CN104422780B

CN104422780B - 一种基于微流控芯片全封闭体系的蛋白质快速分析检测装置

Info

Publication number: CN104422780B
Application number: CN201310384264.7A
Authority: CN
Inventors: 张丽华; 戴忠鹏; 梁玉; 杨开广; 张玉奎
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: CN104422780A

Abstract

本发明涉及蛋白质的在线富集，洗脱，荧光标记，检测的微型装置。本装置由微流体控制系统、微型激光诱导荧光检测系统、微流控芯片、进样阀、连接管路和接口、数据采集处理等部分组成。蛋白质样品被芯片通道中的富集柱富集，洗脱同时在线荧光标记，经激光诱导荧光检测。本发明的优点是，将样品预处理过程、荧光标记及检测实现在线集成化，省去离线分析方法中的繁琐步骤，大大缩短了样品处理时间，并实现了高灵敏度检测；整个装置体积小，能耗低；微流控芯片和微注射泵通过特殊设计的接口连接，整个流体系统在全封闭体系中运行，满足特殊条件下（如非重力状态）的检测需要。因此，具有很好的实际应用价值。

Description

一种基于微流控芯片全封闭体系的蛋白质快速分析检测装置

技术领域

本发明涉及蛋白质检测装置，特别提供了一种基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置。

背景技术

微全分析系统（MicroTotalAnalysisSystems，μ-TAS）是一个跨学科的新领域，其最终目的是通过化学设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中（如各类芯片），实现分析设备的“微型化”，他的特点是能实现对目标分析物的采样、稀释、加试剂、，富集，萃取，混合，反应，分离，检测等步骤的集成。

体液中有些微量蛋白质，是揭示人体，健康的重要指标之一，对于评价其健康状况至关重要。目前常用的测方法如化学试纸法、ELISA、SDS-PAGE等方法，存在准确性差或者操作复杂等问题，发展快速、简便、准确的体液中蛋白检测方法，具有十分重要的意义。

采用微流控芯片技术，可以实现蛋白质从富集到洗脱再到检测的全集成化，操作简单，节省时间，准确可靠。

发明内容：

本发明特别提供了一种基于微流控芯片全封闭体系的蛋白质快速检测装置，在芯片上实现特异蛋白的富集，洗脱，荧光标记，检测，操作简便，自动化程度高，整个系统在全封闭体系中，适应各种复杂的外部环境。

实现上述目的技术方案是：

制备一种基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置，所述装置由微流体控制系统、进样系统、微流控芯片系统、微型激光诱导荧光检测系统、数据采集系统组成：其中微流体控制系统由计算机、三通切换阀1、三通切换阀2、三通切换阀3、上样缓冲液微泵、洗脱液微泵、荧光衍生试剂微泵及其控制软件组成；进样系统为六通进样阀；微流控芯片系统包括微流控芯片、微流控芯片夹具、富集柱、混合器、检测窗组成；微型激光诱导荧光检测系统由激光器、光电倍增管、光路及各类滤光片组成；数据采集系统由计算机和数据工作站组成；

所述上样缓冲液微泵的出口通过三通切换阀，洗脱液微泵的出口通过三通切换阀2，所述三通切换阀1、三通切换阀2的一端分别与储液池1、储液池2通过输液管连接，另一端通过微三通混合，与六通进样阀连接；

荧光衍生试剂微泵的出口通过三通切换阀，所述三通切换阀的一端与荧光衍生试剂储液池通过输液管连接，另一端与微流控芯片荧光衍生试剂入口（530）连接；

废液储液池通过输液管与微流控芯片的废液出口端连接；

微流控芯片位于激光诱导荧光检测器的上面，激光诱导荧光检测器中的激光器发射出的激光，对准微流控芯片的检测窗口；

微流控芯片放在微流控芯片夹具中，由接口端通过输液管与系统中的六通进样阀、三通切换阀、储液池等组件连接；

微流控芯片夹具位于激光诱导荧光检测器上方。所述中的输液管为同一种管。微泵和三通切换阀，在装置中采用垂直搭建方式，有效利用空间，减少装置体积。

所述的蛋白质快速分析检测装置，在放置微流控芯片后的混合器和微流控芯片废液出口端之间开一透光口，所述透光口对应微流控芯片检测窗口的位置，且与激光诱导荧光检测器中的激光器发射出的激光的位置相对应固定，微流控芯片上的进出液口、微流控芯片废液出口端、微流控芯片入口端与微流控芯片上的检测窗口两者之间的位置固定，并与微流控芯片夹具上的开口位置对应，当微流控芯片夹具的开口与微流控芯片上的进出液口、微流控芯片废液出口端、微流控芯片入口端（对准连接时，光路对准检测通道上检测窗口的中心点，从而免除芯片更换时重复检测点校正。微流控芯片包括富集柱、混合器和检测窗口。其中混合器是由微流控芯片上特定位置的一段1cm长的亲水性的丙烯酸酯类聚合物整体材料担当。且该亲水性的聚合物整体材料又起到了富集柱柱塞的作用。待检测蛋白质经富集柱富集，洗脱时与混合器中的荧光衍生试剂在整体材料中混合和反应，实现快速标记。

基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置用于靶标蛋白质的快速分析检测。

激光诱导荧光检测器的光路与微流控芯片的通道对准时，采用投影观测的方法，当激光光路投射到机壳顶盖上的图像边缘有一条亮度均匀的光带时，则认为激光与微流控芯片的通道对准，否则就没有对准，同本装置专门设计的芯片夹具配合使用，简化光路，省去CCD，缩小仪器体积，操作方便。

本发明的优点是，将样品预处理过程、荧光标记及检测实现在线集成化，省去离线分析方法中的繁琐步骤，大大缩短了样品处理时间，并实现了高灵敏度检测；整个装置体积小，能耗低；微流控芯片和微注射泵通过特殊设计的接口连接，整个流体系统在全封闭体系中运行，满足特殊条件下（如非重力状态）的检测需要。因此，具有很好的实际应用价值。

附图说明

图1是本发明的装置结构图；

图2用于蛋白质富集-洗脱-荧光标记-检测的微流控芯片（500）设计图；

图3是20ng蛋白质分析检测结果图；

图4是以0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.07mg/mL、0.1mg/mL为标准样品得到的浓度-峰面积线性关系图；

图5是病人尿样的白蛋白分析检测结果图。

其中，100-储液池1；110-储液池2；120-储液池3；130-废液储液池；200-上样缓冲液微泵；210-洗脱液微泵；220-荧光衍生试剂微泵；300-三通切换阀1；310-三通切换阀2；320-三通切换阀3；400-微三通；500-微流控芯片；510-进液口；520-废液出口端；530-荧光衍生试剂入口端；540-混合器；550-富集柱；570-检测窗口；700-激光诱导荧光检测器；710-激光器；800-微流控芯片夹具；900-六通进样阀；整个系统的输液管为同一种。

具体实施方式

下面通过实例进一步描述本发明，但不限于本实例。

实施例1

如图1构建基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置，其中集成了微流体控制系统、进样系统、微流控芯片系统、微型激光诱导荧光检测系统和数据采集系统，整个仪器尺寸为30cm×15cm×50cm。

如图2所示，构建用于蛋白质富集-洗脱-在线荧光标记-检测的微流控芯片。其中富集柱为白蛋白抗体柱，抗体柱内填充颗粒为固载白蛋白抗体的安捷伦公司填料，荧光标记试剂为2%NanoOrange，采用0.5MNaHCO₃作为衍生缓冲溶液。缓冲液A和缓冲液B为安捷伦公司的商品化上样、洗脱溶液。激光诱导荧光检测的激发/发射波长为473/570nm。

具体操作流程如下：

(1)用缓冲液A平衡：4uL/min,10min；

(2)用缓冲液A上样：2uL/min,10min；

(3)用缓冲液B洗脱(4uL/min)，同时在柱后以相同流速通入荧光衍生溶液(2%NanoOrange溶于0.5MNaHCO₃)，经混合器混合，激光诱导荧光检测。

如图3所示，利用此蛋白质快速分析检测装置，在8分钟内成功检测了痕量白蛋白(20ng)，其信噪比为4。说明此仪器的分析速度快，灵敏度高。

实施例2

采用构建的基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置，对病人尿样进行定量分析。

以0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.07mg/mL、0.1mg/mL为标准样品进行分析，计算检测到的峰面积，制作标准曲线(如图4所示)，浓度(x)-峰面积(y)线性关系为y=57.454x-0.5632,R²=0.9625。

取病人尿样在4℃下以3000g的转速离心5min，0.22um滤膜过滤后，用等体积丙酮沉淀，再在4℃下以12000g的转速离心5min，去除上清后，将沉淀重溶于1mL缓冲液A(安捷伦公司)，稀释500倍，进行分析(如图5所示)。峰面积为0.6518，根据浓度(x)-峰面积(y)线性关系y=57.454x-0.5632,计算得到浓度为0.2115mg/mL，原始病人尿样中白蛋白浓度为0.5287mg/mL。

此实施例进一步说明了研制的蛋白质快速分析检测装置的实用性。

Claims

1.一种基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置，其特征在于：

所述装置由微流体控制系统、进样系统、微流控芯片系统、微型激光诱导荧光检测系统、数据采集系统组成；其中微流体控制系统由计算机、三通切换阀1(300)、三通切换阀2(310)、三通切换阀3(320)、上样缓冲液微泵(200)、洗脱液微泵(210)、荧光衍生试剂微泵(220)及其控制软件组成；进样系统为六通进样阀(900)；微流控芯片系统包括微流控芯片(500)、微流控芯片夹具(800)、富集柱(550)、混合器(540)、检测窗口(570)组成；微型激光诱导荧光检测系统由激光器(710)、光电倍增管、光路及滤光片组成；数据采集系统由计算机和数据工作站组成；

所述上样缓冲液微泵(200)的出口通过三通切换阀1(300)，洗脱液微泵(210)的出口通过三通切换阀2(310)，所述三通切换阀1(300)、三通切换阀2(310)的一端分别与储液池1(100)、储液池2(110)通过输液管连接，另一端通过微三通(400)混合，与六通进样阀(900)连接；

荧光衍生试剂微泵(220)的出口通过三通切换阀3(320)，所述三通切换阀3(320)的一端与荧光衍生试剂储液池3(120)通过输液管连接，另一端与微流控芯片入口端(530)连接；

废液储液池(130)通过输液管与微流控芯片废液出口端(520)连接；

微流控芯片(500)位于激光诱导荧光检测器(700)的上方，激光诱导荧光检测器(700)中的激光器(710)发射出的激光，对准微流控芯片(500)的检测窗口(570)；

微流控芯片(500)位于微流控芯片夹具(800)中，由进出液口(510)、微流控芯片废液出口端(520)、微流控芯片入口端(530)通过输液管与系统中的六通进样阀(900)、三通切换阀1(300)、三通切换阀2(310)、三通切换阀3(320)、储液池1(100)、储液池2(110)、储液池3(120)、废液储液池(130)组件连接；

微流控芯片夹具(800)位于在激光诱导荧光检测器(700)上方。

2.根据权利要求1所述的蛋白质快速分析检测装置，其特征在于：

在放置有微流控芯片(500)的混合器(540)和微流控芯片废液出口端(520)之间开一透光口，所述透光口对应微流控芯片检测窗口(570)的位置，且与激光诱导荧光检测器(700)中的激光器(710)发射出的激光的位置相对应固定，微流控芯片(500)上的进出液口(510)、微流控芯片废液出口端(520)、微流控芯片入口端(530)与微流控芯片(500)上的检测窗口(570)两者之间的位置固定，并与微流控芯片夹具(800)上的开口位置对应，当微流控芯片夹具(800)的开口与微流控芯片(500)上的进出液口(510)、微流控芯片废液出口端(520)、微流控芯片入口端(530)对准连接时，光路对准检测通道上检测窗口(570)的中心点，从而免除芯片更换时重复检测点校正。

3.根据权利要求1所述的蛋白质快速分析检测装置，其特征在于：所述的微流控芯片(500)包括富集柱(550)、混合器(540)和检测窗口(570)。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：所述的混合器(540)是由一段1cm长的亲水性的丙烯酸酯类聚合物整体材料担当；且所述亲水性的聚合物整体材料作为富集柱柱塞使用；待检测蛋白质经富集柱(550)富集，洗脱时与混合器(540)中的荧光衍生试剂在亲水性的聚合物整体材料中混合和反应，实现快速标记。

5.将权利要求1所述的基于微流控芯片的蛋白质快速分析检测装置用于靶标蛋白质的快速分析检测。