CN104447922A

CN104447922A - 一种5’-尿苷酸二钠的制备方法

Info

Publication number: CN104447922A
Application number: CN201310442551.9A
Authority: CN
Inventors: 王宏; 傅得响; 卢凰姗
Original assignee: HANGZHOU MEIYA PHARMACEUTIC INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2033-09-25
Also published as: CN104447922B

Abstract

本发明公开了一种5’-尿苷酸二钠的制备方法，所述方法有下述步骤组成：（1）将胞苷酸（CMP）或其钠盐、亚硝酸钠和去离子水混合，滴加酸和/或酸酐，并在滴加结束后继续反应0－6小时，得到反应溶液1；（2）当CMP残留量低于1%时，调节反应溶液1的pH值至6.4－7.2，得到反应溶液2；（3）将反应溶液2和95v/v%乙醇混合，结晶、过滤，得到5’-尿苷酸二钠粗品；（4）将5’-尿苷酸二钠粗品和水混合，调节pH值至7.0－8.5，得到反应溶液3；和（5）将反应溶液3和有机溶剂混合，重结晶，过滤，得到5’-尿苷酸二钠。

Description

一种5’-尿苷酸二钠的制备方法

技术领域

本发明涉及核苷酸制备领域，尤其涉及一种5’-尿苷酸二钠的制备方法。

背景技术

5’-尿苷酸二钠可作为生产核酸类药物的重要中间体，保健食品和生化试剂。并用于制造尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷三磷酸、聚腺尿苷酸等药物，在治疗多种重大的疾病方面起着重要的作用。

目前，随着尿苷三磷酸、二尿苷四磷酸、尿苷磷酸酶抑制剂等在医药领域应用范围的扩大，及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因方面的应用，国内外科研机构和企业也加大了对5’-尿苷酸二钠的研究开发力度。

目前制备5’-尿苷酸二钠的方法主要有酶解法与化学合成法两大类。

酶解法生产5’-尿苷酸二钠是历史最长，技术最成熟的生产方法。利用橘青霉发酵生产出的核酸酶P1，或者从麦芽根中提取的磷酸二酯酶，与核糖核酸(RNA)进行酶解反应，即得到四种单核苷酸(5’一腺苷酸，5’一鸟苷酸，5’一胞苷酸，和5’一尿苷酸)混合物的水溶液。将该混合物用离子交换法分离、精制纯化，即得到5’一尿苷酸二钠产品。这是我国目前生产5’-尿苷酸二钠的主要方法。但酶解法存在生产周期长，分离与精制工序复杂，投资大，加工成本高，产物容易染菌，储存期短等缺陷。

化学合成法包括磷酸化和脱氨法两种方法。磷酸化方法是以尿苷为原料，对核苷进行磷酸化。磷酸化的产物杂质多且直接产品5’-尿苷酸极性强，导致了提纯困难，耗时，收率低，生产成本高。而脱氨法是以胞苷酸为原料，经一步脱氨反应，将胞苷酸直接转变为尿苷酸，然而现有技术中要得到5’-尿苷酸二钠粗品至少要经历三个步骤：合成反应→水蒸汽蒸馏→减压蒸馏，而后两步需要特殊的设备，增加能耗，同时增大工作量。

因此，本领域迫切需要提供一种5’-尿苷酸二钠的新的制备方法。

发明内容

本发明旨在提供有效、简便的5’-尿苷酸二钠的制备方法。

本发明中，提供了一种5’-尿苷酸二钠的制备方法，所述方法有下述步骤组成：

（1）将胞苷酸（CMP）或其钠盐、亚硝酸钠和水混合，滴加酸和/或酸酐，并在滴加结束后继续反应0－6小时，得到反应溶液1；

（2）当CMP残留量低于1%（HPLC纯度，采用高效液相色谱法（HPLC）检测所得到的色谱图中，CMP的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分比应低于1%）时，调节反应溶液1的pH值至6.4－7.2，得到反应溶液2；

（3）将反应溶液2和95v/v%乙醇混合，结晶、过滤，得到5’-尿苷酸二钠粗品；

（4）将5’-尿苷酸二钠粗品和水混合，调节pH值至7.0－8.5，得到反应溶液3；和

（5）将反应溶液3和有机溶剂混合，重结晶，过滤，得到5’-尿苷酸二钠。

在另一优选例中，所述酸和/或酸酐选自无机酸、有机酸、或其酸酐中的一种或一种以上；所述酸和/或酸酐的用量为胞苷酸或其钠盐质量的1－10倍；更佳地，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸；所述有机酸为柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸；所述酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐。

在另一优选例中，所述的胞苷酸或其钠盐的HPLC纯度在98%或以上。

在另一优选例中，步骤（3）中将反应溶液2和0.5－10倍量的95v/v%乙醇混合（即95%乙醇体积：反应溶液2体积=0.5－10，即为体积比V/V）。

在另一优选例中，步骤（5）中所述的有机溶剂选自下述的一种或一种以上：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇和丙三醇；所述有机溶剂的用量为0.5－10倍量（即有机溶剂体积：反应溶液3体积=0.5－10，即为体积比V/V）。

在另一优选例中，步骤（5）中所述的重结晶温度为5－40℃，重结晶时间为1－6小时。

在另一优选例中，步骤（1）中用冰盐水冷却使反应温度控制在25℃-65℃。

在另一优选例中，步骤（2）中CMP残留量通过HPLC检测进行跟踪。

据此，本发明提供了一种5’-尿苷酸二钠的新的制备方法。

附图说明

图1显示了实施例1制备得到的5-尿苷酸二钠产品的紫外吸收光谱图。

图2显示了实施例1制备得到的5-尿苷酸二钠产品的高效液相色谱图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可以使用“一锅煮”的方法制备5’-尿苷酸二钠，无需在中间环节除去油性物质和水分。在此基础上，完成了本发明。

如本文所用，“胞苷酸（cytidylic acid）”是指胞苷的磷酸酯。视磷酸连接部位不同，有胞苷2′-磷酸(2′-胞苷酸)、胞苷3′-磷酸(3′-胞苷酸)和胞苷5′-磷酸(5′-胞苷酸)三种。本发明所用的胞苷酸为胞苷5′-磷酸(5′-胞苷酸)。

如本文所用，“HPLC纯度”是指将得到的待测产品（例如5’-尿苷酸二钠粗品或纯品、胞苷酸等），经过高效液相色谱（HPLC）检测，根据所得到的色谱图谱，进行面积归一法而得到的待测产品的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分数。

如本文所用，“UV含量”是指使用紫外-可见分光光度法测得的含量，该法中可以使用吸收系数法计算含量。

本发明提供一种5’-尿苷酸二钠的制备方法，所述方法由下述步骤组成：

第一步，将胞苷酸（CMP）或其钠盐、亚硝酸钠和水混合，在60℃以内滴加酸和/或酸酐，并在滴加结束后继续反应0－6小时，得到反应溶液1；

第二步，当CMP残留量低于1%时，调节反应溶液1的pH值至6.4－7.2，得到反应溶液2；

第三步，将反应溶液2和0.5－10倍量95v/v%乙醇混合（即95%乙醇体积：反应溶液2体积=0.5－10，即为体积比V/V），结晶、过滤，得到5’-尿苷酸二钠粗品；

第四步，将5’-尿苷酸二钠粗品和水混合，调节pH值至7.0－8.5，得到反应溶液3；和

第五步，将反应溶液3和0.5－10倍量有机溶剂混合（即有机溶剂体积：反应溶液3体积=0.5－10，即为体积比V/V），重结晶，过滤，得到5’-尿苷酸二钠。

上述第一步中，所述酸和/或酸酐的用量为胞苷酸或其钠盐质量的1－10倍。

上述第一步中，所述酸和/或酸酐选自无机酸、有机酸、或其酸酐中的一种或一种以上；所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸；优选盐酸；所述有机酸为柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸；优选乙酸；所述酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐；优选乙酸酐；所述无机酸、有机酸、或其酸酐中的一种或一种以上的混合优选盐酸和乙酸的混合。

在本发明的一种优选实施方式中，上述第一步中继续反应1-3小时。

上述第一步中涉及的胞苷酸或其钠盐的HPLC纯度在98%或以上。

在本发明的一种优选实施方式中，上述第二步中用HPLC法检测跟踪第一步反应中CMP的残留量，当CMP的残留量为0-0.3%（HPLC纯度）时，用液碱调节反应溶液1的pH值至6.4－7.2。

在本发明的一种优选实施方式中，上述第三步中将反应溶液2和0.5－3倍量95v/v%乙醇混合，结晶、过滤，得到5’-尿苷酸二钠粗品。

在本发明的一种优选实施方式中，上述第四步中用液碱调节pH值至7.0－8.5。

上述第五步中可以使用本领域常用的有机溶剂重结晶的方法在本发明的一种优选实施方式中，上述第五步中涉及的有机溶剂选自下述的一种或一种以上：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇和丙三醇；更优选甲醇、乙醇；所述有机溶剂的用量为0.5－10倍量（即有机溶剂体积：反应溶液3体积=0.5－10，即为体积比V/V）；更优选为2－3倍量；重结晶温度为5－40℃，重结晶时间为1－6小时。

通过上述方法重结晶精制后的产品还可经过本领域常用的方法进行干燥处理，比如过滤、干燥（例如但不限于，烘干）等。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的制备工艺采用了“一锅煮法”。

2、本发明提供的制备工艺简单，操作方便，生产成本低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

下述实施例中涉及的HPLC数据通过下述方法获得：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶（C18）

流动相：0.2mol/L磷酸盐缓冲液（配制方法：取磷酸氢二钠35.8g、磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000ml，摇匀即得）

检测波长：262nm

下述实施例中涉及的UV数据通过下述方法获得：

称取0.5g样品，精确至0.0002g，加盐酸溶液（1→1000）溶解并准确配至1000mL，准确量取此溶液10mL，加盐酸溶液（1→1000）并准确配至成250mL，作为检测液。测定在波长260nm处检测液的吸光度A。

此处的含量是指5'-尿苷酸二钠的质量分数。5'-尿苷酸二钠的质量分数以w计,数值以%表示，按公式（A.1）计算：

W = \frac{0.5 \times 1.859 A}{m} \times 100 - - - (A . 1)

式中：

A——检测液的吸光度。

m——换算成干基后样品的质量的数值，单位为克（g）。

实施例1

在干燥的1000m1四口瓶中，安装尾气吸收装置，机械搅拌装置，物料滴加装置。加入50g胞苷酸，150m1去离子水，搅拌溶解。加入50g亚硝酸钠，搅拌溶解。开始滴加盐酸，共加入盐酸50ml，滴加完盐酸后，继续反应2小时，整个过程控制温度在50℃以下。取样采用HPLC法检测，CMP的残留量为0.27%。用液碱调节反应液的PH值至6.4－7.2，加入2倍量的95%乙醇结晶，过滤，得5’-尿苷酸二钠粗品。将向上述粗品中加入适量水溶解，用液碱调节反应液的PH值至7.0－8.5后，再用2倍量的乙醇重结晶，过滤、烘干，得5-尿苷酸二钠产品。HPLC:99.9%，UV:98.0%。

实施例1所获产品的光谱数据汇总

项目

A₂₅₀

A₂₆₀

A₂₈₀

A₂₅₀/A₂₆₀

A₂₈₀/A₂₆₀

最大吸收波长

合格标准*

/

0.71－0.77

0.36－0.42

262±1nm

检测结果

0.324

0.436

0.158

0.74

0.36

261.8nm

*该标准依据来源：QB／T4158—2010营养强化剂5’-尿苷酸二钠

实施例2

在干燥的1000m1四口瓶中，安装尾气吸收装置，机械搅拌装置，物料滴加装置。加入50g胞苷酸，150m1去离子水，搅拌溶解。加入100g亚硝酸钠，搅拌溶解。开始滴加乙酸，共加入乙酸50ml，滴加完乙酸后，继续反应3小时，整个过程控制温度在50℃以下。取样采用HPLC法检测，CMP的残留量为0.15%。用液碱调节反应液的PH值至6.4－7.2，加入2倍量的95%乙醇结晶，过滤，得5’-尿苷酸二钠粗品。将向上述粗品中加入适量水溶解，用液碱调节反应液的PH值至7.0－8.5后，再用3倍量的乙醇重结晶，过滤、烘干，得5-尿苷酸二钠产品。HPLC:99.8%，UV:98.8%。

实施例3

在干燥的1000m1四口瓶中，安装尾气吸收装置，机械搅拌装置，物料滴加装置。加入50g胞苷酸，150m1去离子水，搅拌溶解。加入100g亚硝酸钠，搅拌溶解。开始滴加乙酸酐，共加入乙酸酐25ml，滴加完乙酸酐后，继续反应3小时，整个过程控制温度在50℃以下。取样采用HPLC法检测，CMP的残留量为0.17%。用液碱调节反应液的PH值至6.4－7.2，加入3倍量的95%乙醇结晶，过滤，得5’-尿苷酸二钠粗品。将向上述粗品中加入适量水溶解，用液碱调节反应液的PH值至7.0－8.5后，再用2倍量的甲醇重结晶，过滤、烘干，得5-尿苷酸二钠产品。HPLC:99.6%，UV:98.5%。

实施例4

在干燥的1000m1四口瓶中，安装尾气吸收装置，机械搅拌装置，物料滴加装置。加入50g胞苷酸，150m1去离子水，搅拌溶解。加入100g亚硝酸钠，搅拌溶解。开始滴加乙酸和盐酸的混合酸（5:1，V/V），共加混合酸50ml，滴加完混合酸后，继续反应3小时，整个过程控制温度在50℃以下。取样采用HPLC法检测，CMP的残留量为0.15%。用液碱调节反应液的PH值至6.4－7.2，加入3倍量的95%乙醇结晶，过滤，得5’-尿苷酸二钠粗品。将向上述粗品中加入适量水溶解，用液碱调节反应液的PH值至7.0－8.5后，再用3倍量的甲醇重结晶，过滤、烘干，得5-尿苷酸二钠产品。HPLC:99.9%，UV:98.2%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种5’-尿苷酸二钠的制备方法，其特征在于，所述方法有下述步骤组成：

（2）当CMP残留量低于1%（HPLC纯度）时，调节反应溶液1的pH值至6.4－7.2，得到反应溶液2；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酸和/或酸酐选自无机酸、有机酸、或其酸酐中的一种或一种以上；所述酸和/或酸酐的用量为胞苷酸或其钠盐质量的1－10倍。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸；所述有机酸为柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸；所述酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的胞苷酸或其钠盐的HPLC纯度在98%或以上。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中将反应溶液2和0.5－10倍量的95v/v%乙醇混合。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的有机溶剂选自下述的一种或一种以上：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇和丙三醇；所述有机溶剂的用量为0.5－10倍量。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的重结晶温度为5－40℃，重结晶时间为1－6小时。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中用冰盐水冷却使反应温度控制在25℃-65℃。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中CMP残留量通过HPLC检测进行跟踪。