保持15分钟，调整为51:49，保持8分钟后调整为55:45，保持12分钟，检测波长：254nm，进样量：10ul。
2、样品制备
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液。取大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液。取大黄酸对照品适量精密称定，加DMSO溶解后加甲醇制成每1ml含0.06mg的对照品溶液。取大黄酚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.08mg的对照品溶液.取大黄素甲醚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液。
供试品溶液制备：总蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入体积比为3:1甲醇-盐酸混合液60ml适量后，超声提取2次，每次20min，合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml。合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得。游离蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入60ml氯仿后回流提取，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得。
阴性对照溶液的制备：取按处方制备缺大黄药材的黄氏响声丸，按上述供试品溶液制备方法同法制成，即得。
空白：分别取2ml氯仿和2ml DMSO置于50ml容量瓶中，再用甲醇稀释、定容。分别精密吸取2ml置同一10ml容量瓶中，甲醇定容，即得空白对照。
3、专属性考察见附图1。结果表明：其他成分不干扰芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的检测。
4、定量限考察
将对照品储备液用甲醇多次稀释，信噪比S/N为10时，芦荟大黄素定量限为0.1080ug/ml、大黄酸定量限为0.2331ug/ml、大黄素定量限为0.1120ug/ml、大黄酚定量限为0.1106ug/ml、大黄素甲醚定量限为0.0416ug/ml。
5、精密度考察结果见附表1，结果表明仪器精密度良好。
附表1精密度考察结果
6、线性关系考察见图2，回归方程见表2。
附表2线性关系考察结果
7、重现性考察见附表3，结果表明本法测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量重复性良好。
附表3重现性考察结果
8、稳定性考察见附表4，表明供试品溶液在24小时内稳定。
附表4稳定性考察结果
9、回收率考察见附表5，结果表明加样回收率良好。
附表5回收率考察结果
10、样品测定
采用上述方法测定3批样品中游离蒽醌及总蒽醌的含量(以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量加和计)，结果见附表6。
附表6三批样品的总蒽醌、游离蒽醌含量及结合蒽醌含量限度检测结果
| 批号 | 总蒽醌mg/g | 游离蒽醌mg/g | 结合蒽醌％ |
| 130520 | 0.7666 | 0.2005 | 73.83％ |
| 130521 | 0.7543 | 0.2010 | 73.34％ |
| 130522 | 0.7575 | 0.1829 | 75.85％ |
实施例2连翘苷的含量测定方法
1、色谱条件：色谱仪：Waters H-class UPLC，色谱柱：Phonomenex Gemini-NX C18(150×4.6mm,5um)，柱温：40℃，流速：1.0ml/min，流动相：乙腈-水(21:79)，检测波长：277nm，进样量：10ul
2、样品制备
对照品溶液的制备：精密称取对照品连翘苷5.64mg置于25ml容量瓶中，流动相溶解、定容。即得对照品储备液(0.2150mg/ml)。
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，密塞，超声处理30min，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中定容即得。
测定：分别精密移取相同体积量的对照品溶液和供试品溶液进样，所吸取的体积量为1ul，即得供试品中的连翘苷含量，黄氏响声丸含连翘以连翘苷计，不得少于0.25mg/g。
阴性对照溶液的制备：取按处方制备缺连翘药材的黄氏响声丸，按上述供试品溶液制备方法同法制成，即得。
3、专属性考察见附图3。结果表明：阴性供试品对连翘苷无干扰，分离度大于1.5，达到基线分离。说明其他成分不干扰连翘苷的检测。
4、定量限考察
将对照品储备液用流动相稀释，信噪比S/N为10时，连翘苷定量限为0.8600ug/ml。
5、精密度考察结果见附表7，结果表明仪器精密度良好。
附表7精密度考察结果
6、线性关系考察见图4，回归方程为Y＝7118.1288X-3106.8940，r＝0.9997，结果表明连翘苷对照品浓度在17.1997-42.994ug/ml范围内呈现良好的线性关系。
7、重现性考察见附表8，结果表明本法测定连翘苷含量重复性良好。
附表8重现性考察结果
8、稳定性考察见附表9，结果表明供试品溶液在14小时内稳定。
附表9稳定性考察结果
9、回收率考察见附表10，结果表明加样回收率良好。
附表10回收率考察结果
10、样品测定
采用上述方法测定3批样品中连翘苷的含量，结果见附表11
附表11三批样品的连翘苷含量检测结果
| 批号 | 130520 | 130521 | 130522 |
| 含量(mg/g) | 0.3031 | 0.3071 | 0.2973 |
实施例3阿魏酸的含量测定方法
1、色谱条件：色谱仪：Waters H-class UPLC，色谱柱：Phonomenex Gemini-NX C18(150×4.6mm,5um)，柱温：35℃，流速：1.0ml/min，流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)，检测波长：321nm，进样量：10ul
2、样品制备
对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量精密称定，加70％甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定后，加入20ml70％甲醇溶液后超 声10min处理，过滤，取续滤液即得。
测定：分别精密移取相同体积量的对照品溶液和供试品溶液进样，所吸取的体积量为10ul，即得供试品中的阿魏酸含量，黄氏响声丸含川芎以阿魏酸计，不得少于0.04mg/g。
阴性对照溶液的制备：取按处方制备缺川芎药材的黄氏响声丸，按上述供试品溶液制备方法同法制成，即得。
3、专属性考察见附图5。结果表明：阴性供试品对阿魏酸无干扰，分离度大于1.5，达到基线分离。说明其他成分不干扰阿魏酸的检测。
4、定量限考察
将对照品储备液用70％甲醇多次稀释，信噪比S/N为10时，阿魏酸定量限为0.2436ug/ml。
5、精密度考察结果见附表12，结果表明仪器精密度良好。
附表12精密度考察结果
| 时间(次数) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰面积 | 131472 | 132192 | 132468 | 133533 | 132321 | 133442 | 0.59 |
6、线性关系考察见图6，回归方程为Y＝55345.6989X-3403.8571，r＝0.9997，结果表明阿魏酸对照品浓度在0.9580-4.7900ug/ml范围内呈现良好的线性关系。
7、重现性考察见附表13，结果表明本法测定阿魏酸含量重复性良好。
附表13重现性考察结果
8、稳定性考察见附表14，结果表明供试品溶液在14小时内稳定。
附表14稳定性考察结果
9、回收率考察见附表15，结果表明加样回收率良好。
附表15回收率考察结果
10、样品测定
采用上述方法测定3批样品中连翘苷的含量，结果见附表16。
附表16三批样品的阿魏酸含量检测结果
| 批号 | 130520 | 130521 | 130522 |
| 含量(mg/g) | 0.0525 | 0.0522 | 0.0536 |
实施例4甘草酸的含量测定方法
1、色谱条件：
色谱仪：Waters H-class UPLC，色谱柱：Phonomenex Gemini-NX C18(150×4.6mm，5um)，柱温：35℃，流速：1.0ml/min，流动相：乙腈-0.1％磷酸(32:68)，检测波长：250nm，进样量：10ul
2、样品制备
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸丸心，粉碎，过筛，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相30ml，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：精密称取对照品甘草酸铵17.90mg(对照品纯度93.10％)置于25ml容量瓶中，流动相溶解、定容。即得对照品储备液(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)C＝0.6531mg/ml。
阴性对照溶液的制备：取按处方制备缺甘草药材的黄氏响声丸，按上述供试品溶液制备方法同法制成，即得。
3、专属性考察见附图7。结果表明：阴性供试品对甘草酸无干扰，分离度大于1.5，达到基线分离。说明其他成分不干扰甘草酸的检测。
4、定量限考察
将对照品储备液用流动相稀释，信噪比S/N为10时，甘草酸定量限为1.4079ug/ml。
5、精密度考察结果见附表17，结果表明仪器精密度良好。
附表17精密度考察结果
6、线性关系考察见图8，回归方程为Y＝7835.5550X+22410.2840，r＝0.9996，结果表明甘草酸对照品浓度在39.1846-130.0615ug/ml范围内呈现良好的线性关系。
7、重现性考察见附表18，结果表明本法测定阿魏酸含量重复性良好。
附表18重现性考察结果
8、稳定性考察见附表19，结果表明供试品溶液在14小时内稳定。
附表19稳定性考察结果
9、回收率考察见附表20，结果表明加样回收率良好。
附表20回收率考察结果
10、样品测定
采用上述方法测定3批样品中甘草酸的含量，结果见附表21
附表21三批样品的阿魏酸含量检测结果
| 批号 | 130520 | 130521 | 130522 |
| 含量(mg/g) | 5.313 | 5.320 | 5.234 |
实施例5总蒽醌供试品的处理方法
总蒽醌的处理方法，主要考察了提取方式、提取时间、萃取次数，以确保即快捷又完全的提取出需要检测的样品成分。
1.提取方式的考察：
方式a：取本品1g，精密称定，加入体积比为4:1甲醇-盐酸混合液60ml适量后，超声提取2次，每次20min，合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml。合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得。
方式b：取本品1g，精密称定，加入50ml甲醇，超声提取2次，每次15min，过滤合并2次提取滤液，置水浴上蒸干。残渣用10％盐酸20ml溶解后用，用氯仿萃取3次，每次60ml。合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得。
实验结果见附表22，结果表明方法a和方法b提取无差异，但方法a较方法b简便快捷，采用甲醇-盐酸溶液混合直接提取，即节省时间、简化操作步骤，又保证了提取效果，因此选用方法a。
附表22提取方式考察结果
2.提取时间考察
平行称取本品3份，各1g，精密称定，置3个具塞锥形瓶中，加入体积比为5:1甲醇-盐酸混合液75ml适量后。第一份超声提取2次，每次15min，第二份超声提取2次，每次20min，第三份超声提取2次，每次25min。合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml。合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得，测定。
实验结果见附表23，结果表明超声提取20min，2次即可将大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚提取完成。
附表23提取时间考察结果
3.萃取次数考察
平行称取本品3份，各1g，精密称定，置3个具塞锥形瓶中，加入体积比为5:1甲醇-盐酸混合液75ml适量后，超声2次每次20min。合并提取液，分别用氯仿萃取2、3、4次，每次60ml。合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得，测定。
实验结果见附表24，结果表明萃取3次即可将大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚提取完成。
附表24萃取次数考察结果
实施例6连翘苷供试样品的处理方法
连翘苷供试品的处理，主要考察了洗脱溶剂的用量、提取方法、提取时间及提取溶剂的用量，以确保即快捷又完全的提取出需要检测的样品成分。
1.洗脱溶剂的用量考察
平行称取本品3份，各1g，精密称定，置3个具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，分别用70％乙醇20ml、30ml、40ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验结果见附表25，结果表明70％乙醇30ml即可将连翘苷洗脱下来。
附表25洗脱溶剂用量考察结果
| 提取方法 | 峰面积 | 含量(mg/g) |
| 70％乙醇20ml | 210971 | 0.2837 |
| 70％乙醇30ml | 226914 | 0.3007 |
| 70％乙醇40ml | 229947 | 0.3028 |
2.提取方法考察
平行称取本品2份，各1g，精密称定，一份置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30min，另一份置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，回流提取2h。两份提取液放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验结果见附表26，结果表明超声提取30min即可将连翘苷提取完全，且操作简便。
附表26提取方法考察结果
| 提取方法 | 峰面积 | 含量(mg/g) |
| 回流提取 | 228436 | 0.2998 |
| 超声提取 | 217547 | 0.2925 |
3.提取时间考察
平行称取本品3份，各1g，精密称定，置3个具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，分别超声处理20min、30min、40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。实验结果见附表27，结果表明超声处理30min即可将连翘苷提取完全。
附表27提取时间考察结果
| 提取方法 | 峰面积 | 含量(mg/g) |
| 超声20min | 209001 | 0.2756 |
| 超声30min | 216058 | 0.2925 |
| 超声40min | 220967 | 0.2942 |
4.提取溶剂用量考察
平行称取本品3份，各1g，精密称定，置3个具塞锥形瓶中，分别精密加入甲 醇10ml、20ml、30ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，分别精密量取续滤液5ml、10ml、15ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验结果见附表28，结果表明20ml甲醇即可将连翘苷提取完全。
附表28提取溶剂用量考察结果
| 提取溶剂用量 | 峰面积 | 含量(mg/g) |
| 10ml甲醇 | 192639 | 0.2616 |
| 20ml甲醇 | 222294 | 0.2939 |
| 30ml甲醇 | 222295 | 0.2930 |
Claims (10)
1.一种黄氏响声丸制剂的检测方法，其特征在于，包括以下成分的检测，游离蒽醌与结合蒽醌，连翘苷、阿魏酸和甘草酸，所述方法为高效液相色谱法，包括对照品溶液的制备，供试品溶液的制备，阴性对照溶液的制备，将对照品溶液，供试品溶液，阴性对照溶液注入色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算它们的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中所述游离蒽醌与结合蒽醌的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，取大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，取大黄酸对照品适量精密称定，加DMSO溶解后加甲醇制成每1ml含0.06mg的对照品溶液，取大黄酚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.08mg的对照品溶液.取大黄素甲醚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取1g黄氏响声丸加入体积比为5:1-1:1甲醇-盐酸混合液40-80ml后超声提取，取滤液用15-80ml氯仿萃取2-4次；合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，游离蒽醌样品：取1g黄氏响声丸加入30-100ml氯仿后回流提取30-60min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
阴性对照溶液的制备：取缺大黄药材的黄氏响声丸1g加入体积比为5:1-1:1甲醇-盐酸混合液40-80ml后超声提取，取滤液用15-80ml氯仿萃取2-4次；合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，游离蒽醌样品：取1g黄氏响声丸加入30-100ml氯仿后回流提取30-60min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
测定：分别吸取上述对溶液各10ul，注入液相色谱仪测定，根据色谱图计算分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的游离型及总蒽醌含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以30-70:70-30的乙腈-0.32％磷酸水溶液为流动相洗脱，检测波长为254nm，理论塔板数按大黄酚计算应不低于2000。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中所述连翘苷的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.2mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取1g黄氏响声丸加入10-50ml甲醇后超声20-40min处理，过滤，取续滤液蒸至近干，取续滤液5-15ml加中性氧化铝0.5-3g拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(3-9g)上，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至容量瓶中定容即得，
阴性对照溶液的制备：取缺连翘药材的黄氏响声丸，加入10-50ml甲醇后超声20-40min处理，过滤，取续滤液蒸至近干，取续滤液5-15ml加中性氧化铝0.5-3g拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(3-9g)上，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至容量瓶中定容即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的连翘苷含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以16-26:84-74的乙腈-水为流动相，检测波长为277nm，理论塔板数按连翘苷计算应不低于2000。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中所述阿魏酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量精密称定，加70％甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取1g黄氏响声丸加入10-50ml70％甲醇溶液后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺川芎药材的黄氏响声丸，加入10-50ml70％甲醇溶液后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以10-30:90-70的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相，检测波长为321nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中所述甘草酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.6mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取0.5g黄氏响声丸加入10-50ml流动相后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺甘草药材的黄氏响声丸，加入10-50ml流动相后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以20-40:80-60的乙腈-0.1％磷酸为流动相，检测波长为250nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：蒽醌类含量测定中，液相色谱流动相梯度洗脱条件为：乙腈-0.32％磷酸水溶液38:62保持15分钟，调整为51:49，保持8分钟后调整为55:45，保持12分钟，总蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入体积比为3:1甲醇-盐酸混合液60ml后，超声提取2-3次，每次20min，合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml，合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得，游离蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入60ml氯仿后回流提取45min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：连翘苷含量测定中，液相色谱流动相为乙腈-水21:79，供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入甲醇20ml，超声处理30min，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中定容即得。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：阿魏酸含量测定中，液相色谱流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液20:80，供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定后，加入20ml70％甲醇溶液后超声10min处理，过滤，取续滤液即得。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：甘草酸含量测定中，液相色谱流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液32:68，供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸0.5g，精密称定后，加入30ml流动相后超声20min处理，过滤，取续滤液即得。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
其中所述游离蒽醌与结合蒽醌的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，取大黄素对照品适量精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，取大黄酸对照品适量精密称定，加DMSO溶解后加甲醇制成每1ml含0.06mg的对照品溶液，取大黄酚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.08mg的对照品溶液.取大黄素甲醚对照品适量精密称定，加氯仿溶解后加甲醇制成每1ml含0.03mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定，加入体积比为3:1甲醇-盐酸混合液60ml后，超声提取2-3次，每次20min，合并提取液，用氯仿萃取3次，每次60ml，合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容至25ml即得，游离蒽醌供试品溶液的制备过程中，取黄氏响声丸1g，精密称定，加入60ml氯仿后回流提取45min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
阴性对照溶液的制备：取缺大黄药材的黄氏响声丸1g加入体积比为5:1-1:1甲醇-盐酸混合液40-80ml后超声提取，取滤液用15-80ml氯仿萃取2-4次；合并氯仿层，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，游离蒽醌样品：取1g黄氏响声丸加入30-100ml氯仿后回流提取30-60min，回收氯仿，用甲醇溶解残渣，定容后即得，
测定：分别吸取上述对溶液各10ul，注入液相色谱仪测定，根据色谱图计算分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的游离型及总蒽醌含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相梯度洗脱条件为：乙腈-0.32％磷酸水溶液38:62保持15分钟，调整为51:49，保持8分钟后调整为55:45，保持12分钟，
其中所述连翘苷的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.2mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定，加入甲醇20ml，超声处理30min，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝(100-200目)1.5g拌匀，挥干，加在中性氧化铝(100-200目，6g，内径为1-1.5cm)柱上，用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至5ml量瓶中定容即得，
阴性对照溶液的制备：取缺连翘药材的黄氏响声丸，加入10-50ml甲醇后超声20-40min处理，过滤，取续滤液蒸至近干，取续滤液5-15ml加中性氧化铝0.5-3g拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(3-9g)上，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用流动相溶解，转移至容量瓶中定容即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的连翘苷含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相为乙腈-水21:79，检测波长为277nm，理论塔板数按连翘苷计算应不低于2000，
其中所述阿魏酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量精密称定，加70％甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸1g，精密称定后，加入20ml70％甲醇溶液后超声10min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺川芎药材的黄氏响声丸，加入10-50ml70％甲醇溶液后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液20:80，检测波长为321nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000，
其中所述甘草酸的检测方法，步骤如下：
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量精密称定，加流动相制成每1ml含0.6mg的对照品溶液，
供试品溶液的制备：取黄氏响声丸0.5g，精密称定后，加入30ml流动相后超声20min处理，过滤，取续滤液即得，
阴性对照溶液的制备：取缺甘草药材的黄氏响声丸，加入10-50ml流动相后超声5-30min处理，过滤，取续滤液即得，
测定：分别精密移取相同体积量的上述溶液进样，所吸取的体积量为10ul，根据色谱图计算供试品中的阿魏酸含量，
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液32:68，检测波长为250nm，理论塔板数按阿魏酸计算应不低于2000。
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