CN104470546A

CN104470546A - 化合物和含有所述化合物的光声成像造影剂

Info

Publication number: CN104470546A
Application number: CN201380038553.XA
Authority: CN
Inventors: 山内文生; 小河贤史; 金崎健吾; 笹栗大助; 高桥淳; 南昌人; 福井树
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2033-07-17
Also published as: EP2863957A1; CN104470546B; WO2014013730A1; EP2863957B1; US20150157741A1; US9592307B2

Abstract

本发明提供化合物，其甚至当在实施施用之后经过了一些程度时间时也呈现向肿瘤高程度蓄积，及其辅助由肿瘤产生的光声信号强度增加。通过聚乙二醇和基于特定花青苷的化合物的键合产生的化合物。

Description

化合物和含有所述化合物的光声成像造影剂

【技术领域】

本发明涉及化合物和含有上述化合物的光声成像造影剂。

【背景技术】

光声层析成像(以下可缩写为PAT)设备具有已知为可视化在活体之内的信息的设备之一。在使用PAT设备的测量中，当给待测量的受试者照射光时，可通过测量待测量的受试者之内的由吸收光的物质(光吸收体)产生的光声信号的强度和产生时间来获得在待测量的受试者之内物质分布的计算像。

在本文中，可将任何物质用作光吸收体，只要该物质因为活体中光的吸收而产生声波。例如，人体中的血管，恶性肿瘤等能作为光吸收体采用。此外，将吲哚氰绿(以下可缩写为ICG)等分子施用于身体及用作造影剂也是可能的。ICG可有利地用作PAT设备中的造影剂，因为对人体的小辐射影响和高光吸收，其在近红外线波长区及其具有向活体的高通透性。同时，在本说明书中，ICG指称以下结构表示的化合物。

[化学式1]

在这点上，对离子不必然是Na⁺，但可采用任何对离子，例如，H⁺或K⁺。

但是，已知道血中ICG的半衰期为约几分钟，因此，非常短。

NPL 1报道了已通过单独使用ICG实施大鼠脑血管的光声成像的一例。根据此报道，在ICG已单独施用于血之后几十分钟时光声信号降至与血相同的水平，因此，指示，施用的物质在施用之后立即自血消失。

如上所述，ICG在单独施用于血之后几十分钟时自血消失，和认为，当在施用之后经过了一些时间时向肿瘤的蓄积程度低。

[引用文献]

[非专利文献]

[NPL 1]Optics Letters,29(7),730(2004)

[NPL 2]Bioorganic&Medicinal Chemistry 6(1998)2179-2184

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

因此，本发明提供甚至当在施用之后经过了一些时间时仍呈现向肿瘤的高程度蓄积及辅助由肿瘤产生的光声信号强度增加的化合物。

【解决课题的技术方案】

根据本发明的一方面的化合物由以下式(I)～(IV)之任一个表示。

[化学式2]

A-L¹-(CH₂)_p-(OCH₂CH₂)_m-O-(CH₂)_q-L²-A' (I)

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

在式(I)中，A和A'独立地表示以下式(i)～式(vi)之任一个，及在以下式(i)～(vi)中的符号*键合于式(I)中的L¹或L²。

在式(I)中，L¹和L²独立地表示是-NH-、-O-、-S-及-CO-之任一种或含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分，p和q独立地表示1～5的整数，及m表示10以上且2,500以下的整数。

在式(II)和式(III)中，A表示以下式(i)～(vi)之任一个，及在以下式(i)～(vi)中的符号*键合于式(II)中的L¹或式(III)中的L²。

在式(II)和式(III)中，L¹和L²独立地表示是-NH-、-O-、-S-及-CO-之任一种或含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分，p和q独立地表示1～5的整数，及m表示10以上且2,500以下的整数。

在式(II)中，在L²是-NH-、-O-及-S-之任一种的情况中，M是氢原子，及在L²是-CO-的情况中，M是羟基。

在式(III)中，在L¹是-NH-、-O-及-S-之任一种的情况中，N是氢原子，及在L¹是-CO-的情况中，N是羟基。

在式(IV)中，A表示以下式(i)～式(vi)之任一个，及在以下式(i)～(vi)中的符号*键合于式(IV)中的L¹。

在式(IV)中，L¹表示是-NH-、-O-、-S-及-CO-之任一种或含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分，p表示1～5的整数，m表示10以上且2,500以下的整数，及R表示氢原子和具有1～5的碳数的取代的或未经取代的烷基中的任一种。

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

[化学式11]

在式(i)～式(vi)中，Z和氢原子、磺酸基或与Z键合的吲哚环一起形成由苯并[e]吲哚环、苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环组成的环状芳族环，及此外，环状芳族环的氢原子可被具有1～10的碳数的烷基、具有1～10的碳数的烷氧基或磺酸基取代。

在式(i)～(vi)中，R¹表示下列中的任一种：具有1～10的碳数的烷基及-(CH₂)_b-SO₃ ^-(b表示1～10的整数)，在R¹是烷基的情况中，可含有卤素离子或有机酸离子作为对离子，及R²和R³独立地表示下列中的任一种：氢原子，具有1～10的碳数的烷基，具有1～10的碳数的烷氧基，-(CH₂)_b-SO₃ ^-(b表示1～10的整数)及-(CH₂)_b-SO₃X(b表示1～10的整数和X表示钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸中的任一种)。

在式(i)及(ii)中，a表示1～10的整数。

在式(i)～(vi)中，n表示2或3。

在式(ii)中，(iv)及(vi)，R⁴表示下列中的任一种：具有1～10的碳数的烷基及-(CH₂)_b-SO₃X(b表示1～10的整数和X表示钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸中的任一种)。

在式(iii)及(iv)中，L³表示取代的或未经取代的具有1～10的碳数的烷基和烷基的链可包括羰基、酰胺基、酯基或哌嗪基作为取代基。

在式(v)及(vi)中，L⁴表示取代的或未经取代的烷基，其具有1～10的碳数，且其可包括羰基、酰胺基或酯基作为取代基。

【发明效果】

根据本发明的方面，化合物具有聚乙二醇(以下可缩写为PEG)和基于花青苷的化合物，例如，ICG共价-键合的结构。因而，相比ICG单独施用于活体的情况中的那些，向肿瘤蓄积程度高和由肿瘤产生的光声信号的强度大。

【附图说明】

[图1]图1是带有肿瘤的小鼠的光学照片，其中在根据本发明的一方面的一例中实施光声成像。

[图2]图2显示由在根据本发明的一方面的一例中实施的光声成像获得的图像。

[图3]图3是图显示在根据本发明的一方面的一例中实施的肿瘤蓄积的评估实验中获得的结果。

【实施方式】

会描述根据本发明的方面的实施方式。本实施方式的化合物具有基于特定花青苷的染料键合于PEG的结构，及PEG介经存在于基于花青苷的染料的吲哚环的氮原子取代基键合。本实施方式的化合物特别是由以下式(I)～(IV)表示的化合物。

[化学式12]

A-L¹-(CH₂)_p-(OCH₂CH₂)_m-O-(CH₂)_q-L²-A' (I)

[化学式13]

[化学式14]

[化学式15]

在这点上，在本说明书中，符号*表示结构式中的以下标记。

[化学式16]

＊

[化学式17]

[化学式18]

[化学式19]

[化学式20]

[化学式21]

[化学式22]

在式(i)～(vi)中，Z和氢原子、磺酸基或与Z键合的吲哚环一起形成由苯并[e]吲哚环、苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环组成的环状芳族环，及此外，环状芳族环的氢原子可被具有1～10的碳数的烷基、具有1～10的碳数的烷氧基或磺酸基取代。

在式(i)～(vi)中，R¹表示下列中的任一种：具有1～10的碳数的烷基及-(CH₂)_b-SO₃ ^-(b表示1～10的整数)，在R¹是烷基的情况中，可含有卤素离子，例如，氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子，例如，乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子作为对离子，及R²和R³独立地表示下列中的任一种：氢原子、具有1～10的碳数的烷基、具有1～10的碳数的烷氧基、-(CH₂)_b-SO₃ ^-(b表示1～10的整数)及-(CH₂)_b-SO₃X(b表示1～10的整数和X表示钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸中的任一种)。

在式(i)及(ii)中，a表示1～10的整数。

在式(i)～(vi)中，n表示2或3。

在式(iii)及(iv)中，L³表示任何二价基团，且是例如，取代的或未经取代的烷基，其具有1～10的碳数，且其可包括羰基、酰胺基、酯基、哌嗪基等作为取代基。

在式(v)及(vi)中，L⁴表示任何二价基团，且是例如，取代的或未经取代的烷基，其具有1～10的碳数，且其可包括羰基、酰胺基、酯基等作为取代基。

在本实施方式的化合物中，式(I)～(IV)中的m优选是100以上且500以下的整数，及更优选200以上且400以下的整数。

在式(I)中，A和A'可为仅式(i)～(vi)之一，或是式(i)～(vi)的组合。

式(I)中的L¹和L²均可为-NH-，因为A和L¹之间的键合及A'和L²之间的键合强。

L¹和L²均可为-O-，因为认为，本实施方式的化合物在水溶液，例如，血清中的分散性增加。

同时，L¹和L²可独立地是含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分。在本文中，接头部分指称具有键合式(I)～式(IV)中的乙二醇链或烷基链与A或A'的功能的部分。例包括双功能化合物，例如，1,6-双马来酰亚胺己烷和反式-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。其他例可包括具有1～10的碳数及含有羰基、酰胺基、酯基、哌嗪基等的烷基。在其他例中，可使用具有任何链长度的多肽，及多肽可为随后描述的捕获分子。多肽可通过使用链中的羰基，氨基，及氢硫基中的任一种形成共价键。例如，N-PEG马来酰亚胺基和氢硫基可在中性条件下于室温形成马来酰亚胺-氢硫基键。

在式(i)及式(ii)中，可为2～6的整数。

在式(i)～式(vi)中，R¹，R²和R³中的b可为2～6的整数。

在式(i)及式(ii)中的a及式(i)～式(vi)中的b是6以下的情况中，疏水性不变高，因此，在活体中不容易发生非特异性吸附。

在本实施方式中，上述式(i)可由以下式(i-1)～(i-6)之任一个表示。

[化学式23]

[化学式24]

在式(i-2)中，Y^-表示卤素离子，例如，氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子，例如，乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子。

[化学式25]

[化学式26]

[化学式27]

[化学式28]

在本实施方式中，上述式(ii)可由以下式(ii-1)和(ii-2)之任一个表示。

[化学式29]

[化学式30]

在本实施方式中，上述式(iii)可由以下式(iii-1)和(iii-2)之任一个表示。

[化学式31]

[化学式32]

在本实施方式中，上述式(iv)可由以下式(iv-1)和(iv-2)之任一个表示。

[化学式33]

[化学式34]

以上描述的L¹和L²中的至少一种可由以下式(xi)表示。

[化学式35]

在式(xi)中，L⁵表示多肽或单链抗体，-NH-表示介经多肽或单链抗体中的氨基酸的氨基的键，-S-表示介经多肽或单链抗体中的氨基酸的氢硫基的键，L⁶表示烷基链，其具有1～10的碳数，且其包括羰基、酰胺基、酯基、哌嗪基等，符号**键合于上述符号*，及符号***键合于式(I)～(IV)的烷基链侧或乙二醇链侧。

在式(xi)中，L⁶可由以下式(xii)表示，

-(CH₂)₂-C(＝O)-NH-(xii)

在式(xii)中，亚乙基中的碳键合于上述式(xi)中的马来酰亚胺基中的氮，及-NH-中的氮键合于上述式(xi)中的符号***。即，亚乙基侧键合于马来酰亚胺基的氮原子和酰胺侧键合于符号***。

此外，本实施方式的化合物可键合于另一染料。

本实施方式的化合物可包括特异性键合于靶部分的捕获分子。

[制备化合物的方法]

本实施方式的化合物通过PEG与基于特定花青苷的化合物通过它们的相应官能团由知道的偶联反应键合而制备。例如，与PEG的键合通过基于特定花青苷的化合物的含氮的杂环中存在的氮原子的取代基实施。键合可通过具有氨基的PEG的氨基和基于特定花青苷的化合物中包括的磺基琥珀酰亚胺酯(可缩写为Sulfo-OSu)实施。与PEG键合的基于特定花青苷的染料可洗涤及由知道的精制方法，例如，超滤方法或尺寸排阻柱层析精制。至于PEG和基于特定花青苷的化合物之间的键合，上述官能团，例如，PEG中包括的氨基可直接键合于基于特定花青苷的化合物，或PEG可通过各种交联剂(交联接头)键合于基于特定花青苷的化合物。

本实施方式的化合物可由具有1,000以上的分子量及包括至少一个氨基的PEG与吲哚氰绿-N-丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(ICG-Sulfo-OSu)(注册商标)(生产自DOJIJDO LABORATORIES)的共价-键合制备。

[PEG]

用于制备本实施方式的化合物的PEG是水溶性聚合物及发挥增加蛋白的血清半衰期，减少免疫原性等效应。PEG的分子量优选在400以上且100,000以下，及还优选20,000以上的范围之内。认为，如果分子量是20,000以上，基于增强的通透性和保留(EPR)效应，相比活体中的正常部分，更大量的PEG可蓄积进活体中的肿瘤部分。如果分子量是20,000以上，自肾的排泄被抑制，因此，预期相比具有小于20,000的分子量的PEG，血中保持性增加。随着PEG的分子量增加，溶液粘度增加，从而PEG的分子量优选是100,000以下。

根据本实施方式的PEG每PEG分子具有至少一个能与基于特定花青苷的化合物共价-键合的反应性官能团。反应性官能团可根据待键合的染料中包括的官能团而适当选择。反应性官能团的例可包括氨基，羟基，氢硫基，羰基，巯基，环氧组，缩水甘油基，N-琥伯酰亚胺基氧基，N-磺基琥伯酰亚胺基氧基，及N-马来酰亚胺基烷基。

[基于特定花青苷的化合物]

在本实施方式中，基于特定花青苷的化合物的结构由，例如，以下式(V)表示。

B-B'(V)

在式(V)中，B表示上述式(i)或上述式(ii)。

在式(V)中，B'表示以下式(vii)～(x)之任一个。

[化学式36]

[化学式37]

[化学式38]

[化学式39]

＊-OH (x)

上述式(V)的一例可为下列中的任一种：由以下式(2)表示的化合物(ICG-Sulfo-OSu(生产自Dojindo Laboratories,注册商标))，由以下式(3)表示的化合物，由以下式(4)表示的化合物，由以下式(5)表示的化合物，由以下式(6)表示的化合物，由以下式(7)表示的化合物，及由以下式(8)表示的化合物。

[化学式40]

[化学式41]

[化学式42]

[化学式43]

[化学式44]

[化学式45]

[化学式46]

[光成像造影剂]

本实施方式的光成像造影剂包括本实施方式的化合物和分散介质。在这点上，本实施方式的光成像造影剂可除了本实施方式的化合物之外，还根据需要含有药理学可允许的添加剂，例如，血管扩张剂。

分散介质是分散本实施方式的化合物的液体物质，及例包括生理学盐水，蒸馏的注射用水，磷酸盐缓冲液，及葡萄糖水溶液。至于本实施方式的光成像造影剂，根据上述本实施方式的化合物可预先在此分散介质中分散，或本实施方式的粒子和分散介质可制造成试剂盒，由此用于在粒子分散进分散介质之后施用到活体。

光成像在本实施方式中指称通过应用光来成像。即，通过将光应用到本实施方式的光成像造影剂中的PEG之外的部分来发射声波，荧光等。光声成像通过检测发射的声波实施，和荧光成像通过检测发射的荧光实施。在这点上，光声成像是含有光声层析成像的概念。

本实施方式的光成像造影剂可在用于荧光成像的情况中被称为荧光成像造影剂，及在用于光声成像的情况中可被称为光声成像造影剂。

当施用于活体时，更大量的本实施方式的光成像造影剂可在活体中利用EPR效应蓄积到肿瘤部分(相比正常部分)。结果，当将本实施方式的光成像造影剂施用于活体，然后，将光应用于活体而自活体检测声波时，相比由正常部分产生的声波，由肿瘤部分产生的声波允许变得更大。

本实施方式的光成像造影剂也可用于淋巴结的成像，尤其是，可用作前哨淋巴结的造影剂。这是因为尺寸相比单个染料大，由此，前哨淋巴结中的保留容易发生，从而预期蓄积改善。

[捕获分子]

捕获分子在本实施方式中指称，例如，与靶部分，例如，肿瘤特异性键合的物质，或与靶部分周围存在的物质特异性键合的物质，及可任选地选自，例如，活体分子和化学物质，例如，药物。特定例包括抗体，抗体片段，人工抗体，例如，单链抗体，酶，有生物学活性的肽，糖肽，糖，脂质和分子识别化合物。这些物质可单独使用或它们可多个组合使用。在使用与捕获分子化学键合的根据本实施方式的化合物情况中，可实施靶部分的特异性检测及靶物质的动态行为，局部，药效，代谢等的追踪。

[添加剂]

本实施方式的光成像造影剂可含有冷冻干燥中使用的添加剂。添加剂的例包括葡萄糖，乳糖，甘露糖醇，聚乙二醇，甘氨酸，氯化钠，及磷酸氢钠。一种类型的添加剂可单独使用或可组合使用一些类型。

[光声成像方法]

以下会描述通过使用光声成像设备检测施用到活体的根据本实施方式的化合物的方法。检测本实施方式的化合物的方法包括以下步骤(a)及(b)。但是，本实施方式的光声成像方法可包括以下描述的步骤之外的步骤。

(a)向已施用本实施方式的化合物的样本应用600nm～1,300nm波长区的光的步骤，

(b)检测由存在于上述样本之内的上述化合物产生的声波的步骤。

此外，本实施方式的化合物可包括基于在上述步骤(b)中获得的声波的波长，位相，时间信息等再构型空间光声信号强度分布的步骤。在这点上，可基于在上述步骤(b)中获得的光声信号的波长，位相和时间信息实施3-维像再构型。由像再构型获得的数据可为任何形式，只要拿到光声信号的强度分布的位置信息。例如，光声信号强度可在3-维空间中表达，或光声信号强度可在2-维平面表达。由不同成像方法从相同的观察对象获得信息片段，和获取那些信息片段和光声强度分布之间的位置对应中的关系也是可能的。

在上述步骤中(a)，可使用已由口服施用，注射等方法施用本实施方式的化合物的样本。

在上述步骤中(b)，发射待应用于样本的光的设备和检测由本实施方式的化合物产生的光声信号的设备不特别限制。

在上述步骤(b)中向样本应用光的光源不特别限制，只要将具有选自600nm～1,300nm范围的至少一种波长的激光脉冲光应用于上述样本。应用激光脉冲光的设备的例包括钛蓝宝石激光(LT-2211-PC,生产自Lotis)，OPO激光(LT-2214OPO,生产自Lotis)，及翠绿宝石激光。

检测声波的设备不特别限制及可使用各种设备。例如，可采用可商购的光声成像设备(Nexus128,生产自Endra Inc.)。

通过使用本实施方式的化合物的成像方法可通过上述步骤(a)及(b)实施预定的部分，例如，肿瘤，淋巴结，或血管的成像。

【实施例】

以下参照实施例更详细描述本发明，尽管本发明不限于这些实施例。在这点上，以下Mw表示分子量。在本实施例中制备的各样品，M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG，M30k-ICG和M40k-ICG的典型结构由式(P1)或式(I-1)表示，及聚乙二醇的分子量是5k，10k，20k，30k和40k，分别。DE-200PA的结构由式(II)表示，聚乙二醇的分子量是20k。

[化学式47]

[化学式48]

[化学式49]

[化学式50]

【实施例1～实施例4】

[基于特定花青苷的化合物和PEG的共价键1]

至于本实施方式的基于特定花青苷的化合物，使用ICG-Sulfo-OSu(生产自Dojindo Laboratories)，并将1mg(1.25μmol)的ICG-Sulfo-OSu溶解于100μl的DMSO。同时，将各种PEG称重进1.5mL塑料管中。PEG由50mM碳酸盐缓冲液(pH9.0)溶解，从而NH₂浓度定为0.625mM。此处采用的各种PEG是单胺直链ME-050EA(生产自NOF公司,Mw 5,000)，单胺直链ME-100EA(生产自NOF公司,Mw 10,000)，单胺直链ME-200EA(生产自NOF公司,Mw 20,000)和二胺直链DE-200PA(生产自NOF公司,Mw20,000)。将它们总结于表1。

[表1]

以上采用的ME-050EA，ME-100EA和ME-200EA的结构由以下式(p1)表示，及分子量分别是5k，10k和20k。

CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂NH₂(p1)

在本说明书中，k表示1,000，及例如，5k表示5,000。

以上采用的DE-200PA的结构由以下式(p2)表示，及分子量是20k。

X-(CH₂CH₂O)n-X(p2)

在上述式(p2)中，X由以下式表示。

CH₂CH₂CH₂NH₂

实施向碳酸盐缓冲液中的PEG溶液(400μl)添加20μl的DMSO中ICG-Sulfo-OSu的([ICG-Sulfo-OSu]＝0.25μmol)溶液。使ICG-Sulfo-OSu与PEG以1的摩尔比反应。将反应时ICG-Sulfo-OSu的浓度定为0.6mM。在于室温在遮光条件下实施旋转搅拌24小时之后，用0.22μm注射器式滤器过滤反应溶液，由此获得基于特定花青苷的化合物和PEG共价键合的化合物。将得到的化合物在遮光条件下存储于4℃。

以下，将由单胺直链ME-050EA，单胺直链ME-100EA，单胺直链ME-200EA，及二胺直链DE-200PA与ICG-Sulfo-OSu共价键合产生的化合物分别缩写为M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG和D20k-ICG2，如显示于表2。同样，通过ICG-Sulfo-OSu与甘氨酸以1:1的摩尔比反应合成化合物(以下缩写为ICG-Gly)，由此作为参照样品(表2)。

在这点上，术语"单胺直链"指称每分子直链PEG包括一个氨基，及术语"二胺直链"指称每分子直链PEG包括2个氨基。氨基数与对于ICG-Sulfo-OSu可能的键数相同。

[表2]

	采用的PEG产品名称	样品名称	分子量	形式
					实施例1	DE-200PA	D20k-ICG2	20000	二胺直链
实施例2	ME-050EA	M5k-ICG	5000	单胺直链
					实施例3	ME-100EA	M10k-ICG	10000	单胺直链
实施例4	ME-200EA	M20k-ICG	20000	单胺直链
					参照例	ICG-Sulfo-OSu	ICG-Gly	800(甘氨酸的分子量)

[吸光度的测量]

测量M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG，D20k-ICG2和ICG-Gly溶液的吸光度。用50mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液实施稀释，及测量在700nm和785nm处的吸光度。在700nm处的吸收是由在结合状态的染料的吸收。同时，在785nm处的吸收是由作为单体存在的染料的吸收。因此，在700nm处的吸收与在785nm处的吸收的比(缩写为700/785)作为染料的结合状态的指标。认为，随此值变大，彼此结合的染料的比例变大。通过上述在785nm处的吸光度乘以稀释比来计算反应溶液的在785nm处的吸光度。通过使得到的反应溶液的在785nm处的吸光度除以染料的1.2×10⁵(M^-1×cm^-1)的摩尔吸收系数来计算反应溶液的染料浓度。表3显示吸光度的测量结果。

至于ICG-Gly，在反应期间观察到绿色沉淀物。同时，至于4种类型的M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG和D20k-ICG2，在反应期间观察不到沉淀物，及由此得知呈现水中良好分散性。尽管染料本身在水中不稳定，但显示，染料的稳定性通过与PEG共价-键合而改善。

[表3]

[肿瘤蓄积的评估]

为了评价以上制备的化合物的肿瘤蓄积，将M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG，D20k-ICG2和ICG-Gly施用于已移植N87细胞系的带有肿瘤的小鼠的尾静脉。作为染料量施用量是13nmol。在施用之后24小时将小鼠用二氧化碳气体无痛处死。然后，对N87肿瘤组织去核。将肿瘤组织转移到塑料管，添加肿瘤组织重量的1.25倍的1％Triton-X100水溶液，及通过使用塑料研杵产生匀浆物。随后，添加肿瘤组织重量的20.25倍的二甲基亚砜(DMSO)。通过使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(生产自XENOGEN)及以塑料管状态测量匀浆物溶液的荧光强度来定量肿瘤组织中的染料量。肿瘤组织的每单位重量的相对于施用量(染料13nmol)的向肿瘤组织的染料迁移率(％注射的剂量：缩写为％ID)作为化合物的肿瘤蓄积量(％ID/g)显示于表4。

结果，充当参照的ICG-Gly的肿瘤蓄积是0.6％ID/g，然而M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG和D20k-ICG2分别呈现1.1，1.4，5.2和7.0％ID/g，从而肿瘤蓄积随着分子量的增加而增加。此被认为是随着分子量增加而分子大小增加，和其自肾排泄受限制的结果。此外，当比较M20k-ICG和D20k-ICG2(具有20,000的分子量)时，二胺直链(染料键合于PEG的两个末端的化合物)的肿瘤蓄积相比单胺直链更高。认为，肿瘤蓄积增加是因为二胺直链PEG在每PEG分子具有更大量的染料，结果，基于PEG分子链内或分子链之间经染料的疏水结合而染料稳定性改善，表观分子尽寸变化等。如同上述结果(吸光度的测量)，指示，相比单染料，由与PEG的共价键合而肿瘤蓄积增强，及显示，PEG分子量和PEG形式是关于肿瘤蓄积重要的参数。

[表4]

	样品名称	肿瘤蓄积(％ID/g)
			实施例1	D20k-ICG2	7
实施例2	M5k-ICG	1.1
			实施例3	M10k-ICG	1.4
实施例4	M20k-ICG	5.2
			参照例	ICG-Gly	0.6

【肿瘤部分的光声成像】

为了检查肿瘤成像的性能，以与[肿瘤蓄积的评估]中采用的相同的方式，将M20k-ICG施用于已移植N87细胞系的带有肿瘤的小鼠的尾静脉。作为染料量而施用量是65nmol。在施用之后5分钟和在施用之后20小时实施光声成像(辐射激光波长785nm)。图1是光声成像中小鼠的光学照片及显示在麻醉下的小鼠(图中的m)。在图中，FOV是经历皮下移植的小鼠的肿瘤部分(图中的T)及是光声成像的观察区(2cm×2cm×2cm)。图2显示肿瘤部分的光声成像的结果和表5显示肿瘤部分的光声强度比，其中在施用之前的光声强度定为1。在图中，白色虚线指示小鼠的轮廓。从图2和表5得知，肿瘤部分的光声信号强度在施用之后立即(施用之后5分钟)显著地增加，甚至在施用之后20小时光声信号也维持，及观察到施用之前的信号的2.6倍的光声信号。因而，确认，基于肿瘤部分的光声成像的图像能通过使用根据本发明的一方面的实施例的化合物获得。

[表5]

	肿瘤部分中的光声强度比
		在施用之前	1
在施用之后5分钟	3.5
		在施用之后20小时	2.6

[标志物的制备]

将DMSO中ICG-Sulfo-OSu的溶液添加到HEPES中PEG的溶液(pH7.1)。ICG-Sulfo-OSu和PEG以3:1的反应摩尔比反应。反应时ICG-Sulfo-OSu的浓度定为0.6mM。在于室温在遮光条件下实施旋转搅拌24小时之后，将反应溶液用0.22μm注射器式滤器过滤，由此获得基于特定花青苷的染料和PEG共价-键合的水溶液。与PEG键合的近红外线有机染料可洗涤及由知道的精制方法，例如，超滤方法或尺寸排阻柱层析精制。

通过如在实施例1中使ICG-Sulfo-OSu和甘氨酸反应而合成的化合物(以下缩写为ICG-Gly)和ICG水溶液(生产自Pharmaceuticaland Medical Device Regulatory Science Society of Japan)定为参照样品。使用上述样品及基于分子量和结构的差异评价血中保持性和肿瘤蓄积。

【实施例5～实施例10】

将上述ICG-Sulfo-OSu用作近红外线有机染料，及将1mg(1.25μmol)的ICG-Sulfo-OSu溶解于100μl的DMSO。同时，将各种PEG称重进1.5mL塑料管。PEG由50mM碳酸盐缓冲液(pH9.0)溶解，从而NH₂浓度定为1.25mM。此处采用的各种PEG是单胺直链ME-50EA(生产自NOF公司,Mw 5,000)，单胺直链ME-100EA(生产自NOF公司,Mw 10,000)，单胺直链ME-200EA(生产自NOF公司,Mw 20,000)，单胺直链ME-300EA(生产自NOF公司,Mw 30,000)，单胺直链ME-400EA(生产自NOF公司,Mw 40,000)和二胺直链DE-200PA(生产自NOF公司,Mw 20,000)。以与在实施例1中相同的过程产生近红外线有机染料和PEG的共价-键合的产物，除了NH₂浓度倍增之外。表6显示本实施例中使用的样品。

[表6]

	采用的PEG产品名称	样品名称	PEG的分子量	形式
					实施例5	ME-50EA	M5k-ICG	5,000	单胺直链
实施例6	ME-100EA	M10k-ICG	10,000	单胺直链
					实施例7	ME-200EA	M20k-ICG	20,000	单胺直链
实施例8	ME-300EA	M30k-ICG	30,000	单胺直链
					实施例9	ME-400EA	M40k-ICG	40,000	单胺直链
实施例10	DE-200EA	D20k-ICG2	20,000	二胺直链

[小鼠身体表面上的光声测量]

为了检查以上制备的化合物在身体中移动，将M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG和M30k-ICG施用于裸鼠，和实施小鼠背部的身体表面的光声测量。以不发生对小鼠主要器官的干扰的方式选择在本实施例中的光声测量的测量区。因此，光声信号指示存在于血中的化合物的移动。各在施用之前，在施用之后60分钟，及在施用之后180分钟实施测量，及计算相对于施用之前的光声信号强度的相对声学强度。声学强度测量的结果总结于表7，其中辐射激光波长定为797nm。甚至在施用之后60分钟，PEG的分子量大于10k的化合物呈现等于施用之前的光声信号或施用之前的光声信号的2倍的高光声信号。因而指示，具有10k以上的分子量的与PEG键合的化合物是呈现相比NPL 1更高的血中保持性的光声造影剂。

[表7]

	样品名称	相对光声强度(施用后60分钟)	相对光声强度(施用后180分钟)
				实施例5	M5k-ICG	0.97	1
实施例6	M10k-ICG	2.22	1
				实施例7	M20k-ICG	2.39	1.76
实施例8	M30k-ICG	2.38	2.17

[身体中化合物的移动]

为了检查以上制备的化合物的血中保持性和肿瘤蓄积，将M5k-ICG，M10k-ICG，M20k-ICG，M30k-ICG，M40k-ICG和D20k-ICG2施用于已移植结肠26细胞系的带有肿瘤的小鼠的尾静脉。作为染料量的特定施用量是13nmol。

[评估血中保持性的方法]

在施用之后24小时从小鼠获取血样品，及将血，1％Triron，及DMSO在塑料管中以2:9:9混合。通过使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(生产自Caliper Life Science Inc.)定量血中的染料量，及以塑料管的状态测量荧光强度。血的每单位重量的相对于施用量(染料13nmol)的向血的染料迁移量的比例(％注射的剂量：缩写为％ID)作为血中化合物的保持性(％ID/g)显示于表8。结果确认，有随着PEG的分子量增加而余下血量增加的趋势。

[化合物的肿瘤蓄积]

将化合物施用于已移植结肠26细胞系的带有肿瘤的小鼠的尾静脉。作为染料量的特定施用量是13nmol。从小鼠获取血，及将小鼠用二氧化碳气体无痛处死。然后，对结肠26肿瘤组织去核。使得到的肿瘤组织块由实施例1中描述的方法经历肿瘤蓄积评估。结果显示于表8。因而指示，肿瘤蓄积随着PEG的分子量的增加而增加。

[表8]

	样品名称	血中保持性(％ID)	肿瘤蓄积量(％ID/g)
				实施例5	M5k-ICG	0.1	1.2
实施例6	M10k-ICG	2.8	5.6
				实施例7	M20k-ICG	16.8	12.4
实施例8	M30k-ICG	19.8	12.8
				实施例9	M40k-ICG	28.8	16.8
实施例10	D20k-ICG2	10.1	10.5
				对比例1	ICG-Gly	0.2	0.4
对比例2	ICG	0.16	0.1

【肿瘤部分的光声成像】

为了检查肿瘤成像的性能，以与[肿瘤蓄积的评估]中采用的相同的方式，将作为染料量26nmol施用于已移植结肠26细胞系的带有肿瘤的小鼠的尾静脉，及实施光声成像。此外，通过使ICG-Sulfo-OSu和甘氨酸以1:10的摩尔比反应合成的化合物(以下缩写为ICG-Gly)定为参照样品。在施用之后1小时实施光声成像，及计算相对于ICG-Gly的光声信号强度的相对光声信号强度。辐射激光波长定为797nm。

[表9]

	样品名称	相对光声强度(施用后1小时)
			实施例5	M5k-ICG	0.97
实施例6	M10k-ICG	2.22
			实施例7	M20k-ICG	2.39
实施例8	M30k-ICG	2.38
			对比例1	ICG-Gly	1

如显示于表8和表9的结果指示，化合物在肿瘤光声成像中呈现相比参照样品高的肿瘤蓄积，及指示，PEG的分子量和结构是重要参数。

【实施例11和实施例12】

[基于特定花青苷的染料和PEG的化合物2]

[标志物的产生]

在本实施例中，将由式(7)和(8)表示的化合物用作基于特定花青苷的化合物。采用的基于特定花青苷的染料由描述于NPL 2的方法产生。实施将1mg(1.25μmol)的染料溶解于100μl的DMSO。同时，对PEG称重，及使PEG溶解于氯仿和甲醇的混合的溶剂(体积比9:1)，从而NH₂浓度定为0.625mM。在实施例11中产生的化合物的化学结构式和在实施例12中产生的化合物的化学结构式分别由式(I-2)和式(I-3)表示。本实施例中采用的PEG衍生物是单胺直链ME-200EA(生产自NOF公司,Mw 20,000)。

染料和PEG以2的反应摩尔比反应。反应时的染料浓度定为0.6mM。在于室温在遮光条件下实施旋转搅拌24小时之后，通过蒸馏移出溶剂，及实施再分散进10mM HEPES缓冲溶液。尤其是，描述于式(8)的化合物不能单独分散进水，但通过与PEG形成共价键使分散进水成为可能。反应溶液用0.22μm注射器式滤器过滤，由此获得基于特定花青苷的染料和PEG共价-键合的化合物。化合物于4℃在遮光条件下存储。

[身体中移动的评估]

实施将100μl(作为染料13nmol)的M20k-ICGATT静脉内注射进带有肿瘤的小鼠模型，其中结肠26细胞皮下移植进BALB/cSlc-nu/nu小鼠。由实施例12中描述的方法评价在施用之后24小时的结肠26细胞团和血中的蓄积。其结果总结于表10。确认通过与PEG共价-键合，基于特定花青苷的染料获取水中的分散性，及当将此施用进身体时呈现肿瘤蓄积。

[表10]

	染料名称	肿瘤蓄积量(％ID/g)	血中保持性(％ID)
				实施例11	式(7)	9.95	18
实施例12	式(8)	1.9	0.14

[包括捕获分子的PEG]

【单链抗体hu4D5-8scFv的制备】

基于待键合于HER2的IgG的可变区的基因序列(hu4D5-8)产生编码单链抗体(scFv)的基因hu4D5-8scFv。起初，通过连接hu4D5-8的VL和VH基因与编码肽(GGGGS)₃的cDNA来产生cDNA。将限制酶NcoI导入5’-端，并将限制酶的识别位点NotI导入3’-端。碱基序列如下所示。

SEQ ID NO:1：

5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’

(限制酶的识别位点加了下划线)

将上述基因分段hu4D5-8scFv插入质粒pET-22b(+)(生产自Novagen)的T7/lac启动子的下游。特别是，将上述cDNA与经历用限制酶NcoI和NotI消化处理的pET-22b(+)连接。

将此表达质粒转化进大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，由此获得表达株。将得到的株在4ml的LB-Amp培养基中预培养过夜，将全量添加到250ml的2xYT培养基，及于28℃和120rpm实施振摇培养8小时。然后，加入异丙基-β-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度成为1mM，和于28℃实施培养过夜。使培养的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)经历于4℃以8,000×g离心分离30分钟，及回收其上清培养液。添加得到的培养液重量的60％的硫酸铵，由此通过加盐析出沉淀蛋白。使溶液经历加盐析出操作于4℃静置过夜，及使经历于4℃以8,000×g离心分离30分钟，由此回收沉淀物。将得到的沉淀物溶解于20mM Tris-HCL/500mM NaCl缓冲剂，及透析进1L的相同的类型的缓冲剂。在透析之后，将蛋白溶液加入填充His-Bind(注册商标)树脂(生产自Novagen)的柱，及由金属螯合亲和层析经Ni离子精制。基于还原性SDS-PAGE确认精制的hu4D5-8scFv呈现单条带，和分子量是约28kDa。制备的抗体的氨基酸序列如下所示。以下将hu4D5-8scFv缩写为scFv。

SEQ ID NO:2

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC

[PEG用scFv的修饰]

将如上述制备的scFv的缓冲剂用含有5mM的EDTA的磷酸盐缓冲液(2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mMNa2HPO4/5mM EDTA,pH7.4)取代。然后，还原处理用以摩尔基础10倍量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)于25℃实施约2小时。

同时，将单马来酰亚胺直链ME-400MA(生产自NOF公司,MW40,000)称重进1.5mL塑料管。用不含有EDTA的磷酸盐缓冲液实施稀释至成为17.9μM，实施与经历上述还原处理的scFv混合，然后，于25℃诱导反应15小时以上。以装载基础的反应摩尔比(scFv/PEG)定为1。在本文中，术语"装载"指称添加到反应系统，及术语"以装载基础的反应摩尔比"指称添加到反应系统的scFv与PEG的摩尔浓度比。随后，将DMSO中ICG-Sulfo-OSu的溶液(12.5mM)与上述scFv和PEG的混合的溶液混合，及于25℃诱导反应2小时。以装载基础的反应摩尔比(ICG-Sulfo-OSu/scFv)定为3。将得到的溶液用滤器(孔径1.2μm)过滤，然后，通过使用具有30kDa孔径的AmiconUltra-4(生产自Nihon Millipore K.K.)超滤去除不与PEG键合的scFv，由此获得用ICG和scFv修饰的PEG。由此获得的化合物缩写为scFv-PEG40。

[用Affibody(注册商标)的PEG的修饰]

将二硫苏糖醇(DTT)溶液加入待键合于HER2的Affibody(注册商标)的溶液(生产自Affibody)至终浓度成为20mM，及于25℃在遮光条件下实施还原处理2小时。从反应溶液通过使用PD-10柱(生产自GE Healthcare)除去DTT。将单马来酰亚胺直链ME-200MA(生产自NOF公司,MW 20,000)和单马来酰亚胺直链ME-400MA(生产自NOF公司,MW 40,000)独立地称重进1.5mL塑料管。将称重的PEG用不含有EDTA的磷酸盐缓冲液稀释至成为143μM，及与经历上述还原处理的Affibody(注册商标)混合。然后，于25℃诱导反应15小时以上。以装载基础的反应摩尔比(Affibody(注册商标)/PEG)定为1。将DMSO中ICG-Sulfo-OSu的溶液(12.5mM)与上述Affibody(注册商标)和PEG的混合的溶液混合，及于25℃诱导反应2小时。以装载基础的反应摩尔比(ICG-Sulfo-OSu/Affibody(注册商标))定为1。将得到的溶液用滤器(孔径1.2μm)过滤，然后，通过使用具有10kDa的孔径的Amicon Ultra-4(生产自Nihon Millipore K.K.)超滤去除不与PEG键合的Affibody(注册商标)，由此获得用ICG和Affibody(注册商标)修饰的PEG。在由此获得的化合物中，通过使用ME-200MA的化合物缩写为Af-PEG20和通过使用ME-400MA的化合物缩写为Af-PEG40。

[PEG用肽的修饰]

合成6个氨基酸附加到具有与HER2键合的确保的性质的肽序列的羧基末端的肽(SEQ ID NO:3)。存在于此肽序列的羧基末端的半胱氨酸残基可与马来酰亚胺基反应，由此形成共价键。

SEQ ID NO:3

MARSGLGGKGSC

将单马来酰亚胺直链ME-200MA(生产自NOF公司,MW 20,000)和单马来酰亚胺直链ME-400MA(生产自NOF公司,MW 40,000)独立地称重进1.5mL塑料管。将称重的PEG用不含有EDTA的磷酸盐缓冲液稀释至成为1.57mM及与上述肽溶液混合。然后，于25℃诱导反应15小时以上。以装载基础的反应摩尔比(肽/PEG)定为1。将DMSO中ICG-Sulfo-OSu的溶液(12.5mM)与上述肽和PEG的混合的溶液混合，及于25℃诱导反应2小时。以装载基础的反应摩尔比(ICG-Sulfo-OSu/肽)定为1。得到的溶液用滤器(孔径1.2μm)过滤，然后，通过使用具有10kDa孔径的Amicon Ultra-4(生产自NihonMillipore K.K.)超滤来去除不与PEG键合的肽，由此获得用ICG和肽修饰的PEG。在由此获得的化合物中，通过使用ME-200MA的化合物缩写为pe-PEG20和通过使用ME-400MA的化合物缩写为pe-PEG40。

[包括捕获分子的PEG与HER2的键合性质的评估]

由表面等离子体共振方法(SPR)评价包括捕获分子的PEG对充当靶分子的HER2的键合性质。在SPR中，通过使用Proteon(注册商标)XPR36(生产自Bio-Rad Laboratories)实施测量。使重组人ErbB2/Fc嵌合体(生产自R&D Systems)溶解于乙酸盐缓冲液(pH5.0)，及在GLM传感器芯片表面，由胺偶联固定于羧基。固定量是约3,000RU(共振单位)。随后，将包括捕获分子的PEG用含有0.005％的Tween20的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释到各浓度，及以50μl/min的流速注入流动池。至于测量时间，注射时间(键合)是120s和在注射停止之后的经过时间(解离)是120s。在键合动力学分析实验中，通过使用1:1Langmuir拟合模型分析传感图。计算的结合解离常数(K_D)共同显示于表11。关于每样品确保对HER2的键合性质。尤其是，关于scFv-PEG40，Af-PEG20和Af-PEG40确保强键合性质。

[表11]

样品名称	采用的PEG产品名称	捕获分子的类型	PEG的分子量	K_D[nM]
					scFv-PEG40	ME-200MA	scFv	40000	4.2
Af-PEG20	ME-200MA	Affibody(注册商标)	20000	9.7
					Af-PEG40	ME-400MA	Affibody(注册商标)	40000	2.3
pe-PEG20	ME-200MA	肽	20000	2600
					pe-PEG40	ME-400MA	肽	40000	3100

[包括捕获分子的PEG的肿瘤蓄积的评估]

在肿瘤蓄积的评估中，使用雌性远亲杂交种系BALB/c Slc-nu/nu小鼠(购买时6周龄)(日本SLC Inc.)。在小鼠移植肿瘤之前，使小鼠适应于能自由地消费膳食和饮用水的环境数周，而采用标准膳食和垫料。在成像实验之前约1周，将1×10⁶的结肠26小鼠结肠癌细胞(RIKEN)皮下注射进小鼠的各右肩和右股和将1×10⁶的含有人工导入的HER2基因的结肠26小鼠结肠癌细胞皮下注射进小鼠的各左肩和左股。直到实验时，全部肿瘤建立，和小鼠重量是17～22g。实施将200μl(作为ICG是13nmol)的包括捕获分子或D20k-ICG2的PEG静脉内注射进带有肿瘤的小鼠。在施用之后24小时，将小鼠用二氧化碳气体无痛处死。随后，将各癌组织去核。将癌组织转移到塑料管，添加癌组织重量的1.25倍的1％Triton-X100水溶液，及通过使用塑料研杵产生匀浆物。然后，添加癌组织重量的20.25倍的DMSO，由此制备自肿瘤组织提取的染料溶液。同时，对来自未施用包括捕获分子的PEG的带有肿瘤的小鼠的癌组织去核。将癌组织转移到塑料管，添加癌组织重量的1.25倍的1％Triton-X100水溶液，及通过使用塑料研杵产生匀浆物，由此制备含有肿瘤组织的Triton-X100溶液。然后，用上述含有癌组织的Triton-X100溶液将已知道的浓度的包括捕获分子的PEG的溶液稀释至各浓度。通过添加得到的稀释的溶液量的20.25倍的DMSO来制备校准用标准溶液。通过使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(XENOGEN)定量癌组织中的染料量，及以塑料管状态测量自肿瘤组织提取的染料溶液和校准用标准溶液的荧光强度。

在上述肿瘤蓄积的评估中，在施用之后24小时即将小鼠用二氧化碳气体无痛处死之前，从尾静脉获取血。将得到的血转移到塑料管，添加血体积的4.5倍的1％Triton-X100水溶液。然后添加血体积的4.5倍的DMSO，由此制备含有血的溶液。通过使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(XENOGEN)，以塑料管的状态测量含有血的溶液的荧光强度。同时，将具有知道的浓度的粒子溶液用1％Triton-X100水溶液稀释至各种浓度。将稀释的粒子溶液和等同量的自未施用的小鼠取的血混合。随后，加入1％Triton-X100水溶液，至包括上述稀释的粒子溶液体积的体积成为血体积的4.5倍。然后，通过添加血体积的4.5倍的DMSO产生校准曲线用血粒子溶液。测量荧光强度，及随所取的血样品形成校准曲线。接下来，通过使用含有血的溶液的荧光强度和形成的校准曲线计算血中浓度。各计算的血中浓度除以总施用量，由此计算每施用量血中丰度的比例(％ID)。

肿瘤蓄积的结果和血中丰度的结果总结于图3。蓄积到结肠26小鼠结肠癌细胞的量由白色指示，蓄积到含有人工导入的HER2基因的结肠26小鼠结肠癌细胞的量由黑色指示，及每施用量血中丰度的比例由灰色指示。

全部包括捕获分子的PEG呈现肿瘤蓄积相比D20k-ICG2减少的趋势。但是，至于Af-PEG40，其能确定与之比较的静置的血中的肿瘤蓄积和丰度。此外，计算相对于蓄积到结肠26小鼠结肠癌细胞的量的蓄积到含有人工导入的HER2基因的结肠26小鼠结肠癌细胞的量的比，及总结于表12。全部包括捕获分子的PEG蓄积到含有人工导入的HER2基因的结肠26小鼠结肠癌细胞的量相比D20k-ICG2的那些大。因此查明，捕获分子对与HER2键合的性质的效应。

[表12]

样品名称	肿瘤蓄积量的结肠26(HER2)/结肠26(WT)比
		scFv-PEG40	2.0
Af-PEG20	1.1
		Af-PEG40	0.91
pe-PEG20	0.76
		pe-PEG40	0.88
M20k-ICG	0.60

尽管已参照例示实施方式描述本发明，需知，本发明不限于公开的例示实施方式。以下权利要求的范围应被最宽解释，由此包括全部该修饰和相当的结构和功能。

本申请要求2012年7月20日提交的日本专利申请No.2012-161642的优先权，其通过引用以其整体在本文合并。

Claims

1.以下式(I)～(IV)之任一个表示的化合物，

[化学式2]

A-L¹-(CH₂)_p-(OCH₂CH₂)_m-O-(CH₂)_q-L²-A' (I)

[化学式3]

A-L¹-(CH₂)_p-(OCH₂CH₂)_m-O-(CH₂)_q-L²-M (II)

[化学式4]

N-L¹-(CH₂)_p-(OCH₂CH₂)_m-O-(CH₂)_q-L²-A (III)

[化学式5]

A-L¹-(CH₂)_p-(OCH₂CH₂)_m-O-R (IV)

在式(I)中，A和A'独立地表示以下式(i)～式(vi)之任一个，及在以下式(i)～(vi)中的符号*键合于式(I)中的L¹或L²，

在式(I)中，L¹和L²独立地表示是-NH-、-O-、-S-及-CO-之任一种或含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分，p和q独立地表示1～5的整数，及m表示10以上且2,500以下的整数，

在式(II)和式(III)中，A表示以下式(i)～(vi)之任一个，及在以下式(i)～(vi)中的符号*键合于式(II)中的L¹或式(III)中的L²，

在式(II)和式(III)中，L¹和L²独立地表示是-NH-、-O-、-S-及-CO-之任一种或含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分，p和q独立地表示1～5的整数，及m表示10以上且2,500以下的整数，

在式(II)中，在L²是-NH-、-O-及-S-之任一种的情况中，M是氢原子，及在L²是-CO-的情况中，M是羟基，

在式(III)中，在L¹是-NH-、-O-及-S-之任一种的情况中，N是氢原子，及在L¹是-CO-的情况中，N是羟基，

在式(IV)中，A表示以下式(i)～式(vi)之任一个，及在以下式(i)～(vi)中的符号*键合于式(IV)中的L¹，

在式(IV)中，L¹表示是-NH-、-O-、-S-及-CO-之任一种或含有-NH-、-O-、-S-及-CO-中的至少一种的接头部分，p表示1～5的整数，m表示10以上且2,500以下的整数，及R表示氢原子和具有1～5的碳数的取代的或未经取代的烷基中的任一种，

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

[化学式11]

在式(i)～(vi)中，Z和氢原子、磺酸基或与Z键合的吲哚环一起形成由苯并[e]吲哚环、苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环组成的环状芳族环，及此外，环状芳族环的氢原子可被具有1～10的碳数的烷基、具有1～10的碳数的烷氧基或磺酸基取代，

在式(i)～(vi)中，R¹表示下列中的任一种：具有1～10的碳数的烷基及-(CH₂)_b-SO₃ ^-(b表示1～10的整数)，在R¹是烷基的情况中，可含有卤素离子或有机酸离子作为对离子，及R²和R³独立地表示下列中的任一种：氢原子、具有1～10的碳数的烷基、具有1～10的碳数的烷氧基、-(CH₂)_b-SO₃ ^-(b表示1～10的整数)及-(CH₂)_b-SO₃X(b表示1～10的整数和X表示钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸中的任一种)，

在式(i)及(ii)中，a表示1～10的整数，

在式(i)～(vi)中，n表示2或3，

在式(ii)中，(iv)及(vi)，R⁴表示下列中的任一种：具有1～10的碳数的烷基及-(CH₂)_b-SO₃X(b表示1～10的整数和X表示钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸中的任一种)，

在式(iii)及(iv)中，L³表示取代的或未经取代的烷基，其具有1～10的碳数，且其可包括羰基、酰胺基、酯基或哌嗪基作为取代基，以及

2.权利要求1的化合物，其中式(I)～(IV)中的m是100以上且500以下的整数。

3.权利要求1或权利要求2的化合物，其中式(I)中的两个A均由式(i)表示。

4.权利要求1或权利要求2的化合物，其中式(IV)中的A由式(i)表示。

5.权利要求1～4之任一项的化合物，其中所述式(i)由以下式(i-1)～(i-6)之任一个表示，

[化学式11]

[化学式12]

在式(i-2)中，Y^-表示卤素离子或有机酸离子。

[化学式13]

[化学式14]

[化学式15]

[化学式16]

在式(i-3)～(i-6)中，X表示下列中的任一种：钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸。

6.权利要求1～4之任一项的化合物，其中所述式(ii)由以下式(ii-1)或式(ii-2)表示，

[化学式17]

[化学式18]

在式(ii-1)～(ii-2)中，X表示下列中的任一种：钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸。

7.权利要求1～4之任一项的化合物，其中所述式(iii)由以下式(iii-1)或式(iii-2)表示，

[化学式19]

[化学式20]

8.权利要求1～4之任一项的化合物，其中所述式(iv)由以下式(iv-1)或式(iv-2)表示，

[化学式21]

[化学式22]

在式(iv-1)～(iv-2)中，X表示下列中的任一种：钠、钾、铵、三乙基铵、赖氨酸和精氨酸。

9.权利要求1～8之任一项的化合物，其还包含捕获分子。

10.权利要求9的化合物，其中所述接头部分是捕获分子。

11.权利要求10的化合物，其中所述捕获分子是多肽或单链抗体中的任一种。

12.权利要求1～8之任一项的化合物，其中L¹和L²中的至少一种由以下式(xi)表示，

[化学式23]

在式(xi)中，L⁵表示多肽或单链抗体，-NH-表示介经多肽或单链抗体中的氨基酸的氨基的键，-S-表示介经多肽或单链抗体中的氨基酸的氢硫基的键，L⁶表示烷基链，其具有1～10的碳数，且其可包括羰基、酰胺基、酯基及哌嗪基中的任一种作为取代基，符号**键合于符号*，及符号***键合于式(I)～(IV)的烷基链侧或乙二醇链侧。

13.权利要求12的化合物，其中式(xi)中的L⁶由以下式(xii)表示，

-(CH₂)₂-C(＝O)-NH-(xii)

在式(xii)中，亚乙基中的碳键合于式(xi)中的马来酰亚胺基中的氮，及-NH-中的氮键合于式(xi)中的符号***。

14.光成像造影剂，其包含权利要求1～13之任一项的化合物和分散介质。

15.权利要求14的光成像造影剂，其还包含添加剂。