CN104458937B - 一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质检测方法 - Google Patents

Abstract

一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质的检测方法：采用高效液相色谱法进行检测，预处理柱和分析色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为50mmol·L^‑1磷酸二氢钠溶液(稀磷酸调节pH值至4.0)‑乙腈‑甲醇(40∶25∶35)，流速为1.0mL·min^‑1，检测波长为220nm。方法操作简单，测定准确，专属性强，适用于丁酸氯维地平脂肪乳中有关物质的测定。

Description

一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质检测方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相分析方法，特别是涉及一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质的高效液相检测方法。

背景技术

氯维地平(Clevidipine)属于二氢吡啶衍生物，是一种超短效的静脉注射用钙通道阻断剂。氯维地平具有高度的血管及心肌选择性，其起效快，作用消除也快，可递增剂量精确地控制血压。

丁酸氯维地平的化学名称为(±)-4-(2’，3’-二氯苯基)-2，6-二甲基-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸甲基(丁酰氧基甲基)酯，其分子式为C₂₁H₂₃Cl₂NO₆，分子量为456.3，结构式如式(I)所示：

丁酸氯维地平容易降解，其降解途径如下(C305为丁酸氯维地平)：

因此，有必要建立灵敏的分析方法来检测控制其有关物质。专利CN2011103920401公开了丁酸氯维地平原料的有关物质分析方法，其将原料配置成0.2mg/ml的溶液进行测定。而丁酸氯维地平脂肪乳由于是乳剂，药品包含在脂肪乳中，通常需进行破乳，将药物从脂肪乳中释放出来后方能检测。如丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中样品制备方法为将样品原液(10mg·mL^-1)用四氢呋喃∶异丙醇(5∶3)稀释10倍，作为供试品溶液。如氟比洛芬酯注射液中样品制备方法为将样品原液(10mg·mL^-1)用无水乙醇稀释100倍，作为供试品溶液。上述方法适合原液浓度较高的样品，对于低浓度样品(如丁酸氯维地平脂肪乳中药物浓度为0.5mg/ml)，如果按上述方式稀释，很可能将达不到定量限甚至检测限。

因此需要建立一种稳定可控的质量分析方法检测丁酸氯维地平脂肪乳的有关物质，以克服上述现有技术的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质的检测方法。

本发明的技术方案如下：

采用高效液相色谱法进行检测，预处理柱和分析色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为50mmol·L^-1磷酸二氢钠溶液(稀磷酸调节pH值至4.0)-乙腈-甲醇(40∶25∶35)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为220nm。预处理柱子规格为3cm×4mm，5μm，分析色谱柱规格为150cm×4.6mm，3.5μm。

供试品溶液的配置：丁酸氯维地平脂肪乳注射液直接进样或者采用流动相稀释至丁酸氯维地平浓度为0.1～0.5mg/mL后进样。

本发明还包括预处理柱冲洗装置，包括预处理柱G，液相色谱泵J2，六通阀A和六通阀B，六通阀A和B通过两条通路连接，六通阀A连接预处理柱G和液相色谱泵J2，六通阀B连接分析色谱柱F及液相色谱泵J1。

本发明还包括一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质连续进样检测方法，步骤如下：

(1)供试品溶液经进样器进样后，流动相带着样品经六通阀B2→B1→A2→A1→预处理柱G→A4→A3→B6→B5→分析色谱柱F；

(2)供试品溶液运行完毕后切换六通阀B，断开预处理柱G，流动相经六通阀B2→B3→B4→B5→分析色谱柱F；

(3)切换六通阀A，反冲洗液经六通阀A5→A4→预处理柱G→A1→A6→反冲洗液废液，反冲5分钟后，切换六通阀A，反冲洗液经六通阀A5→A6→反冲洗液废液；

(4)切换六通阀B，流动相经六通阀B2→B1→A2→A1→预处理柱G→A4→A3→B6→B5→分析色谱柱F。

本发明的检测方法丁酸氯维地平的检测浓度为0.1～0.5mg·mL-1，定量限为100ng·mL-1(相对浓度0.04％)，丁酸氯维地平与相关杂质均得到了良好的分离。方法操作简单，测定准确，专属性强，适用于丁酸氯维地平脂肪乳中有关物质的测定。

附图说明

图1：系统适用性试验HPLC图；

图2：供试品加热破坏HPLC图；

图3：供试品光照破坏HPLC图

图4：供试品碱破坏HPLC图

图5：供试品酸破坏HPLC图

图6：供试品氧化破坏HPLC图

图7：预处理柱反冲系统图

附图7标记说明：A：六通阀A；B：六通阀B；C：进样器；D：流动相；E：压力校正柱；F：分析色谱柱；G：预处理柱；H：反冲洗液；I：反冲洗液废液；J：液相色谱泵。

具体实施例

对比实施例1

不加预处理柱，色谱柱为Symmetry shield RP18(150cm×4.6mm，3.5μm)，流动相为50mmol·L^-1磷酸二氢钠溶液(稀磷酸调节pH值至4.0)-乙腈-甲醇(40∶25∶35)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为220nm，柱温为30℃，进样量为20μl。

采用破乳方法：丁酸氯维地平脂肪乳中药物浓度为0.5mg/ml，而丁酸氯维地平脂肪乳中油相占20％，意味着需要加入更多的破乳剂(10倍以上)，此时样品中药物浓度被稀释至0.05mg/ml以下，更难以检测到有关物质，无法保证方法的准确性和可靠性。

如果供试品不破乳，直接进样则导致基线波动，干扰有关物质的测定。

实施例1 系统适用性试验

色谱条件

预处理柱：C₁₈柱(3cm×4mm，5μm)；色谱柱为Symmetry shield RP18(150cm×4.6mm，3.5μm)，流动相为50mmol·L^-1磷酸二氢钠溶液(稀磷酸调节pH值至4.0)-乙腈-甲醇(40∶25∶35)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为220nm，柱温为30℃，进样量为20μl。

供试品溶液的制备

将原液用流动相直接稀释1倍后作为供试品溶液

系统适应性

取杂质I对照品、杂质II对照品、杂质III对照品和丁酸氯维地平对照品，分别加流动相溶解并稀释至适当浓度。按照上述色谱条件，分别量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，确定各色谱峰的位置。再将上述溶液按比例混合得混合对照溶液，取上述混合对照溶液进样，记录色谱图。结果显示：在该色谱条件下，基线平稳，丁酸氯维地平主峰理论塔板数为16647，混合对照样品中各杂质分离度均大于1.5。色谱图见图1。

实施例2 破坏性试验

高温破坏

取丁酸氯维地平脂肪乳注射液(批号：20121001批)1mL，于60℃烘箱中放置3天，再用流动相稀释成0.25mg·mL-1的供试品溶液，按照上述色谱条件进样。色谱图见图2。

光照破坏

取丁酸氯维地平脂肪乳注射液(批号：20121001批)1mL，低温光照5000Lx环境中放置10天，再用流动相稀释成0.25mg·mL-1的供试品溶液，按照上述色谱条件进样。色谱图见图3。

酸破坏

取丁酸氯维地平脂肪乳注射液(批号：20121001批)1mL，加0.1mol·L-1的盐酸溶液1mL，室温避光放置3天，按照上述色谱条件进样。色谱图见图4。

碱破坏

取丁酸氯维地平脂肪乳注射液(批号：20121001批)1mL，加0.1mol·L-1的氢氧化钠溶液1mL，室温避光放置8h，按照上述色谱条件进样。色谱图见图5。

氧化破坏

取丁酸氯维地平脂肪乳注射液(批号：20121001批)1mL，加3％双氧水1mL，室温避光放置3天，按照上述色谱条件进样。色谱图见图6。

结果显示，未破坏样品中主要杂质为杂质I、杂质II和杂质III，本品在光照条件下易降解，主要降解产物为杂质II，但该降解产物在避光条件下不增长；在高温和酸破坏条件下，杂质III增加；在氧化破坏条件下，杂质I有所增加，在碱破坏条件，杂质I明显增加；在该色谱条件下，各破坏试验杂质均能与主峰的基线分离，表明该色谱系统的专属性较好，能有效检测本品的杂质。

实施例3 检测限

以信噪比为3∶1的浓度为检测限检测溶液，进样20μL，重复6次。结果丁酸氯维地平、杂质I、杂质II和杂质III的最低检测限分别为30.26，1.47，3.71，7.80ng·mL^-1。丁酸氯维地平的检测限水平为0.012％，杂质I的检测限水平为0.001％，杂质II的检测限水平为0.001％，杂质III的检测限水平为0.003％。

实施例4 定量限

以信噪比为10∶1的浓度为定量限检测溶液，进样20μL，重复6次。结果丁酸氯维地平、杂质I、杂质II和杂质III的最低定量限分别为100.88，4.91，12.38，26.00ng·mL^-1。丁酸氯维地平的定量限水平约为0.040％，杂质I的定量限水平为0.002％，杂质II的定量限水平为0.005％，杂质III的定量限水平为0.010％。

实施例5 线性

丁酸氯维地平线性

取丁酸氯维地平对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成5μg·mL^-1的溶液，精密量取该溶液适量，用流动相稀释为0.40，0.50，0.60，0.75，0.99，2.49μg·mL^-1的系列溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以浓度(C，μg·mL^-1)对峰面积(A)进行线性回归，得到方程：A＝53239C-92.246(r＝0.9998，n＝6)。结果表明，丁酸氯维地平在0.40～2.49μg·mL^-1的浓度范围内，线性关系良好。

杂质I线性

取杂质I对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成7.5μg·mL^-1的溶液，精密量取该溶液适量，用流动相稀释为0.07，0.37，0.60，0.75，1.12，1.50，3.00μg·mL^-1的系列溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以浓度(C，μg·mL^-1)对峰面积(A)进行线性回归，得到方程：A＝54381C+11795(r＝0.9930，n＝7)。结果表明，杂质I在0.07～3.00μg·mL^-1浓度范围内，线性关系良好。

杂质II线性

取杂质II对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成5μg·mL^-1的溶液，精密量取该溶液适量，用流动相稀释为0.03，0.40，0.50，0.60，0.75，1.00，2.49μg·mL^-1的系列溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以浓度(C，μg·mL^-1)对峰面积(A)进行线性回归，得到方程：A＝54973C+440.09(r＝1.0000，n＝7)。结果表明，杂质II在0.30～2.49μg·mL^-1浓度范围内，线性关系良好。

杂质III

取杂质III对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成5μg·mL^-1的溶液，精密量取该溶液适量，用流动相稀释为0.45，0.56，0.67，0.84，1.11，2.79μg·mL^-1的系列溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以浓度(C，μg·mL^-1)对峰面积(A)进行线性回归，得到方程：A＝49286C-449.15(r＝0.9999，n＝6)。结果表明，杂质III在0.45～2.79μg·mL^-1浓度范围内，线性关系良好。

实施例6 精密度

重复性

取杂质I对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成1.25μg·mL^-1的溶液，作为杂质I对照品溶液。精密量取本品5mL(约相当于丁酸氯维地平2.5mg)，置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制6份。精密量取杂质I对照品溶液、供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算6份溶液中杂质I含量，按面积归一化法计算杂质II、杂质III含量，并计算其含量的RSD值。结果6份样品杂质I含量的RSD为1.54％，杂质II含量的RSD为4.52％，杂质III含量的RSD为9.03％，表明该方法重复性良好。

中间精密度

取本品，按照重复性项下方法，由不同的分析人员、不同时间对同一批次样品进行测定。按外标法以峰面积计算6份溶液中杂质I含量，按面积归一化法计算杂质II、杂质III含量，并与重复性结果进行比较，计算其RSD值。结果12份样品杂质I含量的RSD为1.68％，杂质II含量的RSD为8.41％，杂质III含量的RSD为8.07％，表明该测定方法精密度良好。

实施例7 加样回收率

取杂质I对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成12.5μg·mL^-1的溶液，作为杂质I对照品贮备液。精密量取杂质I对照品贮备液适量，加流动相稀释成1.25μg·mL^-1的溶液，作为杂质I对照品溶液。精密量取丁酸氯维地平脂肪乳注射液5mL，置10mL量瓶中，共9份，分别加入一定量杂质I对照品贮备液(0.5mL-50％、1.0mL-100％、1.5mL-150％)，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收率溶液。每个浓度水平平行配制3份。

精密量取杂质I对照品溶液、回收率溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果表明杂质I的平均回收率为99.3％，RSD符合要求，表明该方法准确度好。

实施例8 溶液稳定性

精密量取本品5mL(约相当于丁酸氯维地平2.5mg)，置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。于室温避光条件下放置，分别于0、1、2、4、6、8h进样20μL，记录峰面积，计算RSD。结果丁酸氯维地平、杂质I的RSD分别为0.35％，0.98％，表明其溶液在室温条件下放置8h稳定。

实施例9 有关物质测定

按照上述色谱条件，分别取20121001，20121002，20121003批丁酸氯维地平脂肪乳注射液适量，加流动相稀释制成每1mL中约0.25mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用流动相定量稀释制成每1mL中含0.5μg的溶液，作为对照溶液。另取杂质I对照品，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含1.25μg的溶液，作为杂质I对照品溶液；精密量取供试品溶液、对照溶液和杂质I对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。结果表明，三批自制样品的杂质含量基本相当。数据见表1。

表1 丁酸氯维地平脂肪乳注射液有关物质检验结果

实施例10 预处理柱的反冲系统

为保证样品的重复在线检测，对预处理柱进行反冲，反冲系统为一个冲洗预处理柱的泵，两个六通阀，预处理柱反冲洗液为无水乙醇，冲洗流速：2.0mL·min^-1。

流路工作状态：见表3和图7。

表3 自动预处理装置流路工作状态

*1)供试品溶液运行完毕后，反冲5min

*2)*1)反冲完毕进行系统平衡

反冲方法：

第一次动作：进样。供试品溶液经进样器进样后，流动相带着样品经六通阀B2→B1→A2→A1→预处理柱G→A4→A3→B6→B5→分析色谱柱F。此阶段样品在此过程中样品破乳，样品中的大部分辅料吸附于预处理柱，样品中其他成份已通过预处理柱到分析色谱柱。

第二次动作：供试品溶液运行完毕后切换六通阀B，断开预处理柱G，流动相经六通阀B2→B3→压力校正柱E→B4→B5→分析色谱柱F，切换到压力校正柱是为了保证分析过程中压力无过大波动。

第三次动作：切换六通阀A，反冲洗液H经六通阀A5→A4→预处理柱G→A1→A6→反冲洗液废液I。预处理柱反洗阶段。反冲5分钟后，切换六通阀A，反冲洗液H经六通阀A5→A6→反冲洗液废液I。预处理柱反洗完毕。

第四次动作：切换六通阀B，流动相经六通阀B2→B1→A2→A1→预处理柱G→A4→A3→B6→B5→分析色谱柱F，平衡预处理柱及分析色谱柱，等待下一次进样。

Claims (2)

1.一种丁酸氯维地平脂肪乳有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，预处理柱和分析色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中预处理柱规格为3cm×4mm，5μm，分析色谱柱规格为150cm×4.6mm，3.5μm，流动相为50mmol·L^-1磷酸二氢钠溶液，用稀磷酸调节pH值至4.0-乙腈-甲醇＝40∶25∶35，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为220nm；

所述的检测方法含有预处理柱的冲洗装置，其包括预处理柱G，液相色谱泵J2，六通阀A和六通阀B，六通阀A和B通过两条通路连接，六通阀A连接预处理柱G和液相色谱泵J2，六通阀B连接分析色谱柱F及液相色谱泵J1，进样冲洗方法步骤如下：

(1)供试品溶液经进样器进样后，流动相带着样品经六通阀B2→B1→A2→A1→预处理柱G→A4→A3→B6→B5→分析色谱柱F；

(2)供试品溶液运行完毕后切换六通阀B，断开预处理柱G，流动相经六通阀B2→B3→B4→B5→分析色谱柱F；

(3)切换六通阀A，反冲洗液经六通阀A5→A4→预处理柱G→A1→A6→反冲洗液废液，反冲5分钟后，切换六通阀A，反冲洗液经六通阀A5→A6→反冲洗液废液；

(4)切换六通阀B，流动相经六通阀B2→B1→A2→A1→预处理柱G→A4→A3→B6→B5→分析色谱柱F。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，丁酸氯维地平脂肪乳注射液直接进样或者采用流动相稀释至丁酸氯维地平浓度为0.1～0.5mg/mL后进样。