CN104450587A - 一种可应用于水中可生物降解有机物和微生物污染监测的混合菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可应用于水中可生物降解有机物和微生物污染监测的混合菌剂及其制备方法。该菌剂的活性成分为克雷伯氏菌、气单胞菌、丛毛单胞菌、寡养单胞菌、不动杆菌、微杆菌和希瓦氏菌的一株或几株菌的组合，每株菌10-100份。本发明的菌剂可以应用于地表水、地下水、水源水和微污染水中可生物降解有机物的测定，以及用于预测微生物污染，在环境水质监测中具有重要的作用。

Description

一种可应用于水中可生物降解有机物和微生物污染监测的混合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种可应用于水中可生物降解有机物和微生物污染监测的混合菌剂及其制备方法，特别涉及该混合菌剂作为测试菌剂用于测定水源水和饮用水中的可生物降解有机物，能够对水质微生物污染起到监测作用，属于微生物学和环境监测领域。
背景技术
近年来，由于污染事故频发和水源水的常态污染，我国的水源水和饮用水安全正面临着严峻挑战。在此形势下，水源水和饮用水微生物污染的风险预警就显得尤为重要。当水体中可供微生物利用的有机物超过一定浓度时，就会导致微生物过度生长，从而引发微生物污染事故。
水源水和饮用水中有机物种类繁多，其中能够被异养菌无机化的部分称为可生物降解有机物。可生物降解有机物与异养细菌在水体中的生长密切相关，是研究水源水和饮用水生物稳定性所要关注的重要的指标。目前，国内外对可生物降解有机物的测定主要有两个方法：一类是在待测水样中接入特殊细菌，通过平板计数法，测定结果被称为可同化有机碳（AOC）；另一类方法通过测定水样培养前后溶解性有机碳（DOC）的差值来确定水样中可生物降解溶解性有机碳（BDOC）的值。这两种方法从接种液的准备到整个测定过程的完成，需要花费20-30天，耗时较长，使得测定结果缺乏时效性，对水质微生物污染爆发的预警作用不大。
因此，很有必要开发一种新的测定方法和相应的菌剂替代现有的测定方法，提高测定结果的时效性，加强对水质微生物污染的监测。
发明内容
本发明的目的是提供一种可应用于水中可生物降解有机物和微生物污染监测的混合菌剂，适用于对地表水、地下水、水源水和微污染水中含有的可生物降解有机物进行测定，进而预警水源水和饮用水微生物污染事故爆发的可能性。
本发明提供了一种混合菌剂，该菌剂的活性成分为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、气单胞菌（Aeromonas sp.）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、微杆菌（Exiguobacterium sp.）和希瓦氏菌（Shewanella sp.）的一株或几株细菌的组合，每株细菌10-100份。
该发明的混合菌剂的所有菌株均是由发明人将某生活污水处理厂二次沉淀池的活性污泥通过驯化培养后分离筛选获得的。这些菌株的具体信息如下：克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）的保藏号为CCTCC M 2014600，气单胞菌（Aeromonas sp.）的保藏号为CCTCC M 2014601，丛毛单胞菌（Comamonas sp.）的保藏号为CCTCC M 2014602，寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）的保藏号为CCTCC M 2014603，不动杆菌（Acinetobacter sp.）的保藏号为CCTCC M 2014604，微杆菌（Exiguobacterium sp.）的保藏号为CCTCC M 2014605，希瓦氏菌（Shewanella sp.）的保藏号为CCTCC M 2014606。
该混合菌剂可用于快速测定水样中的可生物降解有机物浓度，其检测的基本原理：通过微生物利用水体中的可生物降解有机物时消耗的溶解氧浓度与可生物降解有机物浓度成正相关的关系。通过测定已知浓度的标准碳溶液（常用乙酸碳溶液）加入一定量微生物后溶解氧浓度的变化，就可以绘制出溶解氧消耗速率与乙酸碳浓度相关的标准曲线。再将待测水样加入同等量微生物后的溶解氧消耗速率代入标准曲线拟合的方程，就可以计算出待测水样的可生物降解有机物浓度。
该混合菌剂制备的简要过程如下：（1）分别培养每株细菌；（2）离心收集菌体；（3）反复离心清洗菌体；（4）按一定比例混合菌体；（5）按比例加入冻干保护剂；（6）冷冻干燥处理（7）低温保存混合冻干菌剂。
该混合菌剂未使用时，可保存于4℃或-20℃的低温冰箱内。使用时，将其取出，加入一定体积无碳水配制的磷酸盐缓冲溶液，置于25-28℃的恒温箱1-2小时，使菌体复苏后使用。
本发明所述的混合菌剂具有以下特定优点：（1）菌种种类较多，可广泛地利用天然水体中所含的可生物降解有机物，因此可用于测定地表水、地下水、水源水和微污染水中可生物降解有机物的浓度（2）该混合菌剂可直接用于测定水样中可生物降解有机物浓度，耗时短，大大提高检测结果的时效性。
附图说明
图1，标准曲线及拟合方程：
图中，是标准碳溶液（乙酸碳溶液）加入一定量微生物后的溶解氧消耗速率（V）和乙酸碳浓度（S）的标准曲线，及由标准曲线拟合的方程。
实施例
以下结合具体的实施例对本发明的混合菌剂的应用，进行进一步详细描述。
实验步骤：
1.  混合冻干菌剂的制备：
从克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、气单胞菌（Aeromonas sp.）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、微杆菌（Exiguobacterium sp.）和希瓦氏菌（Shewanella sp.）的斜面上各取一环，分别接种在LB培养液中，28℃培养15小时后，按等体积将7种菌体的培养液混合。通过离心收集菌体，并使用超纯水配制的磷酸盐缓冲溶液重悬菌体，离心，重复6遍，彻底清洗尽残留的培养液。将离心的菌体与保护剂按体积比1:3混合，通过冷冻干燥处理制成冻干菌剂。将制备的冻干菌剂，存于4℃备用。保护剂配方为10ml/L甘油，1g/L L-谷氨酸，1g/L抗坏血酸。
2. 测定水样可生物降解有机物的过程：
（1）复苏菌体：将冻干菌剂加入冻干前等体积3mM磷酸盐缓冲溶液，置于28℃恒温箱2小时，使菌体复苏活化；
（2）配制300mM磷酸缓冲液（PH=7.2）：称取700mg K2HPO4，10mg MgSO4·7H2O，100mg (NH4)2SO4，10mg NaCl和100ug FeSO4，加超纯水定容于1L容量瓶；
（3）配制矿物质盐溶液：称取171 mg K2HPO4，767 mg NH4Cl和1.44 g KNO3，加超纯水定容于1L容量瓶；
（4）配制标准乙酸碳溶液：配制1g C/L乙酸碳母液，加入矿物质盐溶液（按0.5%体积加）和磷酸缓冲溶液（按1%体积加）并稀释出系列标准乙酸碳溶液，浓度分别为0 μg C/L，20μg C/L，40 μg C/L，60 μg C/L，80 μg C/L，100 μg C/L。巴氏消毒，冷却后备用；
（5）准备待测水样：按传统AOC 检测方法取水样、过滤，用超纯水将水样进行不同梯度的稀释，稀释的同时加入矿物质盐溶液（按0.5%体积加）和磷酸缓冲溶液（按1%体积加），以得到与体系中生物量、溶解氧等相适宜的有机物量，巴氏消毒，冷却后备用；
（6）曝气：将标准样和待测水样，使用无菌空气曝气30min-1h，使水样的溶解氧浓度达到饱和；
（7）溶解氧测定：将曝气后的标准乙酸碳溶液和待测水样，依次分别加入10%体积的复苏菌液，使用溶解氧测定仪每隔10 s记录一次溶解氧值，连续10min；
（8）分析数据：根据记录的数据，求出乙酸碳溶液的溶解氧消耗速率（V）（见表1），绘制溶解氧消耗速率（V）和乙酸碳浓度（S）的标准曲线（见图1），将待测水样溶解氧消耗速率（V）（见表2）代入标准曲线的拟合方程，从而求出待测水样的可生物降解有机物浓度（见表3）。
表1 标准样反应速率
                                                 
 表2 待测样反应速率
 
表3 待测样可利用有机物浓度

Claims (6)

1.一种可应用于水中可生物降解有机物和微生物污染监测的混合菌剂，其特征在于，该菌剂的活性成分为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、气单胞菌（Aeromonas sp.）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、微杆菌（Exiguobacterium sp.）和希瓦氏菌（Shewanella sp.）的一株或几株菌的组合，每株细菌10-100份。
2.根据权利要求1所述的混合菌剂，其特征在，所述克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）的保藏号为CCTCC M 2014600，所述气单胞菌（Aeromonas sp.）的保藏号为CCTCC M 2014601，所述丛毛单胞菌（Comamonas sp.）的保藏号为CCTCC M 2014602，所述寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）的保藏号为CCTCC M 2014603，所述不动杆菌（Acinetobacter sp.）的保藏号为CCTCC M 2014604，所述微杆菌（Exiguobacterium sp.）的保藏号为CCTCC M 2014605，所述希瓦氏菌（Shewanella sp.）的保藏号为CCTCC M 2014606。
3.根据权利要求1或2所述的混合菌剂，其特征在于：所述菌剂为固态的冻干菌剂。
4.根据权利要求3所述的混合菌剂，制备方法是克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、气单胞菌（Aeromonas sp.）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、微杆菌（Exiguobacterium sp.）和希瓦氏菌（Shewanella sp.）的一株或几株细菌的组合接种于液态培养液中，每株取10-100份，在25-30℃下，培养15-24小时，通过离心收集菌体，重复使用无碳水配制的磷酸盐缓冲溶液重悬菌体，离心处理，彻底去除残留的培养液后，将菌体与保护剂一定比例混合，经过冷冻干燥处理后制成冻干菌剂。
5.根据权利要求5所述的混合菌剂，其特征在于：菌体和保护剂混合后，菌体占总体积的比例为25%-50%。
6.根据权利要求5所述的混合菌剂，其特征在于：所述保护剂的主要成分为5-20ml/L甘油，0.2-1g/L L-谷氨酸，0.2-1g/L抗坏血酸。
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