CN104428415B

CN104428415B - 5’保护依赖性扩增

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Publication number: CN104428415B
Application number: CN201380036635.0A
Authority: CN
Inventors: A·塞茨; I·加布勒; L·保罗
Original assignee: Lexogen GmbH
Current assignee: Lexogen GmbH
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: JP6219944B2; WO2014009413A3; CN104428415A; DK2872628T3; EP2872628A2; US10538795B2; KR20150028982A; KR102119431B1; JP2015521857A; WO2014009413A2; EP2684954A1; CA2878421C; US20150147785A1; AU2013288810A1; AU2013288810B2; CA2878421A1; EP2872628B1

Abstract

本发明涉及从包含5’保护基团的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：获得核酸模板链的混合物，所述混合物包含所述RNA以及进一步潜在的其他无5’保护基团的核酸，将至少一种寡核苷酸引物与所述RNA以及潜在的其他核酸的模板链退火，并且模板序列依赖地延伸所述引物，从而获得与其模板链退火的互补核酸链，或提供位于具有与其模板链退火的互补核酸链的双链中的RNA，和任选地修饰在模板链的5’端或互补链的3’端或两者上无5’保护基团的所述核酸的延伸产物，和标记未被修饰的双链核酸的互补核酸，其中由此标记的核酸具有RNA模板链上的5’保护基团，所述5’保护基团在修饰后被任选地移除，和/或基于互补核酸模板RNA链上5’保护基团的存在，通过双链依赖的连接标记双链的互补核酸，由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。

Description

5’保护依赖性扩增

技术领域

本发明涉及分析复杂的核酸混合物的领域，尤其是对在核酸5’区域提供不同核苷酸的核酸的分析和选择，特别是对RNA，尤其是加帽RNA例如信使RNA(mRNA)的纯化，以及对衍生自该RNA的cDNA拷贝的富集。

背景技术

核酸，例如总RNA提取物能在其5’端提供不同的化学结构。例如28S和18S核糖体RNA(rRNA)以及微RNA(miRNA)和5’降解RNA具有5’单磷酸。其他RNA具有5’二磷酸例如5SrRNA中间体或5’OH例如18S rRNA中间体和转移RNA(tRNA)中间体。原核生物mRNA具有5’三磷酸，真核生物mRNA具有帽子结构。帽子结构本质上是鸟苷，其嘌呤环的N7上被甲基化，其5’位置与RNA临近核苷酸的5’位置通过三磷酸桥连接。

由于RNA 5’核苷酸的5’位置上的不同化学结构提供关于该RNA功能及合成和降解途径的信息，选择具有不同5’端的RNA的方法是RNA分析的重要工具。

另外，由于存在如PCR等许多DNA分析的强有力的方法，RNA被逆转录成cDNA以进行许多下游分析。因此，最期待的是特定RNA 5’端的同一性信息被转换成cDNA，同时该cDNA是该RNA尽可能真实的拷贝。这对RNA分子的全长分析尤其重要，因为只有全长RNA分子显示RNA的整体序列同一性。

有几种能够选择不同类别RNA的方法。例如，真核生物mRNA经常基于帽子结构和/或3’多聚腺苷酸(poly A)尾进行选择。针对多聚腺苷酸尾的富集方法，例如寡脱氧胸苷(oligo dT)柱层析是本领域熟知的。在第一链cDNA合成期间的寡脱氧胸苷匹配是在逆转录期间复制mRNA的另一种方法。然而，选择多聚腺苷酸尾的方法不针对5’降解的或片段化mRNA，以及某些不进行多聚腺苷酸化的RNA类别例如组蛋白mRNA进行选择。

因此，又开发出利用帽子结构的存在纯化或富集mRNA或其cDNA的方法。

例如，寡核苷酸加帽(2-4)是一种用于在mRNA 5’端添加寡核苷酸的方法。该方法具有多个步骤，要求RNA样品去磷酸化，仅留下5’OH和帽子结构。然后所述帽被烟草酸性磷酸酶(TAP)切割掉，留下5’单磷酸，所述5’单磷酸继而可用于将寡核苷酸与该5’单磷酸连接的后续反应。本质上该寡核苷酸提供例如经PCR扩增的逆转录后能被选择的序列标签。利用寡核苷酸加帽方法联合对全长扩增产物的选择(例如WO 2007/062445中所述)，本发明人发现，由于所用的降解长RNA分子的多个酶促步骤，寡核苷酸加帽向较短RNA分子引入大量偏差。因此，期待有在扩增和帽子结构选择期间保留RNA或其全长序列信息的方法。

帽陷阱(cap trapper)法(5；6)是选择mRNA序列的另一种方法，首先生物素标记该帽，然后逆转录该RNA。在进一步的步骤中，RNAse I被用于水解所有不存在于与cDNA的杂种(hybrid)中的RNA。然后mRNA/cDNA杂种被结合至磁性抗生物素蛋白珠，有效选择继而被进一步处理的全长cDNA拷贝。

一个类似的方法是CAPture(7)，EP 373 914 A2使用与固相载体缀合的帽结合蛋白(真核起始因子4)，与RNAse I消化步骤联合用于选择mRNA/cDNA杂种。

Efimov et al.(8)和US 6,022,715提供在多步骤方法中将寡核苷酸化学连接至RNA帽的方法。

其他方法利用逆转录酶的性质，当触及选择胞嘧啶的帽时，向cDNA链添加1-6个胞嘧啶(C)。例如CapSelect(9)基于cDNA上3-4个胞嘧啶的存在，在该加尾cDNA扩增期间连接连接物(adapter)以进行富集。

在US 5,962,271和US 5,962,272中公开了一种方法，其基于逆转录酶的模板转换能力，将限定的序列添加至cDNA的3’端，并辅以帽依赖的C添加以富集全长cDNA。对于模板转换和加尾(CapSelect)二者，C添加被认为倾向于帽存在(9)。然而，他人发现即使帽不存在，也会发生添加(10)，使得该方法不是非常具有选择性。另外，在逆转录期间当逆转录酶停在二级或三级RNA结构时，又会发生模板转换，提供假标签。

US 2010/159526 A1中公开了向原核生物mRNA 5’三磷酸添加标记寡核苷酸的方法，其首先将RNA与聚磷酸酶温育，将5’三磷酸缩减成5’单磷酸，所述单磷酸继而能作为供体在后续的连接反应中接受标记寡核苷酸的3’OH。对原核生物mRNA的选择还是在cDNA合成前进行。

WO 2007/117039 A1和US 2008/0108804 A1记载了一种方法，其中通过去除帽并将核酸分子连接到帽去除留下的残留磷酸上，从而选择mRNA。为了区分mRNA与其他RNA，未加帽的RNA分子事先去磷酸化以防止对其进行的连接。被修饰RNA继而转录成cDNA。

US 6,174,669和US 6,022,715涉及进一步的帽修饰方法，其中5’帽中的二醇结构被氧化，以形成活性二醛，其进一步被标签所标记。然而，氧化对RNA耐久性有害，且RNA会被降解。

DE 199 20 611 A1和US 2003/0049637 A1记载了通过连接连接物修饰cDNA，用于互补链合成。所述连接物通过在逆转录期间使用高镁和锰离子浓度首先合成几个C，并用末端转移酶连接短寡核苷酸进行连接。

在DE 101 05 208 A1中公开了通过在cDNA合成期间向逆转录反应中加入甜菜碱，能增加逆转录效率。

总之，目前所用方法要么选择性不高，要么是多步骤方案。由于RNA尤其不稳定，多步骤方案增加了RNA被片段化的几率。多个酶促反应(其通常需要二价阳离子如Mg²⁺和高温)的使用本身导致RNA降解。另外，酶制备并非真正纯净，即使小量的核酸酶也会增加RNA降解的几率。最后，每个额外的反应步骤也增加引入会降解RNA的RNase污染的几率。

由于较长的RNA分子比较短的RNA分子的降解风险增加，还引入对较短RNA分子的偏差。因此需要增加转录子的标记的特定5’端的选择性和灵敏性，而同时提供测试RNA全长序列信息的可能性的方法。

发明概述

本发明提供用于从包含5’保护基团如5’帽和/或5’聚磷酸结构的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：

a)获得核酸模板链的混合物，所述混合物包含所述RNA以及进一步潜在的其他无5’保护基团的核酸，和

b1)将至少一种寡核苷酸引物与所述RNA以及潜在的其他核酸的模板链退火，并且模板序列依赖地延伸所述引物，从而获得与其模板链退火的互补核酸链，或b2)提供位于具有与其模板链退火的互补核酸链的双链中的RNA，和

c)任选地修饰在模板链的5’端或互补链的3’端或两者上有和/或无5’保护基团的所述核酸的延伸产物，和

d)标记RNA的互补核酸，由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。步骤d1可分为(可组合)任选的d1)标记步骤c)中未被修饰的双链核酸的互补核酸，和/或d2)基于互补核酸模板RNA链上5’保护基团的存在，通过双链依赖的连接标记双链的互补核酸。各个步骤允许几种选择，它们大都遵循以下原则，对于不含保护基团的双链体，模板5’末端附近的互补链上的3’OH不易接近。如果双链体中存在5’保护基团，互补链上的3’OH便保持易于接近。易接近性可用于标记。

步骤按a)-d)的顺序进行，步骤b)和d)包含能彼此组合的替代选择。例如步骤d2)可被视为根据步骤c)的修饰，能与进一步的标记d1)组合。然而，步骤d2)单独也满足该目的，无需在无5’保护基团的核酸(核酸样品中不期望的副产物，其将不会被标记)上的修饰。

本发明在权利要求书中进一步限定。

发明详述

本发明涉及在对RNA进行任何潜在的有害步骤例如氧化或多酶暴露之前，本质上RNA首先逆转录成互补核酸例如cDNA的方法。由此RNA的全长信息被保留在互补核酸中。这对保留全长RNA序列尤其有利。

5’保护基团在天然mRNA种类中很普遍，其防止5’-3’外切核酸酶的消化。5’保护基团的实例是真核生物中常见的5’帽子结构和原核生物中常见的5’三磷酸。这两种保护基团均能完成本发明。事实上5’端上的任何保护基团均可使用。例如5’聚磷酸(polyphosphate)，通常包括5’二磷酸和5’三磷酸。“聚磷酸”被理解为具有至少两个磷酸基团，例如2、3、4、5或更多个磷酸的磷酸酯，其优选通过酯键连续相连。当然可使用任何其他天然或非天然的保护基团，其防止5’-3’外切核酸酶的消化，然而优选5’帽子结构或5’聚磷酸，尤其是5’三磷酸。本文中具有5’保护基团的核酸是指“被保护的”核酸。本文中不具有5’保护基团的核酸是指“不被保护的”核酸。

在优选的实施方案中，互补核酸是DNA，但在其他实施方案中，其也可以是RNA或DNA/RNA共聚物。

在进一步优选的实施方案中，模板核酸是RNA，即具有保护基团的感兴趣的核酸和被修饰的不被保护的核酸。二者均在步骤a)中的混合物中提供。

或者，为了在点上进行核酸合成(步骤b1)，还可能提供具有RNA的双链体核酸(步骤b2)。例如提供cDNA::RNA或RNA::RNA杂种。所有其他步骤均可与任意这些可选步骤之一组合，只要它们涉及相同的发明构思。

随后，进行任选反应c)，其将使互补核酸如cDNA的所有3’端序列失活，所述3’端序列不存在于与感兴趣的RNA的特定5’端的杂种中，所述感兴趣的RNA例如具有类似帽子结构的保护基团，这样d1)接头序列或其他标记只能以双链特异性方式添加到仍旧可供标记(“活化的”)互补核酸的那些3’端。在步骤d1)中，步骤c)中未被修饰的双链核酸的互补核酸被标记，其中标记的核酸在步骤c)中的RNA模板上具有5’保护基团，所述5’保护基团在执行完步骤c)后被任选地移除(可能在步骤d1)前)。

在不被保护的核酸未被修饰(步骤c))的实施方案中，也可执行步骤d2。当然，d2)也可与步骤c)组合，但这并不是必须的。在实施方案d2)中，双链的互补核酸依赖于互补核酸模板RNA双链上的5’保护基团的存在，通过双链依赖的连接进行标记。

在优选实施方案中，步骤d2)的反应通过调节通过逆转录酶如MMLV-RT(一旦其触及模板(RNA)的5’端)的非模板化核苷酸添加来进行。对于无5’保护基团如帽的RNA或其他核酸，这产生平端或互补(cDNA)链上具有3’核苷酸突出端的末端。相比之下，对于具有5’保护基团如帽的RNA，帽以突出端提供。当保护基团是三磷酸，例如在细菌mRNA中，携带该基团的核苷酸将以突出端提供。这产生了不同的结构差异，其可用于将接头选择性地连接至与5’被保护的RNA例如加帽RNA或5’三磷酸RNA杂交的cDNA。具体地，通过使用连接物，其中接头寡核苷酸具有5’突出端，并且其中该突出端能与5’被保护的RNA的突出端通过例如碱基配对或碱基堆积相互作用，从而有助于接头寡核苷酸与cDNA的3’端双链特异性连接。当依赖于模板RNA链上5’保护基团的存在标记双链的互补核酸时，这是在步骤d2)中获得该选择性的实例。双链依赖性连接可被用于添加标记或修饰。尤其优选的，所述标记对其中的RNA链包含5’保护基团的双链是特异性的，尤其优选其中所述5’保护基团是RNA链5’端的突出端。标记可以是接头链上具有5’核苷酸突出端的双链连接物核酸，并连接至所述互补核酸。该连接可以使用双链特异性连接酶进行。连接物是核酸标记的实例。在优选实施方案中，连接物中的接头链的5’核苷酸突出端由单核苷酸组成。突出端可以是任意核苷酸，例如A、G、C、T，但优选是C或T，尤其优选C。

在(任选的)步骤e)中，检测标记的存在。可以相对于不具有标记的核酸富集、选择、分离或纯化具有标记的核酸。标记可被用于扩增分子(当标记存在时)和/或去除分子(当标签仅在与模板分离的互补核酸上缺失时，或在双链体例如cDNA::RNA杂种上缺失时)。标记例如能被标记结合单元特异性结合。标记和标记结合单元例如可以是抗原/抗体对、配体/受体对或具有互补序列的杂交寡核苷酸。如果标记是序列标签，则例如可以富集经特异性扩增的标记的核酸，例如通过使用结合至该标记的引物。

在优选实施方案中，标记步骤包含将核酸序列标签连接至步骤c)中未被修饰的所述双链核酸。核酸序列标签不仅可用于富集，还可用于特定的互补核酸的后续鉴定。

步骤c)的修饰优选地防止所述被修饰的双链在步骤d1)中的标记。实例是移除互补链上的3’末端OH，使其不被以(模板链上的)保护基团依赖的方式的标记步骤接近。移除接近可包括消化模板链上的至少一个5’末端核苷酸，将封闭分子结合至模板链的5’磷酸，将封闭分子结合至互补链的3’末端(例如3’OH)，或移除该磷酸，在模板链上留下5’OH末端。

该修饰的实例是i)5’-3’外切核酸酶消化不含保护基团的核酸，例如不加帽核酸；ii)将模板链的5’端连接至互补链的3’端；iii)添加缺少步骤d1)的所述标记的核酸；或iv)移除模板链上的5’末端磷酸，优选通过磷酸酶，尤其优选RNA仍旧含有5’保护基团(在该实施方案中优选5’帽)，因此被保护免于5’去磷酸化。

标记优选是作用于被保护的RNA与互补核酸的双链体的平端上的反应。平端在具有保护基团的一端上。因此，通过在被修饰的不被保护的核酸双链体的模板或互补链上产生突出端，可以在标记期间掩盖这些不希望的核酸。这些突出端优选至少2个核苷酸大小，尤其优选3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸，例如至少15、至少20、至少30、至少40或至少50个核苷酸。

例如，如果双链特异性连接酶被用于任意步骤d)中将序列标签连接至互补链(具有活化的3’OH)的3’端，那么步骤c)中cDNA的3’端去活化能如下进行：通过在模板逆转录期间产生突出端，和/或通过消化模板的5’端序列再次产生互补核苷酸的3’突出端，和/或通过iii)将模板的5’端序列连接至互补核酸的3’端。

平端特异性连接酶并非100％依赖于平端。尤其在具有保护基团(尤其是5’帽)的核酸的情况下，模板链上的1个核苷酸的突出端也适于标记。因此，在优选实施方案中，所述标记对双链是特异性的，尤其是具有平端或具有最多1个核苷酸突出端的末端的双链。例如，平端在模板链上可以包含加帽核苷酸，随后是其他核苷酸。互补链的末端可以是与直至加帽核苷酸的其他核苷酸(但不与加帽核苷酸)匹配的核苷酸。互补链的末端也可以是与帽匹配的核苷酸。匹配的核苷酸可以与帽互补或不互补。因此，标记步骤对在感兴趣的RNA中存在，但在具有修饰后的其他模板核酸的双链体中不存在的这些末端结构是特异性的。本质上，修饰移除被选择用于具有无5’保护基团的模板的双链体核酸中的标记过程的结构。

在优选实施方案中，未被修饰的双链核酸的互补核酸在3’端被标记，优选地其中互补链的3’末端核苷酸与具有5’末端核苷酸或在上述5’末端核苷酸的0或1个核苷酸内的保护基团、优选5’帽核苷酸的模板链退火，尤其是在5’聚磷酸或5’保护基团的情况下，尤其是5’帽的情况下。

在优选实施方案中，步骤c)的失活在逆转录反应的末尾进行，通过提供具有平端或cDNA链上的3’突出端的不加帽模板::互补核酸(通常是RNA::cDNA)杂种，由此使其对后续标记失活。相比之下，加帽RNA::cDNA杂种在RNA链上具有帽突出端，由此对后续标记活化。以步骤d2)中的方式，连接物中的接头寡核苷酸的5’突出端将被双链特异性连接酶连接至与加帽RNA的杂种中的cDNA的3’端，但不会被连接至与不加帽RNA的杂种中的cDNA。

优选地，5’突出端是单核苷酸，并且该单核苷酸是C。进一步优选地，所述单核苷酸在其5’端被磷酸化或腺苷酸化。该单核苷酸可与5’保护基团匹配，尤其是帽的情况下，但聚磷酸的情况下也可(任何单核苷酸N均适合)，并允许连接物连接至互补链。

以保护基团选择性方式保留该突出端能通过低Mn²⁺或Mg²⁺浓度或低dNTP浓度控制，以防止逆转录酶的模板非依赖性C添加，其可消除被保护的RNA和不被保护的核酸之间的初始差别。优选的条件是例如低于4mM的组合的Mg²⁺和Mn²⁺浓度，优选不含Mn²⁺，和/或每种dNTP低于0.4mM，优选低于0.25mM，例如0.1mM。

根据上述选择iv)，还可以例如使用如碱性磷酸酶的磷酸酶去除模板链上的5’末端磷酸，尤其是单核酸。在选择iv)中，聚磷酸保护基团也可以被移除。为了防止该阶段的保护基团移除(当然其随后可在不被保护的双链体被修饰因而“失活”时被移除)，优选使用末端磷酸酶，其在保护基团上失活，或仅使单磷酸去磷酸化，或修饰多磷酸保护基团产生磷酸酶抗性(例如被其他保护基团替代或加强对抗去磷酸化的酯键)。包含5’保护基团的RNA不被磷酸酶修饰。该修饰还适合于仅特异性标记与被保护的RNA匹配的互补核酸。还可以例如移除保护基团，保留单磷酸5’端，并添加接头序列，这反过来可用于将标记与所述接头杂交，其随后可与和被保护的RNA匹配的互补核酸连接。该步骤本质上是背景技术部分提及的寡核苷酸加帽方法已知的。本发明的实质性区别在于根据本发明的修饰在双链体上进行，即在产生互补核酸之后，由此在双链体中的修饰期间保留RNA的序列信息。因此可以避免信息的丢失，尤其是之前的寡核苷酸加帽方法中观察到的长RNA序列上的信息的丢失。

在根据i)进行的优选的实施方案中，模板::互补链杂种接受外切核酸酶消化步骤，其从5’向3’降解RNA。只有包含5’保护基团(例如帽子结构或其他封闭修饰如二磷酸和三磷酸)的RNA不被降解或抵抗降解。然后，在任何步骤d)中，依赖被退火的RNA 5’端的存在，标记被添加到互补链的3’端。这可以例如通过双链特异性连接酶将寡核苷酸连接至cDNA的3’端来实现。

相同的效果可由选择ii)通过将模板链的5’端连接至互补链的3’端来实现。该反应可以仅在不被保护的核酸(例如不具有5’帽或5’聚磷酸)上进行。因此，具有5’保护基团的核酸保持不被修饰。随后只有互补链的3’端保持能被标记，而所述3’端之前未被共价连接至配对的模板链。

根据选择iii)，也可以简单地在不被保护的双链体的互补链的3’端添加另一个接头(或延伸)，以封闭和失活所述3’端。一个选择是使用末端转移酶，或更优选酶例如仅作用于不被保护的平端的逆转录酶的延伸活性。该步骤后，先前已与具有5’末端或5’保护基团(尤其当其是5’帽中的核苷酸时)的RNA配对的互补链的3’端可根据任何步骤d)进行标记。

因此，根据这些选择的几种，对于不含保护基团的双链体，模板5’末端附近的互补链上的3’OH不可接近。如果双链体中存在5’保护基团，互补链上的3’OH保持易于接近。然后在标记步骤中，可以将标记连接至互补链上的所述3’OH，其位于模板链上的保护基团附近，例如直接与被保护的核苷酸配对，或如上所述与保护基团1个核酸距离内的模板配对。

根据本发明，保护基团可以或不可被移除。优选地，在步骤c)的选择i)、ii)或iii)中，保护基团不被移除。在选择iv)中，保护基团优选被移除，但优选仅在步骤c)中不被保护的核酸双链体被修饰之后。根据本发明，修饰是在不含被保护的核酸的双链体上。5’保护基团防止感兴趣的RNA上的修饰。尤其优选保护基团例如5’帽在发明所有步骤中不被氧化。

根据本发明的方法，步骤b)在步骤c)之前执行，例如RNA的逆转录在对某些RNA 5’端的修饰和选择过程之前。以这种方式，通过如背景技术部分所述的选择过程本身的RNA降解将不会影响到cDNA的质量，尤其是其全长序列方面。因此，针对较长或较短RNA的多或少表征的偏差(bias)或针对RNA分子一个末端的偏差将极大地取决于逆转录的质量，而非用于选择的转录后事件。本领域中已知有多种减少或影响逆转录偏差的方法，例如添加海藻糖和甜菜碱(11；12)，WO 2007/062445，US 2009/311754 A1，EP 11181546.0(均通过引用全文并入)。优选地，本发明含有RNA的全长逆转录。

具有RNA依赖的DNA或RNA聚合酶活性的任何酶均能用于在模板RNA的5’端(TSS)产生反向互补链，从而产生双链。在优选实施方案中，聚合酶是RNA依赖的DNA聚合酶。在其他实施方案中，聚合酶是RNA依赖的RNA聚合酶。

在可替代的实施方案中，RNA 5’端的该双链特征也可由具有与RNA的5’端互补的序列的寡核苷酸产生，例如通过互补核酸分子全部或部分退火，然后连接至5’端的互补核酸部分。

逆转录酶的末端转移酶活性：已知当逆转录酶以末端转移酶样方式触及RNA模板的5’端时，逆转录酶添加额外的核苷酸。如果以仅保护基团不存在时添加这些额外的核苷酸的方式进行逆转录，它们将有助于双链特异性连接酶随后的选择过程。例如，较低的Mg²⁺浓度能被用于添加较少的非模板核苷酸。尤其优选等于或低于3mM的Mg²⁺，优选低于2.5mM。造成较少的非模板核苷酸添加的另一方式是降低dNTP浓度。因此优选逆转录酶具有抑制的(例如减少或无)末端转移酶活性，或使用减少或抑制该活性的条件。尤其优选地，在步骤b1)中使用逆转录酶，其具有抑制的末端转移酶活性，或使用与在超过3mM Mg²⁺和大量dNTP时的未被修饰的逆转录相比造成该活性减少的条件。

3’cDNA突出端的消化：如果在逆转录期间，互补核酸链突出端通过例如双链特异性连接也在应在步骤c)中被选择的RNA的5’端产生，cDNA的这些3’突出端能用具有更好的单链特异性3’-5’外切核酸酶活性的酶进行消化，例如外切核酸酶T、外切核酸酶T5、虾核酸酶、绿豆核酸酶或DNA聚合酶I大(Klenow)片段，以制造可供任何步骤d)的双链特异性连接的cDNA。因此优选3’cDNA突出端在任何步骤d)之前被消化。

逆转录酶的RNAse H活性：当逆转录酶用于产生RNA的互补核酸链时，优选逆转录酶具有减少的或无RNAse H活性。RNAse H活性将在RNA中产生切口，RNA在不利的条件下会从cDNA解离，从而使cDNA的3’端对双链特异性连接失活。因此高度优选逆转录酶具有减少的或无RNAseH活性，或者使用减少或抑制该活性的条件。通过移除转录酶的RNAse H区域或通过减少或抑制其活性的突变，能减少RNAse H活性。因此，优选在步骤b1)中，使用被修饰的逆转录酶，其中所述修饰减少或抑制逆转录酶的RNAse H活性。

假的第二链合成：由于逆转录酶能使用游离3’cDNA端引导第二链合成，其会导致这些cDNA失活，优选第二链合成被抑制。例如放线菌素D能被用于抑制第二链合成。

逆转录引物的保护：当使用也会以5’-3’方向消化cDNA的外切核酸酶时，逆转录引物需要抵抗外切核酸酶。本领域中已知有多种方式赋予寡核苷酸外切核酸酶抗性。例如，一或多个硫代磷酸酯(PTO)或锁定核酸(LNA)能防止引物被外切核酸酶消化。优选地，这些修饰应在引物的5’端附近或位于5’端。其他能用的修饰是例如减少、抑制或封闭5’-3’外切核酸酶活性的5’封阻剂如C3、C9、C12间隔区，或5’标记如生物素。对于双链特异性外切核酸酶，也可在寡核苷酸的引导序列引入5’突出端，这样引导寡核苷酸的3’部分位于与RNA的杂种中，5’部分保持单链。在优选实施方案中，寡核苷酸引物对于5’-3’外切核酸酶消化具有抗性。

逆转录后连接：如同所述，(不被保护的)核酸分子的5’磷酸的失活能通过将该5’磷酸连接至互补链的3’OH来进行，有效失活如任何步骤d)中所进行的对互补链的3’OH的双链特异性标记。如果与5’-3’外切核酸酶步骤联用，该连接可在外切核酸酶步骤之前或之后，但在任何步骤d)的双链特异性连接之前进行。

逆转录后磷酸化：对于5’-3’外切核酸酶消化，可使用不同的酶，其具有对不同核酸如RNA的不同活性，以及消化5’磷酸、5’OH和5’三磷酸的能力。如果希望也去活化与具有5’OH的核酸分子的杂种中的互补核酸链，尤其是cDNA的3’端，优选使用5’-3’外切核酸酶，其无法从5’OH起始消化，但特异性针对5’磷酸。然后，核酸例如RNA的5’OH能通过磷酸化被转化成5’磷酸。磷酸化能通过例如聚核苷酸激酶如Optikinase(Affymetrix)来进行。因此当优选在步骤b)之后使用对5’磷酸化核酸活化的外切核酸酶时，优选核酸例如RNA的5’OH被转化成5’磷酸。核酸优选为不被保护的。

Exo前的去磷酸化：如果使用仅对5’OH核酸活化的5’-3’外切核酸酶，可在外切核酸酶消化反应之前进行去磷酸化步骤。可使用任何种类的磷酸酶例如虾碱性磷酸酶、antarctic磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶。因此优选当使用对5’OH活化的外切核酸酶时，核酸，优选RNA的5’磷酸被转换成5’OH。核酸优选不被保护。

EXO消化：原则上，可使用任何具有对核酸(优选与互补链杂交)的5’–3’外切核酸酶活性的酶。核酸可以是RNA，尤其是不被保护的RNA，互补核酸可以是其cDNA。具有5’–3’活性的外切核酸酶是例如T7外切核酸酶、T5外切核酸酶、λ外切核酸酶、终止子外切核酸酶、XRN-I外切核酸酶及其他。具有5’–3’外切核酸酶活性的聚合酶是例如Bst聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I。

可使用能够增强所述外切核酸酶活性的添加剂，例如热稳定剂、激活剂和群集剂。群集剂是惰性分子，其可以高浓度使用，并能被用于模拟大分子在细胞内群集的效果。例如PEG(聚乙二醇)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、海藻糖、蔗聚糖(ficoll)和葡聚糖。群集剂在例如US 5,554,730或US 8,017,339中公开。

热稳定剂如海藻糖已知增强核酸酶例如DNAse I的活性(11)。

由于DNA::RNA杂种的构象对偏好DNA::DNA杂种的外切核酸酶并不是最佳的，添加群集剂例如PEG会通过改变构象和/或体积排阻促进反应。在本发明的优选实施方案中，在添加改变核酸构象和/或激活外切核酸酶的试剂，例如像海藻糖或PEG的群集剂时进行外切核酸酶消化。

连接：任何步骤d)中用于标记的连接可用任何双链特异性连接酶进行，这会将双链例如cDNA::RNA杂种中的互补核酸如cDNA的3’OH与序列标签例如单链接头或双链连接物的5’磷酸连接。例如T4DNA连接酶、T4RNA连接酶2和优选不含腺苷酸化结构域的截短的T4RNA连接酶2是用于本发明目的的好的连接酶。

可使用能够增强活性的添加剂，例如热稳定剂和激活剂，如海藻糖。另外，可使用也能改善双链构象的群集剂例如PEG或上述任意一种，以及不同的二价阳离子如氯化镁或氯化锰。

在优选实施方案中，任何步骤d)包含向cDNA的3’OH双链特异性添加序列标签或接头序列，其优选用双链特异性连接酶如T4DNA连接酶、T4RNA连接酶2或截短的T4RNA连接酶2来进行。由于焦磷酸盐能抑制酶例如聚合酶和(其他)连接酶，优选添加焦磷酸盐。

添加到cDNA的标记：标记可以是能够标记cDNA的任何分子或基团。优选标记是寡核苷酸接头。

用于标记的寡核苷酸接头：寡核苷酸可以是任意核酸例如DNA、RNA、LNA、PNA或本领域目前以任意组合使用的任意替代。寡核苷酸的5’端需要能被接近以进行连接。不同的连接酶要求不同的5’端例如5’OH或5’磷酸。大多数连接酶使用5’磷酸，其通过腺苷酰作用或鸟苷酰作用被激活。大多数连接酶腺苷酰化5’磷酸。在优选实施方案中，被连接的寡核苷酸在其5’端被预腺苷酰化。

与接头反向互补：由于双链特异性连接酶也偏好供体部位(5’磷酸)上的双链，优选至少接头的5’端是在具有反向互补序列的寡核苷酸的双链中。总的来说，所述双链接头被称为连接物。如上所述，反向互补可具有本领域已知的任何核酸或类似物。优选接头以连接物提供。在优选实施方案中，核酸序列标签至少部分是双链的，特别优选在连接端(5’端，在此连接产生与互补核酸的共价连接)。

由于任何游离3’OH能潜在地作为聚合作用或连接期间的受体，优选接头或连接物寡核苷酸的游离3’OH被封闭。本领域已知多种封闭基团。可供参考但不限于双脱氧核苷酸、C-间隔区和磷酸基团。优选连接物寡核苷酸的连接物的任何游离3’OH被封闭。

荧光标记：互补核酸能用本领域已知的任意分子标记。例如荧光分子如荧光素或生物素能被用做直接或间接报告分子。优选寡核苷酸标签或反向互补被标记。

通过固相纯化选择标记的核酸：例如使用核酸序列标签富集被标记的分子的一种方法是使用核酸序列标签进行固相选择，例如珠选择。例如，可以使用具有抗生物素蛋白表面的珠，并且具有生物素的标记能被用于结合抗生物素蛋白表面。然而，可使用任何其他的标记结合系统，例如抗原抗体结合。具有能够与核酸序列标签杂交的反向互补序列的寡核苷酸也能被附着于珠。

优选被标记的互补核酸通过固相结合或选择，优选在珠上被纯化。还优选的是，核酸序列标签或反向活性寡核苷酸或连接物被结合至珠上，并且在标记结合至珠上时进行双链特异性连接。优选标记被固定，例如附着于固体表面，例如直接或通过与被结合的反向互补寡核苷酸杂交，并且在固相上进行任何步骤d)的标记反应。

通过外切核酸酶消化选择标记的核酸：纯化被标记的互补核酸的其他可能是消化不含标签的所有核酸。例如，可进行3’-5’外切核酸酶消化。在这种情况下，标记需要具有3’-5’外切核酸酶抗性。可通过多种手段使寡核苷酸产生外切核酸酶抗性。例如，添加3’封闭基团如C3、C6、C9或C12或生物素能产生该保护。而且PTO或LNA能减少或抑制核酸外切降解。

优选通过排除不具有标记的核酸，优选通过3’-5’核酸外切消化，纯化被标记的互补核酸，其中标记提供免于消化的保护。

已知在逆转录期间，任何其他核酸均可发生模板转换(template switch)。由于提供的逆转录引物超过模板RNA，逆转录引物可以在互补核酸的3’端模板转换添加poly A序列。当扩增反应例如PCR被用于扩增互补核酸时，能与逆转录引物的反向互补杂交的第二引物会单独扩增被该逆转录引物配对并模板转换的互补核酸，从而产生对待选择的RNA 5’端非特异性的背景。为了减少该背景，逆转录引物在其5’端可以不具有保护性末端修饰例如C3或生物素。而且逆转录引物可以不具有内部修饰例如PTO或LNA。然而，逆转录引物能具有不与RNA杂交的5’突出端。以那种方式，5’突出端在5’-3’双链特异性外切核酸酶消化(步骤c)(i))中会保护互补核酸。然而，当逆转录引物被用作模板转换的模板时，模板转换的逆转录引物不免受于该外切核酸酶消化。这是因为逆转录引物在与互补核酸的3’端的杂种中，因此可用于5’-3’外切核酸酶消化。以那种方式，在步骤c)期间建立对所有模板转换的互补核酸的3’cDNA突出端，当对标记进行后续选择时，其抑制任何步骤d)的双链特异性标记，因此减少背景。

例如，连接物中的核酸序列标签的反向互补寡核苷酸的5’端可以具有修饰，使得能对该修饰进行阳性选择，例如针对基于抗生物素蛋白珠的选择的生物素标签或接头标签本身具有修饰，保护其免受上述基于3’-5’外切核酸酶的消化。

优选寡核苷酸引物具有5’突出端，并且核酸序列标签的一或两条链具有用于阳性选择的修饰，或者核酸序列标签被保护免受核酸酶消化。

通过特异性聚合作用选择标记的核酸：当核酸序列标签作为标记添加时，可进行特异性复制(扩增)。例如，可进行使用引物延长反应的特异性扩增，其使用能与核酸序列标签杂交的引物。因此，被标记的互补核酸被复制。该反应能在例如PCR中进行，通过具有线性扩增的多个循环，或使用产生指数扩增的对互补核酸特异性的第二引物。如果所有多聚腺苷酸化的RNA会被扩增，优选第二引物具有多聚T序列段(stretch)。

在本发明的其他实施方案中，互补核酸例如连接物中的至少部分双链能提供启动子，其能够起始核酸依赖的核苷酸聚合作用。例如，连接物能提供T7、T3或SP6启动子，特异性DNA依赖的RNA聚合酶能用于复制互补核酸。因此优选标记的核酸通过特异性模板依赖的核苷酸聚合作用扩增。

缩写：

TSS：转录起始位点，PTO：硫代磷酸酯键，LNA：锁定核酸，RT：逆转录或逆转录酶(根据上下文)，PNA：肽核酸，PCR：聚合酶链式反应。

本发明通过以下附图和实施例进一步例示，但不限于本发明的这些特定实施方案。

附图

图1A：

本发明一个实施方案的图示，其中仅在模板RNA分子上存在帽时，cDNA分子的3’端上被核酸序列标签标记。

a)具有5’帽的mRNA(i)和具有5’磷酸的rRNA(ii)被随机引物P配对并逆转录b)产生RNA::cDNA杂种。c)这些杂种暴露于5’-3’特异性外切核酸酶，当存在5’磷酸而不存在帽时，其从5’端消化RNA链，由此消化rRNA而非mRNA的5’端。在步骤d1)中，使用双链(ds)特异性连接酶将核酸序列标签L连接至cDNA的3’端。只有其3’端序列仍位于与其RNA的5’端序列的杂种中的cDNA参与连接。因此，e)仅其帽保护其免受外切核酸酶消化的mRNA分子的cDNA被寡核苷酸L标记。

图1B：

本发明另一实施方案的图示，其中在模板RNA上存在帽时，使用具有5’突出端的双链连接物在cDNA分子的3’端上标记。

a)与图1A相似，具有5’帽的mRNA(i)和具有5’磷酸的rRNA(ii)被随机引物P结合并逆转录b)产生RNA::cDNA杂种。c)使用双链(ds)特异性连接酶将在连接位点具有单核苷酸5’突出端的双链连接物形式的核酸序列标签L连接至cDNA的3’端。只有其3’端序列仍位于与其RNA的5’端序列的杂种中，但不延伸至帽子结构或之外的cDNA参与连接。因此，d)仅其帽被提供用于连接物连接的mRNA分子的cDNA被寡核苷酸L标记。

图2A：

描述实施例1A的结果。使用T4RNA连接酶2(截断的)对与不同长度的cDNA杂交的c0/c1加帽的人工RNA进行的双链特异性连接。

图2B：

描述实施例1B的结果。使用T4DNA连接酶对与不同长度的cDNA杂交的c0加帽或不加帽的人工RNA进行的双链特异性连接。

图3：

描述实施例2的结果：T7外切核酸酶消化人工RNA/cDNA杂种。

图4：

逆转录和核酸序列标签与mRNA::cDNA杂种的帽依赖性连接。

a)例示测试方案。RNA分子(Seq ID:3-5,7,8)与5’PTO保护引物(Seq ID:6)配对，所述被保护引物在逆转录反应期间被延伸以产生cDNA(Seq ID:9)。在与其反向互补序列(Seq ID:12)的杂种中的接头寡核苷酸(Seq ID:11)与cDNA连接，以产生接头标记的cDNA分子(Seq ID:13).

b)和c)示出实施例3的结果。

图5A:

描述实施例4的结果：处理或未处理(XRN-1，TAP)的cDNA样品的PCR扩增产物。

图5B：

描述实施例4B的结果：在不同实施方案中被标记的cDNA样品的PCR扩增产物。

实施例

实施例1A：使用具有限定序列的人工RNA分子研究双链特异性连接

由于帽代表的结构其本质上是鸟苷，其嘌呤环的N7上被甲基化，并通过三磷酸桥将其5’端与RNA的5’端连接，之前并不知晓标记能否以双链特异性方式连接至与该加帽RNA的杂种中的cDNA。因此，在人工测定中，于连接反应中设置加帽的T7转录子以及具有不同的3’突出端或3’缺失的核苷酸的寡核苷酸，以研究能否实现该双链特异性。尤其感兴趣的是cDNA上是否需要能够与帽配对或堆放的额外的核苷酸。

连接：

代表具有不同3’延伸(Seq ID:22-26)的不同寡核苷酸订购自Microsynth AG(Balgach,CH)，其与具有28nt的PTO保护的5’突出端的RNA(Seq ID:4,5)反向互补。而SeqID:22不具有3’延伸，Seq ID:23具有添加的与帽子结构杂交的额外的3’C。其他cDNA类似非模板化的核苷酸添加(优选C)，并具有另外的1(Seq ID:24)、2(Seq ID:25)或5(Seq ID:26)个添加的C。为了模仿逆转录酶转录RNA的脱离(break off)产物，逆转录引物(Seq ID:6)也用作cDNA模板。

对于33nt的体外转录的RNA模板(Seq ID:4,5)的产生，参见实施例3。在20μl反应中使用2pmol c0(Seq ID:4)或c1(Seq ID:5)RNA，与9.76pmol双链预腺苷酸化的连接物(Seq ID:11,12)和2pmol不同的cDNA(Seq ID:6,22-26)混合进行连接。对于接头寡核苷酸(Seq ID:10)的预腺苷酸化反应，参见实施例3。所有需要的组分添加并于25℃孵育3小时，包括缓冲液(50mM Tris(pH 7.8)，10mM MnCl₂，5mM DTT)、20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation,Wisconsin,USA)、0.033U PPase(Fermentas GmbH,St.Leon-Rot,Germany)、20％PEG 8000和200U截短的T4RNA连接酶2(New England Biolabs GmbH,Frankfurt am Main,Germany)。在使用二氧化硅孔板进行二氧化硅纯化后(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH7.5/80％(v/v)EtOH，洗脱缓冲液＝10mM Tris pH 8.0)，整个反应与100％甲酰胺上样缓冲液混合，95℃变性2分钟，冰上冷却，用15％丙烯酰胺/7M尿素凝胶电泳分离。

结果如图2A所示：不同泳道显示不同的cDNA，泳道2、8示出Seq ID:22，泳道3、9示出Seq ID:23，泳道4、10示出Seq ID:24，泳道5、11示出Seq ID:25，泳道6、12示出Seq ID:26，泳道7、13示出Seq ID:6，泳道2-7中为c0加帽的RNA(Seq ID:4)，泳道8-13中为c1加帽的RNA(Seq ID:5)。泳道1中上样100ng 10bp的DNA ladder(Life TechnologiesCorporation,New York,USA)。根据cDNA，连接会产生88-94nt预期的连接产物，但如图2A所示，当cDNA在其3’端仅具有一个或无额外的C时产物才出现，如泳道2、8中所示的88nt的产物(Seq ID:27)，以及泳道3、9中所示的89nt的产物(Seq ID:28)，因此即使在外切核酸酶消化步骤中RNA未被完全消化，cDNA也不会发生连接。另外，未观察到接头与逆转录引物的连接，表明接头也不与逆转录期间产生的cDNA脱离产物连接。由于连接产物仅在某些反应中可见，并且当cDNA突出端存在时观察不到连接，该连接是双链特异性的。c0和c1加帽RNA获得了相同的结果。同样重要的是应注意到，无论额外的核苷酸(C)是否依赖帽添加到cDNA，接头能与cDNA连接。因此，当触及RNA的帽时，逆转录酶需要进行调整以优选地不添加或仅添加一个核苷酸。

实施例1B：研究具有5’突出端的连接物与加帽或不加帽的RNA::cDNA杂种的双链特异性连接

如上所述，如果在加帽RNA(mRNA)的逆转录期间，逆转录酶优选不向cDNA添加额外的核苷酸(C)，则帽会提供一个核苷酸的突出端。然而，该帽突出端将由反向核苷酸组成，其通过三磷酸桥与RNA的5’端进一步连接。因此，我们研究该帽突出端能否与连接物的5’突出端以能使接头寡核苷酸与cDNA的3’端双链特异性连接的方式相互作用(例如碱基堆积或碱基配对)。

与加帽RNA相比，如果逆转录酶触及非加帽RNA的5’端，其将以非模板方式在cDNA上留下平端或添加额外的核苷酸。因此，如果包括对照反应，不加帽RNA与cDNA杂交，留下平端或cDNA突出端。本文中双链特异性连接酶不会将具有5’突出端的连接物与cDNA连接。

综上所述，如果具有5’突出端的连接物能与该加帽的RNA:cDNA杂种连接，但不与不加帽的RNA:cDNA杂种连接，那么这将提供对由加帽RNA产生的cDNA的选择机制。

连接：

代表具有不同3’延伸(Seq ID:36-41)的cDNA的不同寡核苷酸订购自MicrosynthAG(Balgach,CH)。它们与RNA(Seq ID:4)反向互补，长26–30nt。而Seq ID:36不具有与帽子结构匹配的3’残基，Seq ID:37具有添加的额外的3’C，其能与帽子结构碱基配对或堆积。其他cDNA类似非模板化的核苷酸添加(优选C)，并具有另外的1(Seq ID:38)、2(Seq ID:39)、3(Seq ID:40)或4(Seq ID:41)个添加的C。

对于33nt的体外转录的RNA模板(Seq ID:4)的产生，参见实施例3。在20μl反应中使用2pmol c0(Seq ID:4)或不加帽(Seq ID:3)RNA，与20pmol双链预腺苷酸化的连接物(Seq ID:34,35)和2pmol不同的cDNA(Seq ID:36-41)进行连接。对于接头寡核苷酸(SeqID:34)的预腺苷酸化反应，参见实施例3。所有需要的组分添加并于25℃孵育3小时，包括缓冲液(50mM Tris(pH 7.5)，10mM MnCl₂，1mM ATP，10mM DTT)、20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation,Wisconsin,USA)、0.033U PPase(Fermentas GmbH,St.Leon-Rot,Germany)、20％PEG 8000和400U T4DNA连接酶(New England Biolabs GmbH,Frankfurt am Main,Germany)。在使用二氧化硅孔板进行二氧化硅纯化后(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH7.5/80％(v/v)EtOH，洗脱缓冲液＝10mM Tris pH 8.0)，整个反应与100％甲酰胺上样缓冲液混合，95℃变性2分钟，冰上冷却，用15％丙烯酰胺/7M尿素凝胶电泳分离。

结果如图2B所示：不同泳道显示不同的cDNA，Seq IDs:36-41的组分别示于泳道反应包含c0加帽的RNA(Seq ID:4，泳道2-7)或不加帽的RNA(Seq ID:3，泳道8-13)。泳道1中上样100ng 10bp的DNA ladder(Life Technologies Corporation,New York,USA)。根据cDNA，连接会产生50-55nt预期的连接产物。如图2B所示，c0RNA和缺乏RNA帽子结构位置的任何反向核苷酸的cDNA(Seq ID:36)的反应产物全部以50nt的条带(Seq ID:42)出现。与不加帽的RNA(Seq ID:3)的反应不产生任何连接产物(泳道8-13)。这表明连接不发生在不加帽的RNA处，而是发生在加帽的RNA处，以及cDNA不超出与帽子结构直接下游的RNA+1残基互补的位置。逆转录中的任何非模板核苷酸添加产生的cDNA例如Seq ID 36-41将不被连接。在泳道3-13中缺乏异常的连接产物也表明连接是双链特异性的。

实施例2：具有不同5’端的人工RNA的T7外切核酸酶消化

为了证实对于不同cDNA分子杂交时的RNA的不同5’端的外切核酸酶消化的特异性，使用人工寡核苷酸进行实验。

杂交：

用于T7外切核酸酶消化的模板在RNA(Seq ID:4、7、8)与模拟cDNA(Seq ID:22,23)的不同的寡核苷酸的PAGE纯化的杂种上进行。不同的RNA(Seq ID:7、8)订购自Eurogentec(Seraing,Belgium)。杂交如下进行：在10mM Tris pH 7.0中加热RNA和寡核苷酸至95℃，30秒，以2％的斜坡限速(ABI9700热循环仪)冷却至45℃，添加同体积的2x杂交缓冲液(100mMTris pH 7.9，6mM MgCl₂)。在维持15分钟后，以2％的斜坡限速进一步降温至4℃。随后合成杂种：Seq ID:4/Seq ID:22，Seq ID:4/Seq ID:23，Seq ID 7/Seq ID:22，Seq ID:8/SeqID:22，并在天然15％的丙烯酰胺凝胶上进行PAGE纯化。

T7外切核酸酶消化：

在20μl的反应中，50ng所有杂种与所有需要的组分混合，包括缓冲液(20mM Tris-乙酸(pH 7.8)，50mM乙酸钾，10mM醋酸镁，1mM DTT，pH 7.9，25℃)和20U来自New EnglandBiolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的T7外切核酸酶(10U/μl)。反应在37℃进行30分钟，使用二氧化硅孔板进行二氧化硅纯化(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH，洗脱缓冲液＝10mM Tris pH 8.0)。整个反应与100％甲酰胺上样缓冲液混合，95℃变性2分钟，冰上冷却，用15％丙烯酰胺/7M尿素凝胶电泳分离。

结果如图3所示：

在不同的泳道中示出由不同的RNA(Seq ID:4、7、8)与不同的cDNA(Seq ID:22,23)杂交所组成的不同的杂种。泳道2、4、6、8示出外切核酸酶消化后的杂种，泳道3、5、7、9未进行反应。具有5’OH的RNA(Seq ID:8)与Seq ID:22置于泳道2、3中，具有5’P的RNA(Seq ID:7)与Seq ID:22置于泳道4、5中，具有5’帽的RNA(Seq ID:4)与Seq ID:22置于泳道6、7中，与Seq ID:23模拟通过逆转录对帽添加额外核苷酸的RNA置于泳道8、9。来自Fermentas GmbH(St.Leon-Rot,Germany)的100ng GeneRuler^TM1kb Plus DNA Ladder示于泳道1和10。

消化后，所有cDNA保留在反应中，而具有5’P的RNA(泳道4)被完全消化，>95％的5’OH RNA(泳道2)被消化。对于加帽RNA，根据cDNA的长度可见其区别。如果cDNA与RNA平末端结尾(Seq ID:22)，加帽RNA部分被消化(泳道6)，而当cDNA含有用于帽子结构杂交或堆积的额外核苷酸(Seq ID:23)时，对外切核酸酶消化有更好的保护，泳道8。

实施例3：使用人工RNA分子证明构思

为了研究本发明优选实施方案的特异性和灵敏性，使用限定序列的RNA分子的测定中示出了证明构思的实验。测定方案的概要参见图4a，结果参见图4b和4c。

产生体外转录的33nt的RNA模板：

通过两个寡核苷酸(Seq ID:1，2)(其中一个含有T7启动子序列)的杂交产生用于T7体外转录的模板。杂交如下进行：在10mM Tris pH 8.0中加热RNA和寡核苷酸至95℃，30秒，以2％的斜坡限速(ABI9700热循环仪上)冷却至45℃，添加同体积的2x杂交缓冲液(100mM Tris pH 7.9，6mM MgCl)。在维持15分钟后，以2％的斜坡限速进一步降温至4℃。然后将该模板用于T7体外转录，使用Epicentre的AmpliScribe T7高产量转录试剂盒(

Biotechnologies,Wisconsin,USA)，之后进行PAGE纯化。具有5’三磷酸的33nt体外转录RNA(Seq ID:3)使用包括ScriptCap的2’-O-甲基转移酶的ScriptCap m7G加帽系统进一步进行c0(Seq ID:4)和c1(Seq ID:5)加帽。

cDNA合成：

使用来自Promega Corporation(Wisconsin,USA)的MMLV–H点突变(200U/μl)进行第一链cDNA合成。用于cDNA合成的5’-PTO保护的序列特异性引物(Seq ID:6)订购自Microsynth AG(Balgach Switzerland)。在单个的20μl反应中，2pmol不同的RNA(Seq ID:3-5,7，8)和4pmol寡核苷酸(Seq ID:6)与所有需要的组分混合，包括50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT)，0.5mM每种dNTP，20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation,Wisconsin,USA)和200U逆转录酶。对于具有5’OH的RNA(Seq ID:8)，向反应混合物中添加0.5mM rATP和来自Affymetrix(California,USA,1U/μl)的1UOptikinase。反应于37℃起始4分钟，随后于46℃维持30分钟，产生55nt的长cDNA(Seq ID:9)。在第一链合成后，使用96孔二氧化硅孔板对样品进行二氧化硅纯化(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH)，用清洗缓冲液(＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH7.5/80％(v/v)EtOH)清洗两次，并用12μl 10mM Tris pH 7.0洗脱。

5’-3’外切核酸酶消化：

cDNA(Seq ID:9):RNA(Seq ID:3-5，7，8)杂种暴露于5’-3’外切核酸酶消化，使用来自New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的XRN-1(1U/μl)或λ外切核酸酶(5U/μl)。在20μl中进行XRN-1反应，其含有50mM Tris-HCl(pH 7.9，25℃)，100mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，20％PEG 8000和1U酶，而对于λ外切核酸酶，反应组分包括67mMGlycine-KOH(pH 9.4，25℃)，2.5mM MgCl₂，50μg/ml BSA，20％PEG 8000和15Uλ外切核酸酶，体积30μl。反应均在37℃进行60分钟，使用96孔二氧化硅板进行二氧化硅纯化(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mMNaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH，洗脱缓冲液＝10mM Tris pH 7.0)。

寡核苷酸预腺苷酸化：

根据Lau等人(13)进行该步骤。简言之，如下制备Imp A：向15ml试剂混合物(由66.67mM三苯基膦，66.67mM 2,2’-dipyridydisulfide(＝Aldrithiol-2)，166.7mM咪唑和433mM三乙胺组成，置于N,N-二甲基甲酰胺中)中添加15ml 33.3mM腺苷-5’-单磷酸、游离酸(N,N-二甲基甲酰胺中)并于室温下搅拌2小时。之后将反应溶液添加至温和搅拌的沉淀缓冲液(340ml，由26.5mM NaClO₄，66.18％丙酮和33.82％二乙醚组成)，。用丙酮平衡沉淀物的重量，并于3,000x g离心5分钟，随后用50ml丙酮清洗两次，50ml纯二乙醚清洗一次，并于3,000x g离心20分钟。沉淀物(Imp A)于真空干燥器中干燥过夜。

如下进行5’磷酸化接头(订购自Microsynth AG(Balgach,CH)，Seq ID:10)的腺苷酸化：将200μM寡核苷酸与25mM MgCl₂和50.05mM ImpA混合，将反应混合物于50℃温育3小时。预腺苷酸化的接头(Seq ID:11)随后经PAGE纯化。

连接：

使用与具有互补序列的引物(Seq ID:12)杂交的预腺苷酸化接头(Seq ID:11)的双链连接物连接外切核酸酶消化样品的cDNA(Seq ID:9)。因此，9.76pmol的两种寡核苷酸混入40μl的反应并于25℃温育3小时，所述反应含有50mM Tris(pH 7.8)，10mM MnCl₂，5mMDTT，20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation,Wisconsin,USA)，0.033UPPase(Fermentas GmbH,St.Leon-Rot,Germany)，20％PEG 8000和200U截短的T4RNA连接酶2(New England Biolabs GmbH,Frankfurt am Main,Germany)。在EtOH沉淀后，样品与100％甲酰胺上样缓冲液混合，于95℃变性2分钟，冰上冷却，用15％丙烯酰胺/7M尿素凝胶电泳分离。连接会产生82nt的期望的连接产物(Seq ID:13)，以及接头与RNA的游离3’OH的背景连接所产生的59或60nt的片段(Seq ID:14，Seq ID:30-32).

λ外切核酸酶的结果示于图4b。在不同的泳道中，用于逆转录、外切核酸酶消化和连接的RNA(Seq ID:3-5，7，8)不同，其具有不同的5’端。具有单磷酸的RNA(Seq ID:7)位于泳道2-4，OH(Seq ID:8)位于泳道5-7，c0帽(Seq ID:4)位于泳道8-10，c1帽(Seq ID:5)位于泳道11-13。逆转录后的样品示于泳道2、5、8、11，为55nt的长cDNA(由于M-MLV的末端转移酶活性，添加+1-3nt)。具有各RNA的样品外切核酸酶消化后示于泳道3、6、9、12，连接后的示于泳道4、7、10、13。泳道1和14示出100ng的大小标准参照物(10bp DNA ladder，LifeTechnologies Corporation，New York，USA)。

添加到cDNA 3’端的非模板化核苷酸的量随RNA的5’端(P/OH/帽)而不同。对于具有5’OH/P的RNA，添加1-3nt，对于帽子结构(c0/c1)，约95％仅添加1nt，可进行连接。

可以看出在λ外切核酸酶消化步骤后，具有5’单磷酸的RNA被消化(泳道3)，而所有其他RNA(5’OH,c0,c1)受到保护，并保留在反应中，产生期望的82nt连接产物(Seq ID:13)，并且存在背景反应产物(59nt或60nt；SeqID:14，30，31)，其迁移至62-63nt，表明RNA的3’端与接头(Seq ID:11)连接。当逆转录引物与poly A尾内部匹配时，mRNA不会发生该连接，因此RNA的3’端不会处于与引物的双链构象中，并且不会发生双链特异性连接。

对于XRN-1，结果示于图4c：

参见图4a的上述描述，包括位于泳道14-16的被Optikinase(来自AffymetrixCalifornia,USA,1U/μl)磷酸化的5’OH RNA(Seq ID:8)，以及泳道17-19中的三磷酸(SeqID:3)，因此泳道14和17还示出逆转录后的，泳道15和18示出外切核酸酶消化后的，泳道16和19示出连接后的具有各RNA的样品。泳道1和20示出100ng的大小标准参照物(10bp DNAladder，Life Technologies Corporation，New York，USA)。

具有5’单磷酸的RNA被XRN-1消化(泳道3)，而除了具有5’OH的RNA，具有c0、c1以及5’三磷酸的RNA不被消化，并保留在反应中，产生期望的连接产物(82nt，Seq ID:13)。与λ外切核酸酶相同的背景反应发生，示出59-60nt产物(迁移至62-63nt)(Seq ID:14，Seq ID:30-32)。Optikinase造成的具有5’OH的RNA的磷酸化使得RNA也受到外切核酸酶消化，双链特异性连接无法发生(图4c，泳道16)。

实施例4A：加帽或不加帽的天然来源的RNA样品的POC验证

为了研究方案对加帽的天然来源的RNA是否特异，进行测定比较加帽mRNA与烟草酸性焦磷酸酶(TAP)脱帽的mRNA。TAP处理产生5’单磷酸，其使RNA分子对5’-3’外切核酸酶消化敏感。因此，来自该脱帽mRNA的cDNA的3’端在逆转录和外切核酸酶消化后将不在杂种中，因此不参与双链特异性连接。在随后的qPCR中，进行总体cDNA扩增，以记录Ct值。mRNA样品(+帽)和Tap处理的mRNA(-帽)之间的△Ct值将表示方案的灵敏度。

TAP处理总RNA

烟草酸性焦磷酸酶(TAP，来自Epicentre Biotechnologies，Wisconsin，USA)(1U/μl)被用于对来自小鼠肝的总RNA脱帽。根据制造商进行该反应，然后用EtOH沉淀纯化。

cDNA合成：

使用来自Promega Corporation(Wisconsin,USA)的MMLV–H点突变(200U/μl)进行第一链cDNA合成。

用于cDNA合成的5’PTO保护的寡脱氧胸苷引物(Seq ID:15)订购自Sigma-AldrichHandels GmbH(Missouri,USA)。在10μl体积中混合2μg总RNA，50nM寡核苷酸(Seq ID:15)和20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation，Wisconsin，USA)，并在70℃变性30秒，随后降温至41℃，维持1分钟。在添加所有其他所需组分包括缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂和10mM DTT)、0.5mM每种dNTP和200U逆转录酶至20μl的最终反应体积后，在41℃继续该反应2分钟，随后于46℃维持50分钟，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

5’-3’外切核酸酶消化：

样品暴露于5’-3’外切核酸酶消化，使用来自New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的XRN-1(1U/μl)。20μl的反应混合物含有缓冲液(50mMTris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM DTT；(pH 7.9，25℃))、20％PEG 8000和1U酶。反应在37℃进行60分钟，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

连接：

使用与具有互补序列的寡核苷酸(Seq ID:12)杂交的预腺苷酸化接头(Seq ID:11，参见实施例3)的双链连接物连接cDNA(进行或不进行之前的外切核酸酶消化)。

对于40μl的连接反应，22.4pmol的两种寡核苷酸(～30％预腺苷酸化，参见实施例3，Seq ID:11)与所有需要的组分混合，包括缓冲液(50mM Tris(pH 7.8)，10mM MnCl₂，5mMDTT)，20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation，Wisconsin,USA)，0.033UPPase(Fermentas GmbH,St.Leon-Rot,Germany)，20％PEG 8000和200U截短的T4RNA连接酶2(New England Biolabs GmbH,Frankfurt am Main,Germany)(200U/μl)，于25℃温育3小时，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

qPCR扩增：

在20μ反应中进行real-time PCR，包含1μl cDNA(由2μg总RNA合成，纯化后溶于20μl 10mM Tris，pH 8.0)，缓冲液(50mM Tris-Cl pH 9.2，16mM硫酸铵，0.025％Brij 58，以及5.1mM氯化镁)，1.3M甜菜碱，1.3％DMSO，0.4mM每种dNTP，0.3μM 5’(Seq ID:16)和3’(SeqID:17)引物，1.2U Klen Taq AC(来自DNA Polymerase Technology Inc.，Missouri，USA，5U/μl)，0.3U Pfu(来自Promega Corporation，Wisconsin，USA，3U/μl)和0.1x SYBRGreenI。样品于95.8℃变性15秒，并循环42次：95.8℃15秒，55℃30秒，74℃20分钟。PCR产物用硅胶柱(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mMTris，400mM NaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH)进行二氧化硅纯化，于20μl 10mM Tris pH 8.0中洗脱，3μl上样于0.7％琼脂糖凝胶。

结果示于图5A。泳道2示出未用外切核酸酶处理的总RNA合成的cDNA的扩增，而经XRN-1消化后的相同RNA示于泳道3。泳道4和5中使用不消化(泳道4)或消化(泳道5)的TAP处理的RNA。来自Fermentas GmbH(St.Leon-Rot,Germany)的100ng GeneRuler^TM1kb Plus DNALadder示于泳道1和6。对应的Ct-值是22.44(泳道2)、23.84(泳道3)、22.82(泳道4)和26.76(泳道5)。能够看出，与不用TAP处理的RNA相比，具有5’单磷酸的脱帽的RNA在用XRN-1消化后，产生还原的条带模式和更高的Ct-值。

实施例4B：确证具有5’突出端的连接物与mRNA逆转录产生的cDNA::加帽RNA杂种连接

如实施例2A中所示，当帽作为突出端出现时，具有5’突出端的连接物将与加帽的RNA::cDNA杂种连接。然而，当加帽的RNA::cDNA杂种由加帽的RNA逆转录产生时，仅在逆转录帽前的核苷酸并且不添加任何其他核苷酸之后停止逆转录时存在该帽突出端。由于现有技术(9，例如图2，泳道1)教导MMLV-RT(-H)触及帽时，优选添加1个C，不清楚逆转录后是否会存在足量的帽突出端。然而，另一方面，本发明人发现，该帽依赖的C添加能通过例如减少dNTP浓度(例如0.1mM每种dNTP)而减少，提供增加的帽突出端。

因此研究在该适合的逆转录条件下，加帽的RNA::cDNA杂种能否产生，其具有帽突出端，并能如实施例2A中所示被连接至具有5’突出端的连接物，产生如实施例4A中的结果。

cDNA合成：

用于cDNA合成的5’PTO保护的寡脱氧胸苷引物(Seq ID:43)订购自Sigma-AldrichHandels GmbH(Missouri,USA)。在10μl体积中混合来自小鼠肝的2μg总RNA，50nM寡核苷酸(Seq ID:43)和20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation，Wisconsin，USA)，并在70℃变性30秒，随后降温至37℃，维持1分钟。在添加所有其他所需组分包括缓冲液(50mMTris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂和10mM DTT)、0.1mM每种dNTP和200U逆转录酶至20μl的最终反应体积后，在37℃继续该反应2分钟，随后于46℃维持50分钟。样品用硅胶柱(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH)进行纯化，于20μl 10mM Tris pH 8.0中洗脱。

连接：

使用与具有互补序列的寡核苷酸(Seq ID:35)杂交的预腺苷酸化接头(Seq ID:34，预腺苷酸化参见实施例3)的双链连接物连接cDNA。

对于20μl的连接反应，4pmol两种寡核苷酸(～30％预腺苷酸化)与所有需要的组分混合，包括缓冲液(50mM Tris(pH 7.8)，10mM MnCl₂，1mM ATP，10mM DTT)，20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation，Wisconsin,USA)，0.033U PPase(FermentasGmbH,St.Leon-Rot,Germany)，20％PEG 8000和400U T4DNA连接酶(New England BiolabsGmbH,Frankfurt am Main,Germany)(200U/μl)，于25℃温育3小时，然后用二氧化硅孔板(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH，洗脱缓冲液＝10mM Tris pH 8.0)进行纯化。

qPCR扩增：

在20μ反应中进行real-time PCR，包含1μl cDNA(由2μg总RNA合成，纯化后溶于20μl 10mM Tris，pH 8.0)，缓冲液(50mM Tris-Cl pH 9.2，16mM硫酸铵，0.025％Brij 58，以及5.1mM氯化镁)，1.3M甜菜碱，1.3％DMSO，0.4mM每种dNTP，0.3μM 5’(Seq ID:45)和3’(SeqID:44)引物，1.2U Klen Taq AC(来自DNA Polymerase Technology Inc.，Missouri，USA，5U/μl)，0.3U Pfu(来自Promega Corporation，Wisconsin，USA，3U/μl)和0.1x SYBRGreenI。样品于95.8℃变性15秒，并循环16次：95.8℃15秒，55℃30秒，74℃20分钟。PCR产物用硅胶柱(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mMTris，400mM NaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH)进行二氧化硅纯化，于20μl 10mM Tris pH 8.0中洗脱，3μl上样于0.7％琼脂糖胶。

结果示于图5B中。泳道2示出总RNA合成的cDNA的扩增。来自Fermentas GmbH(St.Leon-Rot,Germany)的100ng GeneRuler^TM1kb Plus DNA Ladder示于泳道1。可以看出天然RNA投入产生400至>5000bp的带型。

实施例5A：相比来自mRNA或rRNA的cDNA的3’标记，确证总RNA样品的POC

核糖体RNA(rRNA)是总RNA样品中的主要种类。然而，由于rRNA具有5’磷酸，本发明的5’-3’外切核酸酶消化步骤会消耗rRNA::cDNA杂种中的rRNA，并因此在双链特异性连接步骤中不标记这些cDNA分子的3’端。因此，设计与实施例4类似的测定以测试该设想。在逆转录期间用随机引物配对mRNA以及rRNA。总体上，反应流程示于图1。使用针对mRNA(肌动蛋白(act)和β2微球蛋白(b2m))和rRNA(18S rRNA)的基因特异性引物以及与连接反应期间添加的接头序列杂交的引物进行qPCR测定。

当比较+/-外切核酸酶反应的ΔCt值时，与mRNA相比，rRNA的ΔCt值会较高。在使用两种不同的5’-3’特异性外切核酸酶的实施例中，XRN-1(Δct＝3.83)，λ外切核酸酶(Δct＝6.07)。

cDNA合成：

使用来自Promega Corporation(Wisconsin,USA)的MMLV–H点突变(200U/μl)对总RNA(提取自小鼠肝)进行第一链cDNA合成。用于cDNA合成的具有5’PTO保护的突出端的随机九聚物引物(Seq ID:18)订购自Sigma-Aldrich Handels GmbH(Missouri,USA)。在10μl体积中混合2μg总RNA，2.5μM寡核苷酸(Seq ID:18)和20U RNasin核糖核酸酶抑制剂(PromegaCorporation，Wisconsin，USA)，70℃变性30秒，置于冰上。在添加所有其他所需组分包括缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂和10mM DTT)、0.5mM每种dNTP和200U逆转录酶至20μl的最终反应体积后，在4℃启动该反应，缓慢升温(ABI9700热循环仪，斜坡限速5％)至46℃，其中于20℃维持1分钟。反应在46℃维持50分钟，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

进行XRN-1外切核酸酶消化的样品：

样品暴露于来自New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的XRN-1(1U/μl)。反应混合物(30μl)含有缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，pH 7.9，25℃)、20％PEG 8000和3U酶。反应于37℃进行60分钟，之后用酚/氯仿纯化。

进行λ外切核酸酶消化的样品：

样品暴露于来自New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的λ外切核酸酶(5U/μl)。反应混合物(30μl)包括缓冲液(67mM Glycine-KOH，2.5mM MgCl₂，50μg/ml BSA，pH 9.4，25℃)、20％PEG8000和15Uλ外切核酸酶。反应在37℃进行60分钟，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

如实施例4中所述进行连接。

基因特异性qPCR：

在20μ反应中进行qPCR，包含1μl cDNA(由2μg总RNA合成，纯化后溶于20μl 10mMTris，pH 8.0)，缓冲液(50mM Tris-Cl pH 9.2，16mM硫酸铵，0.025％Brij 58，以及5.1mM氯化镁)，1.3M甜菜碱，1.3％DMSO，0.4mM每种dNTP，0.3μM接头特异性5’引物(Seq ID:16)，0.3μM基因特异性3’引物(Seq ID:19用于18S，Seq ID:20用于act，Seq ID:21用于b2m)，1.2UKlen Taq AC(来自DNA Polymerase Technology Inc.，Missouri，SA，5U/μl)，0.3U Pfu(来自Promega Corporation，Wisconsin，USA，3U/μl)和1x SYBRGreen I。样品于95.8℃变性15秒，并循环50次：95.8℃ 15秒，55℃30秒，74℃30秒。

结果：

对每种外切核酸酶进行单独的实验。两个实验结果示于表1。

表1：比较肌动蛋白、β2微球蛋白和18S rRNA的+/-外切核酸酶反应的Ct值的qPCR测试结果。

XRN-1样品的18S rRNA的ΔCt(+/-外切核酸酶)是3.8，λ外切核酸酶样品是6.07，表明外切核酸酶消耗了RNA::cDNA杂种中的18S rRNA。相比之下，XRN-1情况下两基因的ΔCt平均值(+/-外切核酸酶)是0.015，λ外切核酸酶是0.875，表明mRNA很大程度上免于被消化。然而，不能排除mRNA的正ΔCt值实际上是由于mRNA的轻微降解。这与本发明的目的之一完全符合，即仅标记来自存在5’帽的mRNA的cDNA。这些结果表明，对于XRN-1，mRNA特异性cDNA平均富集约14倍，对于λ外切核酸酶是约62倍。

实施例5B：基因特异性qPCR测定，使用+/-TAP处理的总RNA确证实施例4B中所用的5’突出端连接物连接的帽特异性。

使用来自小鼠肝脏的TAP处理(+TAP)或未处理(-TAP)的总RNA评估连接的帽特异性。烟草酸性焦磷酸酶(TAP)去除mRNA的帽子结构，在RNA上留下5’P端。此处β-2-微球蛋白mRNA用作原本具有5’帽子结构的参考mRNA，而18S核糖体RNA(18S rRNA)用作具有天然5’P端的对照。

测定：

如实施例5A中所述逆转录TAP处理或未处理的总RNA，但每种dNTP为0.1mM。帽依赖性接头连接如实施例1B，PCR测定如实施例5A中进行，但使用表2中所列引物。内部引物不靶向5’标记序列，而是基因特异性的，而5’-特异性扩增要求5’标记和基因特异性引物结合位点二者。

结果：

结果示于表2。未经TAP处理的样品显示对于18S rRNA的5’-特异性扩增子比对于相应的内部扩增子的Ct值高。9.8次循环的ΔCt表明缺少5’标记，与TAP处理的样品具有几乎相同的值(ΔCt值9.12)。然而-TAP样品中的β-2-微球蛋白5’特异性和b2m内部扩增子显示高度相似的Ct值(ΔCt值0.82)，暗示逆转录的加帽mRNA的高度(>50％)有效的标记。如5’-特异性扩增子较高的Ct(6.56次循环的ΔCt值)所证实，TAP处理显著减少该标记。总之，这些结果表明5’标签能特异性连接至加帽mRNA的cDNA。

扩增子	引物	-TAP:Ct	+TAP:Ct
				18S 5’	Seq ID:16&19	20.92	21.05
18S内部	Seq ID:19&46	11.12	11.93
				B2m 5’	Seq ID:16&21	18.92	25.39
B2m内部	Seq ID:47&48	18.10	18.83

表2：qPCR测定结果，研究+/-TAP处理的总RNA样品中的β-2-微球蛋白mRNA与18S核糖体RNA相比的帽特异性5’标记。

实施例6：Sanger测序以确定接头和cDNA之间的接合。

如实施例1的人工测定中，具有或不具有用于帽的核苷酸的cDNA均被连接，并不清楚天然来源的RNA样品中的逆转录和连接后，接头和cDNA的3’端之间的接合处的序列是什么样的，使用总RNA样品进行实验对此进行确证。

如实施例5中进行cDNA合成。

XRN-1外切核酸酶消化：

cDNA暴露于来自New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的XRN-1(1U/μl)。反应混合物(20μl)含有缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，pH 7.9，25℃)、20％PEG 8000和1U酶。反应在37℃进行60分钟，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

如实施例5进行λ外切核酸酶消化。

T7外切核酸酶消化：

cDNA暴露于T7外切核酸酶。反应混合物(20μl)包括缓冲液(20mM Tris-acetate，50mM乙酸钾，10mM乙酸镁，1mM DTT，pH 7.9，25℃)和20U来自New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main,Germany)的T7外切核酸酶(10U/μl)。反应在25℃进行60分钟，然后用酚/氯仿抽提和EtOH沉淀纯化。

如实施例4中进行连接。

使用接头特异性5’引物(Seq ID:16)和基因特异性3’引物(Seq ID:21用于b2m)如实施例5中进行基因特异性qPCR。20μl反应的3μl与100％甲酰胺上样缓冲液混合，95℃变性2分钟，冰上冷却，在12％丙烯酰胺/7M尿素凝胶中电泳分离。切割约299nt的期望的产物条带，于0.3M乙酸钠中温育过夜，EtOH沉淀并使用相同的引物重扩增23个循环，反应条件如上。在使用硅胶柱(结合缓冲液＝20％(v/v)Gu-HCl/80％(v/v)EtOH，清洗缓冲液＝20％(v/v)100mM Tris，400mM NaCl pH 7.5/80％(v/v)EtOH)进行二氧化硅纯化后，于20μl 10mMTris pH 8.0中洗脱，样品送Microsynth AG(Balgach,CH)进行Sanger测序。

测序结果均显示连接处(Seq ID:29)的帽出现额外的核苷酸，其可以是任意核苷酸，优选T>C>A＝G。

参考文献列表

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13. Lau,N.C. et al. (2001) Science, 294, 858-862.

Claims

1.用于从包含5’保护基团的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：

a)获得核酸模板链的混合物，所述混合物包含所述RNA以及进一步潜在的其他无5’保护基团的核酸，

b1)将至少一种寡核苷酸引物与所述RNA以及潜在的其他核酸的模板链退火，并且模板序列依赖地延伸所述引物，从而获得与其模板链退火的互补核酸链，或b2)提供位于具有与其模板链退火的互补核酸链的双链中的RNA，

c)修饰在模板链的5’端或互补链的3’端或两者上无5’保护基团的所述核酸的延伸产物，和

d1)标记步骤c)中未被修饰的双链核酸的互补核酸，其中由此标记的核酸具有在步骤c)中的RNA模板链上的5’保护基团，所述5’保护基团在执行完步骤c)后被任选地移除由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。

2.用于从包含5’保护基团的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：

d2)基于互补核酸模板RNA链上5’保护基团的存在，通过双链依赖的连接，标记双链的互补核酸，由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。

3.权利要求1或2的方法，其中所述保护基团是5’帽或5’聚磷酸。

4.权利要求1的方法，其中所述标记包含将核酸序列标签与步骤c)中未被修饰的所述双链核酸连接。

5.权利要求4的方法，其中所述核酸序列标签至少部分是双链的。

6.权利要求4的方法，其中所述核酸序列标签在连接端。

7.权利要求1的方法，其中所述修饰防止所述被修饰的双链的标记。

8.权利要求1的方法，其中步骤c)中的所述修饰选自i)5’-3’外切核酸酶消化不加帽核酸；ii)将模板链的5’端连接至互补链的3’端；iii)添加缺少用于未被修饰双链核酸的所述标记的核酸序列标签；或iv)移除模板链上的5’末端磷酸。

9.权利要求8的方法，其中通过磷酸酶移除模板链上的5’末端磷酸。

10.权利要求8的方法，其中RNA仍旧含有5’保护基团，因此被保护免于5’去磷酸化。

11.权利要求1的方法，其中未被修饰的双链核酸的互补核酸在3’端被标记。

12.权利要求11的方法，其中互补链的3’末端核酸与具有5’末端核苷酸的模板链在所述5’末端核苷酸的0或1个核苷酸内退火。

13.权利要求11的方法，其中互补链的3’末端核酸与具有5’保护基团的模板链在所述5’保护基团的0或1个核苷酸内退火。

14.权利要求12的方法，其中所述5’末端核苷酸是5’聚磷酸。

15.权利要求13的方法，其中所述5’保护基团是5’帽。

16.权利要求1或2的方法，其中所述标记对双链是特异性的。

17.权利要求16的方法，其中所述双链是具有平端或具有最多1个核苷酸突出端的末端的双链。

18.权利要求1或2的方法，其中当RNA链包含5’帽或5’聚磷酸时，所述标记对双链是特异性的。

19.权利要求18的方法，其中所述RNA链包含5’三磷酸。

20.权利要求18的方法，其中所述5’帽或5’聚磷酸是RNA链5’端的突出端。

21.权利要求18的方法，其中在步骤d2)中，标记是具有接头链上的5’核苷酸突出端的双链连接物核酸，连接至所述互补核酸。

22.权利要求21的方法，其中使用双链特异性连接酶进行连接。

23.权利要求21的方法，其中连接物中的接头链的5’核苷酸突出端由单核苷酸组成。

24.权利要求23的方法，其中所述单核苷酸是C或T。

25.权利要求1或2的方法，其进一步包含步骤e)或者富集、选择、分离或纯化具有标记的核酸，或者其中所述标记的核酸用互补核酸作为模板，通过模板依赖的核苷酸聚合作用扩增。

26.权利要求25的方法，其中通过固相结合纯化。

27.权利要求1或2的方法，其中在步骤b1)中使用逆转录酶，其具有抑制的末端转移酶活性，或使用与在至少3mM Mg²⁺和大量dNTP时未被修饰的逆转录酶相比造成末端转移酶活性减少的条件。

28.权利要求1或2的方法，其中互补核酸链上潜在存在的3’突出端在步骤d1)或d2)前被消化。

29.权利要求1或2的方法，其中在步骤b1)中，使用被修饰的逆转录酶，其中酶的所述修饰减少或抑制逆转录酶的RNAse H活性。

30.权利要求1或2的方法，其中寡核苷酸引物对于5’-3’外切核酸酶消化具有抗性或具有5’突出端。

31.权利要求30的方法，其中核酸序列标签被用作标记，并且所述核酸序列标签被保护免受核酸酶消化。

32.权利要求1的方法，其中在步骤c)中，核酸上的5’OH被磷酸化或5’磷酸被去磷酸化。

33.权利要求1的方法，其中5’磷酸依赖或5’OH依赖的5’-3’外切核酸酶被用于修饰。

34.权利要求1的方法，其中步骤c)是在群集剂存在时的5’-3’外切核酸酶修饰。

35.权利要求1或2的方法，其中标记包含荧光分子，或者其中标记提供防止3’-5’核酸外切消化的保护。

36.权利要求35的方法，其中所述标记是荧光核酸序列标签。

37.权利要求1或2的方法，其中标记固定于固相上。