CN104450575B - 一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂、制备方法及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂、制备方法及应用方法。目的是提供的青贮饲料具有提升青贮饲料发酵品质的特点，提供的制备方法应能直接应用于笋壳青贮饲料的发酵。技术方案是：一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂，液体状乳酸菌剂为由干酪乳杆菌、植物乳杆菌及混合乳酸菌剂。一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的制备方法，按以下步骤进行：1)将干酪乳杆菌、植物乳杆菌及短乳杆菌的菌种分别进行液体种子扩大培养；2)对扩大培养得到的三种植物乳杆菌的菌悬液进行混合获得混合菌悬液，再通过沉降处理，即为液体状的青贮笋壳混合乳酸菌剂；或者，继续将青贮笋壳混合乳酸菌剂与冻干保护剂和麸皮混合并冻干处理，获得固体粉末状的青贮笋壳混合乳酸菌剂。

Description

一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂、制备方法及应用方法

技术领域

本发明涉及笋壳青贮饲料技术领域，尤其涉及一种直投式笋壳青贮饲料乳酸菌发酵剂、制备方法及应用方法。

背景技术

笋壳是竹笋加工后剩下的废弃物，目前普遍采用的是地下深埋或就近废弃在河滩、沟边的处理方式，这种处理不仅会造成环境污染，也是一种资源的浪费。笋壳与鲜笋的营养成分基本相同，主要由纤维素、半纤维素、和木质素组成，并富含19种微量元素和15种游离氨基酸，还有一定数量蛋白质、淀粉、蜡、脂肪、和果胶等。通过青贮(青绿饲料在封闭状态下发酵)，利用微生物的发酵作用，调制出营养丰富、消化率高的饲料，达到能长期贮存的一种简单可靠而经济的方法。经青贮后的笋壳具有丰富的营养价值，其中含粗蛋白16.2％，比稻草高出3倍，特别是粗纤维含量达到24％，而笋壳中的氨基酸含量比北方的常用饲料要高出20％，是牛、羊、兔的理想饲料。

青贮过程中，参与活动和作用的微生物种类很多。理想的青贮应是乳酸菌控制整个发酵过程，乳酸菌生成为占绝对优势的微生物。乳酸菌制剂的添加或直接接种乳酸菌可以加快乳酸菌发酵进程，改善青贮发酵品质。如何快速的让乳酸菌占有主导优势，如何有利于乳酸菌尽快达到足够的数量，加快乳酸菌发酵产酸，是决定着青贮质量的好坏的关键因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂，以用于提升青贮饲料发酵品质，生产营养丰富、口感较好、质量稳定的青贮饲料。

本发明的另一目的是提供一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的制备方法，该制备方法应能显著缩短发酵时间、浓缩效果优异以及在冻干时具有保护作用。

本发明的第三个目的是采用人工接种乳酸菌的方法，将乳酸菌制剂采用直投式直接应用于笋壳青贮饲料的发酵。

为实现本发明的目的，本发明是通过以下技术方案得以实现的：

一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂，为液体状乳酸菌剂，或固体粉末状乳酸菌剂；其特征在于：

所述液体状乳酸菌剂为由干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌分别通过扩大培养以及沉降浓缩处理后混合组成的混合乳酸菌剂；

所述固体粉末状乳酸菌剂包括液体状乳酸菌剂、冻干保护剂以及麸皮；液体状乳酸菌剂、冻干保护剂以及麸皮的重量比例为100∶16～24∶80～150；

所述干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌采用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种；其中干酪乳杆菌的名称为Lactobacillus Casei，编号是1.0029；所述植物乳杆菌的名称为Lactobacillus plantarum，编号是1.0556；所述短乳杆菌的名称为Lactobacillus brevis，编号是1.0558。

所述的混合乳酸菌剂由干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌菌体数以1:1:1比例混合而成。

所述冻干保护剂中的组分及相互重量比例为：脱脂奶粉、麦芽糊精、山梨醇、海藻糖＝11～13︰4～6︰4～6︰1。。

所述的麸皮经过研磨机粉碎，于115～121℃高温灭菌20～25min，用量为液体状乳酸菌剂重量的0.8～1.5倍。

一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的制备方法，按以下步骤进行：

1)将干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌的菌种分别接种在液体培养基中进行液体种子扩大培养；

2)对扩大培养得到的三种植物乳杆菌的菌悬液进行混合获得混合菌悬液，再通过沉降剂沉降处理，即为液体状的青贮笋壳混合乳酸菌剂；或者，

继续将青贮笋壳混合乳酸菌剂与冻干保护剂和麸皮混合并冻干处理，获得固体粉末状的青贮笋壳混合乳酸菌剂。

所述液体培养基的组分及含量为：蛋白胨8～12g，牛肉膏8～12g，酵母粉4～6g，K₂HPO₄1～3g，柠檬酸二铵1～3g，乙酸钠4～6g，葡萄糖15～25g，吐温70～90mL，硫酸镁0.58～0.62g，硫酸锰0.25～0.32g，琼脂15～20g、蒸馏水适量；

所述的液体培养基的制备方法如下：

将液体培养基全部组分混合加热使之完全溶解，调pH至6.2～6.4，分装于三角瓶中，115～121℃灭菌15～20min，备用。

所述的液体种子扩大培养是接种在液体培养基中，30～35℃下培养24～48小时。

所述沉降剂中的组分及相互重量比例为：壳聚糖︰吐温-80︰β-环状糊精＝1.5～1.8︰1︰2～2.2；

所述的沉降浓缩处理是在混合菌悬液中按加入具有菌体保护与加速沉降作用的沉降剂后混合均匀，沉降剂与混合菌悬液的重量比例为10︰100～170；接着以4000转/min的转速通过冷冻离心机冷冻离心处理20min后，倒去菌液上层，收集离心沉积于底部的菌泥(此时菌泥中的菌数密度已高达10¹¹CFU/ml)，备用。

所述的冻干处理步骤如下：·

1)混合预冷：将121℃高温高压灭菌后的麸皮与所述的菌泥于无菌操作室里面进行混合；接着添加冻干保护剂，混合均匀后放置于－18℃的超低温冰箱中冷冻4～6个小时备用；

2)干燥：将步骤1)预冷后的菌块取出，于温度－84℃下在冷冻干燥机中冷冻干燥24～48个小时，干燥为粉状或者微粒状；

要求固体粉末状乳酸菌剂无结块，无硬粒，流动性好，颜色为淡黄色或者乳黄色，无杂质或者无肉眼可见杂质。

上述笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的应用方法，分别为以下两种：

1)将液体状乳酸菌剂喷洒至鲜笋壳中，喷洒量以鲜笋壳重量的9～15％，与鲜笋壳充分搅拌混合，装入聚乙烯青贮袋中，每袋25kg；用真空包装机脱气密封，青贮90d后开袋；

2)A、将加工后废弃的笋壳及木质化无法食用的笋头烘干至含水量为70％～80％，切成大小为2～3cm的物料，投入器皿或发酵池中，再按物料重量的80％～120％比例加入饮用水；

B、按干燥后笋壳重量的0.1％～0.3％比例，将固体粉末状乳酸菌剂接种于A步骤的物料中，充分搅拌、混合；

C、将步骤B混均的物料装入青贮发酵袋中，每袋25kg，真空封口，放置于阴凉干燥处，发酵90d；即得到黄亮色、有光泽、散发酸香味、质地松软的笋壳青贮饲料。

检测表明：将本发明所述乳酸菌制剂加入笋壳青贮后，可显著降低笋壳中CP(粗蛋白)、WSC(可溶性碳水化合物)，降低NDF(中性洗涤纤维)和ADF(酸性洗涤纤维)的含量(见表1)；pH明显下降至3.2；显著增加了乳酸的含量，干物质中乳酸含量为58.7g/kg；NH3-N/TN比值也显著下降，下降了43.2％；干物质中丁酸的含量下降至0.31g/kg(见表2)；笋壳呈亮黄色，散发酸香味，质地松软，无粘手现象(见表3)。笋壳经乳酸菌剂青贮后其细胞壁成分被降解，笋壳表面都出现了锯齿蚀痕，表面结构已被破坏，存在很多的裂缝和孔洞，未经乳酸菌剂青贮的笋壳的表面结构紧密规整，结构致密(见图1、图2)。

本发明的有益效果：一是增加了青贮料中乳酸菌的数量，可达到制作良好青贮料的要求。添加乳酸菌剂使青贮饲料发酵过程中乳酸菌急剧增殖，促进乳酸发酵，发酵剂的发酵性能好，抑制其他细菌的活动，pH值迅速下降，经测定该乳酸菌剂活菌数达10¹⁰～10¹¹CFU/ml。二是通过人工添加乳酸菌剂直接青贮笋壳，不但能极大的缩短青贮时间，同时也能有效的改善青贮笋壳的感官品质，同时能增加营养，这与我们之前所得到的结果是一致的。用高效液相色谱，气相色谱质谱联用对添加乳酸菌剂与自然发酵笋壳中的有机酸、氨基酸和香气成分进行了分析。结果表明，选用的乳酸菌剂人工接种青贮笋壳中的乳酸菌含量、有机酸等明显优于自然青贮的笋壳。三是显著缩短发酵时间(较常规发酵缩短三分之一时间)、沉降浓缩方法能有效降低乳酸菌菌体的损伤比率(与常规的单纯离心浓缩方法比较，菌体损伤比率降低20％以上)。

附图说明

图1是自然青贮笋壳结构扫描电镜图(放5000倍)；图中可见：笋壳的表面结构紧密规整，结构致密。

图2是添加本发明乳酸菌剂的青贮笋壳笋壳结构扫描电镜图(放大5000倍)。

图中可见：笋壳经乳酸菌剂青贮后其细胞壁成分被降解，笋壳表面都出现了锯齿蚀痕，表面结构已被破坏，存在很多的裂缝和孔洞；所以饲料的适口性显著增加。

具体实施方式

本发明提供制备方法，在筛选具有良好的生长特性和发酵特性基础上，通过离心法以及离心前添加具有菌体保护的功能物质，达到有效减少离心过程菌体损伤和提高离心效率以及冻干保护，从而整体提升青贮饲料乳酸菌制剂的品质，为快速青贮笋壳又能增加营养的一种笋壳青贮饲料发酵制剂的制备方法。又采用人工直投式接种乳酸菌的方法，获得了满意的应用效果。

以下通过实施例对本发明作进一步的具体描述，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。

本发明采用的原材料如下：

干酪乳杆菌(Lactobacillus Casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株：均引自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，编号分别为1.0029、1.0556和1.0558

壳聚糖：潍坊海之源生物制品有限公司；

吐温-80：淄博海杰化工有限公司生产，瑞沣牌司盘吐温-80；

β-环状糊精：孟州市华兴生物化工有限责任公司；

麸皮：浙江省农业科学院畜牧研究所提供；

高速冷冻离心机：VELOCITY 18R，意大利Dynamica生命动力有限公司；

超低温冰箱：MDF-192，日本三洋电机株式会社；

冷冻干燥机：北京博医康仪器有限公司；

气相色谱仪：GC-14A(GAS Chromatogram)，日本岛津(Shimadza)公司；

手持式色差仪：CR-400，日本柯尼卡美能达公司；

数显电热培养箱：HPX-9162-MBE，上海博讯实业有限公司；

凯式定氮仪，UDK127型嘉盛(香港)科技有限公司；

扫描电子显微镜：TM3000，日本HITACH公司；

真空封口机：DZQ400/500，温州市兄弟包装食品机械有限公司。

实施例1：一种青贮饲料乳酸菌制剂，采用的菌种包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌；将该三种乳酸菌分别接种在液体培养基，于35℃活化培养20小时，扩大培养48小时；接着添加沉降剂，然后将扩大培养得到的三种植物乳杆菌的菌悬液进行混合，成为混合菌悬液，再添加沉降剂进行沉降处理，即为液体状的青贮笋壳乳酸菌剂；沉降剂与混合菌悬液的重量比例为10︰100；沉降剂中的组分及相互重量比例为：壳聚糖︰吐温-80︰β-环状糊精＝1.5︰1︰2。

所述液体培养基的组分及含量为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801mL，MgSO₄.7H₂O 0.58g/L，MnSO₄4H₂O 0.25g/L，琼脂18g/L，蒸馏水1000mL。干酪乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌菌悬液是按1:1:1的比例进行混合，各菌种的菌数密度均达到≥10⁹CFU/ml。

实施例2：一种青贮饲料乳酸菌制剂，采用的菌种包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌；将该三种乳酸菌分别接种在液体培养基，于35℃活化18小时，培养48小时，然后将扩大培养得到的三种植物乳杆菌的菌悬液进行混合，成为混合菌悬液；在混合菌悬液中添加菌体保护用的沉降剂进行沉降处理，即为液体状的青贮笋壳乳酸菌剂；沉降剂与混合菌悬液的重量比例为10︰150，沉降剂的组分与相互重量比例为：壳聚糖︰吐温-80︰β-环状糊精＝1.8︰1︰2.2。

液体状的青贮笋壳乳酸菌剂以4000转/min的转速冷冻离心20min后，倒去菌液上层，收集离心沉积于底部的菌泥，在菌泥中添加麸皮，以及由12份脱脂奶粉、5份麦芽糊精、5份山梨醇、1份海藻糖组成的冻干保护剂，－18℃的超低温冰箱中冷冻6个小时后于温度－84℃冷冻干燥48个小时，即为固体粉末状的青贮笋壳乳酸菌剂；液体状青贮笋壳乳酸菌剂、冻干保护剂以及麸皮的重量比例为100∶20∶110。

所述液体培养基的组分及含量为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL，MgSO₄.7H₂O 0.58g/L，MnSO₄4H₂O 0.25g/L，琼脂18g/L，蒸馏水1000mL。干酪乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌菌悬液是按1:1:1的比例进行混合，各菌种的菌数密度均达到≥10⁹CFU/ml。

实施例3：本发明所述的乳酸菌剂在笋壳青贮中的应用方法，包括下述步骤：

A、将加工后废弃的笋壳和木质化无法食用的笋头烘干至含水量为70％～80％，切成2～3cm大小，投入盛有适量净水的器皿或发酵池中，再加入与物料(笋壳和笋头)等量的饮用水；

B、按干燥后笋壳重量的0.1％～0.3％比例，将本发明所述乳酸菌制剂喷洒接种于A步骤的笋壳中搅拌、混合；

C、将步骤B混均的笋壳装入青贮发酵袋中，每袋25kg，真空封口，放置于阴凉干燥处，发酵90d，即得到黄亮色、有光泽、散发酸香味、质地松软的笋壳青贮饲料。

2)A、将加工后废弃的笋壳及木质化无法食用的笋头烘干至含水量为70％～80％，切成大小为2～3cm的物料，投入器皿或发酵池中，再按物料重量的80％～120％比例加入饮用水；

B、按干燥后笋壳重量的0.1％～0.3％比例，将固体粉末状乳酸菌剂接种于A步骤的物料中，充分搅拌、混合；

C、将步骤B混均的物料装入青贮发酵袋中，每袋25kg，真空封口，放置于阴凉干燥处，发酵90d；即得到黄亮色、有光泽、散发酸香味、质地松软的笋壳青贮饲料。

表1

处理	DM(g/kg)	CP(g/kg)	WSC(g/kg)	NDF(g/kg)	ADF(g/kg)
						对照组	122.2	21.2	23.3	703.4	364.7
处理组	108.2	15.2	9.5	638.4	359.0

表1是添加本发明所述乳酸菌制剂的青贮笋壳(即处理组，下同)与自然青贮笋壳(未添加本发明所述乳酸菌制剂的对照组)中物质含量的对比影响表。

表1中可见：处理组中笋壳中的WSC(可溶性碳水化合物)含量下降较大(50％以上)，CP(粗蛋白)含量显著降低；同时NDF(中性洗涤纤维)含量和ADF(酸性洗涤纤维)含量也有降低。

表2

表2是添加本发明所述乳酸菌制剂的青贮笋壳与自然青贮笋壳中有机酸以及氨态氮含量的对比影响表。表中“-”表示未检出。

表2中可见：处理组中乳酸增幅极大(增长了13.625倍)；pH明显下降至3.1；NH3-N/TN比值也显著下降了43.2％；干物质中丁酸的含量下降至0.31g/kg。

表3

表3是添加本发明所述乳酸菌制剂的青贮笋壳与自然青贮笋壳的感官变化对比影响表。其中：L*称为明度指数，a*、b*代表一个直角坐标的两个方向。当L*＝0表示黑色，L*＝100表示白色；a*值为正值时越大，颜色越接近纯红色；a*＝0时为灰色；a*为负值时绝对值越大，颜色越接近纯绿色。b*为正值时值越大，颜色越接近纯黄色；b*＝0时为灰色；b*为负值时绝对值越大，颜色越接近纯蓝色。利用L*a*b*表色系还可以表示色调之间的差异，即色差，用△E表示，表示所测样品与鲜笋壳之间的色差值，其公式为：

表3中可见：处理组中的笋壳呈亮黄色，散发酸香味，质地松软，无粘手现象；所以青贮笋壳饲料的适口性显著增加。

尚需说明是：本发明中的液体培养基用作混合乳酸菌剂的扩大培养，笋壳青贮饲料乳酸菌制剂中混合乳酸菌剂与液体培养基的比例无法确定。

Claims (4)

1.一种笋壳青贮饲料乳酸菌制剂，为液体状乳酸菌剂，或固体粉末状乳酸菌剂；其特征在于：

所述液体状乳酸菌剂为由干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌分别通过扩大培养以及沉降浓缩处理后混合组成的混合乳酸菌剂；

所述固体粉末状乳酸菌剂包括所述的液体状乳酸菌剂、冻干保护剂以及麸皮；液体状乳酸菌剂、冻干保护剂以及麸皮的重量比例为100∶16~24∶80~150；

所述干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌采用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种；其中干酪乳杆菌的名称为Lactobacillus Casei，编号是1.0029；所述植物乳杆菌的名称为Lactobacillus plantarum，编号是1.0556；所述短乳杆菌的名称为Lactobacillus brevis，编号是1.0558；

所述的混合乳酸菌剂由干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌菌体数以1:1:1比例混合而成；

所述冻干保护剂中的组分及相互重量比例为：脱脂奶粉、麦芽糊精、山梨醇、海藻糖=11～13︰4～6︰4～6︰1；

所述的麸皮经过研磨机粉碎，于120～123℃高温灭菌20~25min，用量为液体状乳酸菌剂重量的0.8~1.5倍。

2.权利要求1所述的笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的制备方法，按以下步骤进行：

1）将干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌的菌种分别接种在液体培养基中进行液体种子扩大培养；

2）对扩大培养得到的干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及短乳杆菌的菌悬液进行混合获得混合菌悬液，再通过沉降剂沉降处理，即为液体状的青贮笋壳混合乳酸菌剂；或者，

继续将青贮笋壳混合乳酸菌剂与冻干保护剂和麸皮混合并冻干处理，获得固体粉末状的青贮笋壳混合乳酸菌剂；

所述液体培养基的组分及含量为：蛋白胨8～12g，牛肉膏8～12g，酵母粉4～6g，K₂HPO₄1～3g，柠檬酸二铵1～3g，乙酸钠4～6g，葡萄糖15～25g，吐温70～90mL，硫酸镁0.58～0.62g，硫酸锰0.25~0.32g，琼脂15~20g、蒸馏水适量；

所述的液体培养基的制备方法如下：

将液体培养基全部组分混合加热使之完全溶解，调pH至6.2~6.4，分装于三角瓶中，115～121℃灭菌15~20min，备用；

所述沉降剂中的组分及相互重量比例为：壳聚糖︰吐温-80︰β-环状糊精=1.5~1.8︰1︰2~2.2；

所述的沉降处理是在混合菌悬液中按加入具有菌体保护与加速沉降作用的沉降剂后混合均匀，沉降剂与混合菌悬液的重量比例为10︰100～170；接着通过冷冻离心机冷冻离心处理后，倒去菌液上层，收集离心沉积于底部的菌泥，备用。

3.根据权利要求2所述的笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于：所述的冻干处理步骤如下：

1）混合预冷：将灭菌后的麸皮与所述的菌泥于无菌操作室里面进行混合；接着添加冻干保护剂，混合均匀后放置于－18℃的超低温冰箱中冷冻4～6个小时备用；

2）干燥：将步骤1）预冷后的菌块取出，于温度－84℃下在冷冻干燥机中冷冻干燥24～48个小时，干燥为粉状或者微粒状。

4.权利要求1所述的笋壳青贮饲料乳酸菌制剂的应用方法，分别为以下两种：

1）将液体状乳酸菌剂喷洒至鲜笋壳中，喷洒量为鲜笋壳重量的9~15%；液体状乳酸菌剂与鲜笋壳充分搅拌混合后，装入聚乙烯青贮袋中，每袋25kg；用真空包装机脱气密封，青贮90 d后开袋；

2）A、将加工后废弃的笋壳及木质化无法食用的笋头烘干至含水量为70%~80%，切成大小为2~3cm的物料，投入器皿或发酵池中，再按物料重量的80%~120%比例加入饮用水；

B、按干燥后笋壳重量的0.1%～0.3%比例，将固体粉末状乳酸菌剂接种于A 步骤的物料中，充分搅拌、混合；

C、将步骤B混均的物料装入青贮发酵袋中，每袋25kg，真空封口，放置于阴凉干燥处，发酵90d；即得到黄亮色、有光泽、散发酸香味、质地松软的笋壳青贮饲料。