CN104479014A

CN104479014A - 抗人胃癌相关蛋白gcrg213的单克隆抗体

Info

Publication number: CN104479014A
Application number: CN201410652952.1A
Authority: CN
Inventors: 吴本俨; 伍银桥; 王刚石
Original assignee: 吴本俨; 伍银桥; 王刚石
Current assignee: Chinese Pla General Hospital
Priority date: 2014-11-17
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2034-11-17
Also published as: CN104479014B

Abstract

本发明公开了一种抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体。该抗人GCRG213蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.7602的杂交瘤细胞株产生的。本发明所提供的单克隆抗体可用于在制备检测或辅助检测人GCRG213蛋白的试剂或试剂盒，其亲和常数达2.0×10⁹L/mol。以该单克隆抗体为检测抗体建立的酶联免疫方法检测蛋白GCRG213，检测限为0.9—0.001ug/ml。本发明所提供的抗蛋白GCRG213的单克隆抗体具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于人蛋白GCRG213的定性和定量检测。

Description

抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体。

背景技术

蛋白GCRG213是应用荧光标记的mRNA差异显示技术，从我国人胃窦部进展期腺癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜组织中筛选并克隆的1条胃癌高表达的mRNA翻译产生的。蛋白GCRG213的氨基酸序列如序列表序列1所示，编码该蛋白的全长cDNA如序列表序列2所示，序列表序列2的第13位至第438位为开放阅读框架。由于蛋白GCRG213的表达与胃癌显著相关，GCRG213蛋白表达的检测对胃癌的诊断和研究分析具有重要意义。目前，还没有商业化的针对蛋白GCRG213的单克隆抗体、杂交瘤细胞株和相关试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体。

本发明提供的抗人GCRG213蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.7602的杂交瘤细胞株产生的；所述人GCRG213蛋白为序列表序列1所示蛋白。

本发明另一个目的是提供一株分泌抗人GCRG213蛋白的单克隆抗体的的杂交瘤细胞株GCRG213。

本发明提供的分泌抗人GCRG213蛋白的单克隆抗体的的杂交瘤细胞株GCRG213，其保藏号为CGMCC No.7602；所述人GCRG213蛋白为序列表序列1所示蛋白。

本发明保护保藏号为CGMCC No.7602的杂交瘤细胞株GCRG213。该杂交瘤细胞株已于2013年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.7602。

本发明所提供的单克隆抗体或杂交瘤细胞株可用于制备检测或辅助检测人GCRG213蛋白的试剂或试剂盒；所述人GCRG213蛋白为序列表序列1所示蛋白。

本发明第三个目的是提供一种检测或辅助检测人GCRG213蛋白的酶联免疫试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括独立包装的上述的单克隆抗体，所述人GCRG213蛋白为序列表序列1所示蛋白。

本发明的实验证明，以组氨酸标记的序列表序列1所示蛋白为免疫原免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞株GCRG213CGMCC No.7602，该杂交瘤细胞株所稳定分泌的抗蛋白GCRG213的单克隆抗体的亲和常数达2.0×10⁹L/mol。以该单克隆抗体为检测抗体建立的酶联免疫方法检测蛋白GCRG213，检测限为0.9—0.001ug/ml本发明所提供的抗蛋白GCRG213的单克隆抗体具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于人蛋白GCRG213的定性和定量检测。

附图说明

图1为PCR扩增GCRG213编码基因的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，泳道M为DNAMarker；泳道1为PCR扩增产物。

图2为目的蛋白GCRG213的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道M为蛋白Marker。

图3为抗蛋白GCRG213的单克隆抗体的Western blot鉴定结果。

图4为抗蛋白GCRG213的单克隆抗体在正常胃黏膜组织(图A)、胃癌组织(印戒细胞癌)(图B)的免疫组化结果(放大倍数：400)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体的制备

一、免疫原的制备

1、全基因合成

以pGEM-T质粒为模板，使用引物5′-cgcgaattcATGCAACAAGAAGAGCTAACTATCCTAAATA-3′和5′-cgcaagcttaGTTTTGAGTGAGCTTCTTAATCCTAAGTTCG-3′，进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(结果如图1所示)，回收纯化426bp的DNA片段，将该片段连接于载体pGEM-T的TA克隆位点处，经测序证实，获得了在载体pGEM-T的TA克隆位点处插入序列表序列2所示DNA片段的重组载体pGEM-T-G。序列表序列2自5’末端13-438位核苷酸为序列表序列1所示人GCRG213蛋白的编码序列。

2、重组表达载体的构建

将序列表序列2所示DNA片段连入载体pPROEX HTa(美国Invitrogen公司，VYI0230)，经测序证实，获得将序列表序列2所示DNA片段插入载体pPROEX HTa得到的重组表达载体M。

3、重组菌获得

将步骤1获得的重组表达载体M转化大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)(美国Invitrogen公司，产品目录编号C601003)，获得含有重组表达载体M的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)，即重组菌M。

4、目的蛋白的诱导表达

将3获得的重组菌M用LB液体培养基(含100mg/ml抗生素ampicillin)于37℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，获得培养液Ⅰ，在培养液Ⅰ中加入终浓度为1mol/L的IPTG诱导剂，37℃继续震荡培养4小时，获得培养液Ⅱ，将培养液Ⅱ离心后收集菌体沉淀。

5、目的蛋白的分离提纯

将步骤4获得的菌体沉淀进行如下破菌处理和分离纯化：

用pH为7.4的PBS溶液重悬，同时加入溶菌酶，在冰上进行超声波裂解，3000×g离心，收集包涵体沉淀和上清液。将包涵体沉淀中6个组氨酸标记的目的蛋白进行纯化，获得目的蛋白液。

取步骤4的培养液Ⅰ(图2中的泳道1)，培养液Ⅱ(图2中的泳道2)、步骤5破菌处理后的上清液(图2中的泳道3)、包涵体沉淀(图2中的泳道4)和经纯化获得的重组蛋白液(图2中的泳道5)进行SDS-PAGE,结果如图2所示。

图2结果表明，泳道5经纯化获得的目的蛋白液中目的重组蛋白大小为20.8kDa，与预测大小相近，该重组蛋白即为6个组氨酸标记的蛋白GCRG213。

二、动物免疫

1、将步骤一获得的含6个组氨酸标记的蛋白GCRG213的目的蛋白液用ThermoScientific BCA蛋白定量分析试剂盒(北方同正生物技术发展公司，货号23225)检测总蛋白含量，并用PBS溶液将其调整蛋白浓度为80μg/L。

2、基础免疫：将步骤1获得的80μg/L的目的蛋白液用等体积弗氏完全佐剂乳化后，采用腹腔及背部皮下多点注射8～12周的雌性BALB/c健康小鼠(购自军事医学科学院)，注射剂量为每只小鼠注射0.86个组氨酸标记的蛋白GCRG213。

3、加强免疫：4周后，将步骤1获得的80μg/L的目的蛋白液等体积弗氏不完全佐剂乳化后，采用腹腔及背部皮下多点注射BALB/c小鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.86个组氨酸标记的蛋白GCRG213。

三、细胞融合和克隆化

加强免疫每隔3周一次，从第2次加强免疫开始，每次免疫后第7天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，选择血清效价最佳的小鼠，取脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接非竞争ELISA的方法筛选出稳定分泌抗6个组氨酸标记的蛋白GCRG213单克隆抗体效价最高(效价为1:256000)的单克隆杂交瘤细胞株GCRG213。

将上述效价最高单克隆杂交瘤细胞株GCRG213于2013年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.7602。

上述间接非竞争ELISA测定抗体效价的方法如下：

1)包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原(步骤一获得的6个组氨酸标记的蛋白GCRG213)稀释至10μg/ml；加入到酶标板中，每孔100μl，4℃包被16小时；(过夜或37℃6小时)弃液体；

所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：Na2CO3 1.59g/L、NaHCO32.93g/L，pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液CBS。

2)封闭：每孔加封闭液200μl，37℃湿盒孵育6h；弃液体，加洗涤液洗3次，每次90s，拍干。

所述封闭液的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：1％BSA。

所述洗涤液的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：含0.05％Tween-20的10mM，pH7.4的PBS。

3)加待测样品：将杂交瘤细胞培养液倍比稀释后，加入酶标板中，每孔100μl；同时设空白对照(PBST)、阴性对照(阴性血清)和阳性对照(阳性血清)各2孔，37℃孵育0.5h；弃液体，加洗涤液洗3次，每次90s，拍干。

4)加酶标二抗：每孔加入100μL用PBST溶液稀释1:1000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，37℃中孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

5)显色：各孔加现配的底物液A、底物液B各100μl，37℃孵育15min。

所述底物液A的溶剂为水，溶质及其浓度为：柠檬酸21g/L。

所述底物液B的溶剂为水，溶质及其浓度为：磷酸氢二钠28.4g/L。

6)终止：每孔加终止液50μl。

所述终止液为的溶剂为水，溶质及其浓度为：浓硫酸22.2ml/L，蒸馏水177.8ml。

判定结果：用酶标仪测定450nm下的OD值，以空白对照调零，待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍(即为阳性)时的待测样品的最大稀释倍数即为抗体效价。

四、细胞冻存和复苏

用冻存液(即含10％DMSO的完全培养液)将杂交瘤细胞株CGMCC No.7602制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

五、单克隆抗体的制备和纯化

1、腹水的制备

取健康BALB/c雌性小鼠，每只腹腔注射液体石蜡0.5ml，1～2周后每只腹腔注射1ml浓度为1×10⁶个/ml的杂交瘤细胞株CGMCC No.7602细胞悬液；7～9天后收集腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，腹水；分装，-70℃冻存。

2、单克隆抗体的纯化

取步骤1的腹水，最后用腹水先后用500g/L饱和硫酸铵盐析和Protein G亲和层析的方法(按说明书操作)进行纯化，获得抗6个组氨酸标记的蛋白GCRG213的单克隆抗体溶液。

上述用亲和层析柱对抗体进行纯化的方法如下

(1)、收集管的准备：将每个收集管(约收集1ml的样品)用200μL左右的1mol/L，pH9.0的Tris-HCI进行处理。

(2)、层析柱的平衡

1)去掉层析柱母头和出口处的堵头，将配套接头连在柱上。用注射器吸取结合缓冲液，先逐滴将结合缓冲液滴满连接器，以排除柱内的空气，然后将注射器插入连接器缓慢注入结合缓冲液。

2)用10倍柱床体积的结合缓冲液冲洗柱子。冲洗速度为不高于5mL/min为宜。

(3)、上样

样品用结合缓冲液冲洗稀释至合适浓度，用注射器上样1-2个柱床体积，收集流出液(即为穿透液)。

(4)、洗脱

1)用5-10个柱床体积的结合缓冲液冲洗柱子，弃流出液。

2)用2-5个柱床体积的洗脱缓冲液冲洗柱子，并收集流出液(即洗脱液)。

(5)、纯化完成后柱子的处理

1)用3-5个柱床体积的洗脱缓冲液冲洗柱子，弃流出液。

2)用5-10个柱床体积的结合缓冲液冲洗柱子，弃流出液。

3)用5-10个柱床体积的20％乙醇溶液冲洗柱子以防微生物的产生。最后将柱子内充满20％的乙醇，4℃保存。

六、单克隆抗体的鉴定

1、类及亚型

取杂交瘤细胞株CGMCC No.7602的培养液，离心后去除细胞及其碎片，使用Roche公司的小鼠mAb分型试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中抗GCRG213mAb的Ig亚类，按照说明书检测该细胞株分泌的单克隆抗体属其轻链为IgG2b k和IgG1k亚型。

2、单克隆抗体的特异性鉴定

取杂交瘤细胞株CGMCC No.7602的培养上清液，进行Western blot检测，将步骤一制备的6个组氨酸标记的蛋白GCRG213加入还原性SDS-PAGE上样缓冲液,100℃变性10min。取3μL进行125g/L SDS-PAGE，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移至PVDF膜上。用50g/L脱脂奶粉封闭液封闭1h后，加入杂交瘤细胞上清，室温下孵育2h，TBST缓冲液洗膜后，加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)，室温孵育1h，TBST缓冲液洗膜后，ECL法显色，直至目的条带清晰时终止反应。X片显影、定影。

结果如图3所示，M：蛋白marker；+：阳性对照；1-8：杂交瘤细胞株CGMCC No.7602的培养上清，表明，杂交瘤细胞株CGMCC No.7602分泌的单克隆抗体在20.8kDa处可特异识别6个组氨酸标记的蛋白GCRG213。

3、测定单克隆抗体的亲和常数

1)包被：将步骤一制备的6个组氨酸标记的蛋白GCRG213用包被缓冲液配成如下浓度：2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL；分别按100μL/孔的量添加于酶标板中，4℃包被16h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

2)封闭：加封闭液100μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

3)加抗体：每孔加入系列稀释的抗6个组氨酸标记的蛋白GCRG213的单克隆抗体浓度分别为500×、1000×、2000×、4000×、8000×和10000×的杂交瘤细胞株CGMCC No.7602的培养液(被检样品)100μL，每种抗体浓度设置三个复孔，37℃中孵育2h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

4)加酶标二抗：每孔加入100μL用PBS溶液稀释1:3000的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，37℃中孵育1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

5)显色：取底物溶液，每孔加入100μL，室温℃避光显色15min。

6)终止：每孔加入终止液50μL，用酶标仪测定各孔450nm处的OD值。

以被检样品中的单克隆抗体浓度(mol/L)不同稀释度的负对数值为横坐标，以其对应的吸光度OD值为纵坐标，绘制3条曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100％，计算OD值为50％时单克隆抗体的浓度[Ab]t，这样每份被检样品可得[Ab]t﹑[Ab]′t﹑[Ab]″t三个值，然后根据如下公式计算：

计算杂交瘤细胞株CGMCC No.7602分泌的单克隆抗体的亲和常数为2.0×10⁹L/mol。

实施例2、抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体的灵敏度检测

将步骤一制备的6个组氨酸标记的蛋白GCRG213用包被缓冲液配成如下浓度：0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、0.9μg/mL，分别按100μL/孔的量添加于酶标板中，进行酶联反应，结果，最低检测限为0.001ug/ml，检测范围为0.9—0.001ug/ml。

实施例3、抗人胃癌相关蛋白GCRG213的单克隆抗体的应用

取30例胃癌组织(12例中高分化腺癌、12例低分化腺癌和6例印戒细胞癌)和5例正常胃黏膜组织，用福尔马林固定，石蜡包埋后做组织切片，切片厚度为1μm。切片用二甲苯去除石蜡、乙醇清洗后，蒸汽加热进行抗原修复20分钟。将切片按1:20的体积比与步骤五中的2制备得到的抗6个组氨酸标记的蛋白GCRG213的单克隆抗体溶液杂交，染色，复染。部分结果如图4所示。

结果表明：蛋白GCRG213染色部位位于胞质，根据表达强度的不同呈现浅黄、深黄色，未见明显核着色。蛋白GCRG213在胃癌组织中染色强度明显，正常胃黏膜组织表现为无着色、浅着色，从肿瘤组织着色强度来看，印戒细胞癌着色强度较中高分化腺癌弱。

Claims

1.抗人GCRG213蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.7602的杂交瘤细胞株产生的。

2.一株分泌抗人GCRG213蛋白的单克隆抗体的的杂交瘤细胞株GCRG213，其保藏号为CGMCC No.7602。

3.权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测人GCRG213蛋白的试剂或试剂盒中的应用；

所述人GCRG213蛋白为序列表序列1所示蛋白。

4.一种检测或辅助检测人GCRG213蛋白的酶联免疫试剂盒，包括独立包装的权利要求1所述的单克隆抗体。