CN100427944C - 负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统 - Google Patents
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Abstract
本发明的电泳系统包括一块含有多个毛细管电泳分离单元的三维毛细管阵列电泳微芯片,一个用微型真空泵作为负压源的负压进样和分离的装置,一个高压直流电源和一个激光荧光检测系统。仅用一个微流控芯片负压进样和分离的装置和一个高压直流电源就能完成阵列芯片毛细管电泳分析系统多重平行的分析测定,大大降低了阵列芯片毛细管电泳系统的制作成本,并且操作方便、安全、进样速度快,重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片毛细管电泳分析技术,特别是涉及微芯片毛细管阵列电泳的制作和进样技术。
背景技术
微流控芯片毛细管电泳技术已用于DNA测序,DNA片段的分离和鉴定,氨基酸、多肽、蛋白质的分离测定以及单细胞内组分的分析等。但是,只有一条分离泳道的芯片毛细管电泳不能实现多重平行测定,难以满足诸如基因测序、蛋白质组学研究、临床诊断、药物筛选等大批量样品分离分析的需要。研制芯片毛细管阵列电泳分析系统,可以通过多重平行测定,大幅度提高工作效率,降低分析成本。
目前在芯片毛细管阵列电泳中主要采用电动进样方式进样,每个芯片毛细管电泳分离单元均需配以相应电极,分离泳道越多,电极数目也成比例增加,相应的电源和控制系统也越复杂。并且由于电动进样时有“歧视效应”,即正负离子在电场中迁移速度不一致,导致样品塞的组成与样品溶液的组成不一致。通过延长进样时间可以减小样品塞与样品溶液组成上的差异,但又削弱了微流控芯片快速分析的特点。同时,芯片毛细管表面性质的变化会导致电渗流大小的改变,使进样的精密度大大降低;毛细管表面性质变化严重时,电渗流方向也会改变,使样品无法进入进样和分离泳道。
为了解决上述问题,在芯片毛细管阵列电泳中采用光门进样也有报道。将毛细管阵列电泳芯片固定在一个平台上往复移动。由大功率氩离子激光器产生的激光束被切光器分为能量不同的两束,其中能量大的门控光束被聚焦在通道上游靠近试样池处,能量小的检测光束被聚焦在通道下游靠近缓冲液池处。不进样时,试样中的荧光化合物在电渗流的作用下,从试样池沿直线形通道向下游运动,经门控光束的斑点时,在高能量的激光作用下,因发生光化学反应而分解成几乎不发荧光的化合物(光漂白作用),这些非荧光化合物与缓冲液一起流经通道下游的检测光束时形成了稳定的基线。当需要进样时,用一光闸挡住门控光束,使其不再照射在通道上,此时,试样中的荧光化合物以其原来的存在形式进入通道的中、下游,进而得到分离和检测。进样量的大小由光闸挡住门控光束的时间决定,时间愈长,进样量愈大,测得的信号愈强,而柱效则愈低。由于光门进样的设备昂贵,构造复杂,而且样品必须具有荧光,其应用受到了一定限制。
专利申请号:200510050547.4公开了一种负压进样和分离的装置,由微流控芯片、柱塞泵、三通阀、接口,高压电源组成。专利申请号:200610048906.6公开了一种用微型真空泵的微流控芯片负压进样和分离的装置,由微流控芯片、微型真空泵、真空瓶、电触点真空表、三通电磁阀、接口和高压电源组成。专利申请号:200610048907.0和200510050458.9公开了微流控芯片毛细管电泳负压进样方法,具有进样速度快,操作安全,设备简单等优点,但只能进行一条分离泳道的电泳分析,不能满足芯片毛细管阵列电泳分析的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单可靠的微流控芯片毛细管阵列电泳系统。克服目前微流控芯片毛细管电泳进样设备昂贵,构造复杂和进样时间长的缺点。
本发明提供的负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,包括含有多个毛细管电泳分离单元的三维毛细管阵列电泳微芯片,微型真空泵作为负压源的负压进样和分离的装置,高压直流电源和激光荧光检测系统组成,所述三维毛细管阵列电泳微芯片由三层基片制成,在上层基片上有公共的缓冲液池BT、公共的缓冲液废液池BWT、各样品溶液池S1-Sn和公共的样品废液池SWT;在中间一层的基片上有多个毛细管电泳分离单元的通道网络,每个分离单元均由一条分离泳道和一条进样通道组成,分离泳道的进口端通过一根公共的缓冲液通道Bbus联接在一起,并通过在上层基片相应位置处的小孔与公共的缓冲液池BT联在一起,分离泳道的出口端通过在上层的基片相应位置处的小孔与缓冲液废液池BWT相连通,每条进样通道的进口端也与上层的基片相应位置处各样品溶液池S1-Sn相连通;在底层基片上有一条公共的样品废液通道,各个分离单元中的进样通道出口端通过加工在中层基片上的小孔和位于底层基片上的公共样品废液通道连接在一起,并通过上层和中层玻璃基片的相应位置小孔,使位于底层基片的公共的样品废液通道与置于上层基片的公共的样品废液池SWT相通;所述负压进样装置由微型真空泵、真空瓶、电触点真空表、三通电磁阀、定时器,接口组成,通过接口与公共的样品废液池SWT相连;所述高压直流电源的正、负极与公共的缓冲液池BT与缓冲液废液池BWT中的电泳缓冲溶液相连接;所述激光荧光检测系统由电荷偶合检测装置、滤色片、激光器、和透镜组成。
本发明的电泳系统包括一块含有多个毛细管电泳分离单元的三维毛细管阵列电泳微芯片,一个用微型真空泵作为负压源的负压进样和分离的装置,一个高压直流电源和一个激光荧光检测系统。仅用一个微流控芯片负压进样和分离的装置和一个高压直流电源就能完成阵列芯片毛细管电泳分析系统多重平行的分析测定,大大降低了阵列芯片毛细管电泳系统的制作成本,并且操作方便、安全、进样速度快,重现性好。
本发明使用一个微流控芯片负压进样装置,当三通电磁阀b端和c端连通时,在公共的样品废液池SWT中形成负压,微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液在大气压的作用下通过加工在下层基片上的公共样品废液通道向公共的样品废液池SWT流动,在0.5秒内同时在多个进样通道和分离泳道的交叉处形成稳定的样品塞。
本发明通过负压进样装置中的定时器在0.5秒时自动将三通电磁阀由b端和c端连通切换到b端和与a端连通,使公共的样品废液池SWT与大气相通,它与其它液池之间的压力差立即同时消失,从而使在多个进样通道和分离泳道的交叉处形成样品塞被加在分离泳道上的电场所产生的电渗流带入分离泳道,开始电泳分离。
本发明在公共的缓冲液通道Bbus中放置了一根直径5微米的铂丝,并通过在上层基片相应位置处的小孔与公共的缓冲液池BT联在一起;分离泳道的出口端通过在上层的基片相应位置处的小孔与缓冲液废液池BWT相连通,将一个可调高压直流电源的正、负极与公共的缓冲液池BT与缓冲液废液池BWT中的电泳缓冲溶液相连接,在三通电磁阀b端切换到与a端后,多个进样通道和分离泳道的交叉处形成样品塞被加在分离泳道上的相同的电场所产生的电渗流带入分离泳道,在多个分离泳道中同时进行平行测定。
本发明使阵列芯片毛细管电泳芯片中大量毛细管电泳分离泳道与公共的样品废液通道加工在二个不同的平面上.使用微流控芯片负压进样方法(专利申请号:200610048907.0和200510050458.9),就可以完成阵列芯片毛细管电泳多个样品的同时进样和平行测定.
本发明的优点和效果如下:
1.本发明选用负压进样装置和方法实现了毛细管阵列电泳微芯片中大量毛细管电泳分离单元的同时进样和分离,具有进样装置结构简单、成本低廉、操作方便、负压稳定可控、进样速度快、无“歧视效应”,0.5秒就能得到与样品储液池中溶液组成相同的样品塞。
2.本发明通过将毛细管电泳功能通道阵列与公共的样品废液通道分别加工在中层和下层基片上,再通过在上、中二块基片相应位置钻孔的方法,制作了三维毛细管阵列电泳微芯片,从而使各分离单元中样品废液池连接在一起,仅用一个微流控芯片负压进样和分离的装置和一个高压直流电源就能完成阵列芯片毛细管电泳分析系统快速进样和多重平行的分析测定。
3.本发明选用的负压进样装置和方法具有通用性,既适合于使用各种基片材料,如玻璃,石英或高分子聚合物制作的毛细管阵列电泳微芯片,又能适合含有不同数量毛细管电泳分离单元的毛细管阵列电泳微芯片。
附图说明
图1.三维芯片毛细管阵列电泳的三层基片掩模图
图2.三维芯片毛细管阵列电泳的制作工艺和键合定位图
图3.负压进样三维六泳道毛细管芯片阵列电泳系统
图中:1-三维六泳道玻璃毛细管电泳微芯片,2-高压直流电源,3-负压进样装置,其中3-1,微型真空泵、3-2真空瓶、3-3电触点真空表、3-4三通电磁阀、3-5定时器,3-6接口 4-激光诱导荧光检测器,其中4-1CCD电荷偶合检测装置,4-2滤色片,4-3透镜,4-4激光器,4-5透镜,4-6透镜,4-7滤色片.
图4三维6泳道微芯片毛细管阵列的同时分离六个样品的电泳图
具体实施方式:
实施例1:
本发明中提供的三维毛细管阵列电泳微芯片1由三层基片制成,基片材料可以是玻璃,石英或高分子聚合物.在上层基片的合适位置处钻孔,作为三维毛细管阵列电泳微芯片的公共的缓冲液池BT、公共的缓冲液废液池BWT、各样品溶液池S1-Sn的出口和公共的样品废液池SWT的进口.在中间一层的基片上,加工含有大量毛细管电泳分离单元的通道网络,每个分离单元均由一条分离泳道和一条进样通道组成。这些分离泳道的进口端通过一根公共的缓冲液通道Bbus联接在一起,并通过在上层基片相应位置处的小孔与公共的缓冲液池BT联在一起;分离泳道的出口端通过在上层的基片相应位置处的小孔与缓冲液废液池BWT相连通。每条进样通道的进口端也与上层的基片相应位置处各样品溶液池S1-Sn相连通,同时在底层基片上的在相应位置处加工了一条公共的样品废液通道SWbus,各个分离单元中的进样通道出口端通过加工在中层基片上的小孔和位于底层基片上的公共样品废液通道连接在一起,并通过上层和中层玻璃基片的相应位置小孔,使位于底层基片的公共的样品废液通道与置于上层基片的公共的样品废液的出口SWT相通。
三维六泳道毛细管电泳微芯片的掩模图形如图1所示。其中,图1(a)为微芯片上层的掩膜图形,这块掩膜的作用是在微芯片的上层玻璃基片上确定六个样品池S1-S6,公共的缓冲液池BT、公共的缓冲液废液池BWT的钻孔位置。涂有光胶的铬板经曝光后,无需刻蚀,直接用金刚石钻头钻孔后除去光胶和铬层即可制得微芯片上层基片。图1(b)为微芯片中层基片上的掩膜图形.含有大量毛细管电泳分离单元的通道网络加工在中层基片上,这块掩膜的作用是在芯片中层玻璃基片上加工含有6个毛细管电泳分离单元的通道网络,每个分离单元均由一条分离泳道和一条进样通道组成。这些分离泳道的前15mm成扇型,以保证有足够的空间来安装样品池S1-S6,分离泳道的进口端通过一根公共的缓冲液通道Bbus联接在一起,并通过在上层基片相应位置处的小孔与公共的缓冲液池BT;分离泳道的后35mm相互平行,间距为120μL,以降低激光器发出的激发光能量的损失和减少由于泳道过度弯曲而使样品的分离度变差,6条分离泳道的出口端通过在上层的基片相应位置处的小孔与缓冲液废液池BWT相连通。每条进样通道的进口端也与上层的基片相应位置处的小孔与样品溶液池S1-S6相连通。涂有光胶的铬板经曝光、刻蚀、除铬,得到宽度为60微米、深度为20微米的三维六泳道玻璃毛细管电泳微芯片的通道网络,公共的缓冲液通道Bbus的宽度为1000微米、深度为20微米。图1(c)为微芯片下层基片的掩膜图形,这块掩膜的作用是在芯片第三层上确定三维毛细管阵列电泳微芯片公共样品废液通道SWbus的位置。经光刻和蚀刻加工后,在底层基片得到宽度为1000微米、深度为60微米的公共样品废液通道。各个分离单元中的进样通道出口端通过加工在中层基片上的小孔和位于底层基片上的公共样品废液通道连接在一起,并通过上层和中层玻璃基片的相应位置小孔,使位于底层基片的公共的样品废液通道与置于上层基片的公共的样品废液的出口(SWT)相通。
将加工好的三块基片洗净后,按图2所示的顺序将位置对准后通过键合的方法使它们封合得到三维六泳道玻毛细管电泳微芯片。为了保证在电泳分离时各分离泳道二端所加的电场强度相同,在公共的缓冲液通道Bbus中放置了一根直径5微米的铂丝。在上层基片的缓冲液池BT,缓冲液废液池BWT和公共样品废液池SWT的孔位处分别用环氧胶粘合内径约为4mm,高度约为6mm的塑料管各一个作为相应的储液池,储液池容积约为120μL。6个样品池S1-6的孔位处用内径约为2mm,高度约为4mm的塑料管各一个作为相应的样品储液池,储液池容积约为15μL。
实施例2:用负压进样三维六泳道毛细管芯片阵列电泳系统平行分离测定多个样品
负压进样三维六泳道毛细管芯片阵列电泳系统如图3所示,由三维六泳道玻璃毛细管电泳微芯片1,高压直流电源2,负压进样装置3和激光诱导荧光检测器4组成,负压进样装置3参见发明专利(专利申请号:200610048906.6),由微型真空泵3-1、真空瓶3-2、电触点真空表3-3、三通电磁阀3-4、定时器3-5和接口3-6组成。激光诱导荧光检测器由简称CCD的电荷偶合检测装置(4-1),滤色片(4-2,4-7),激光器(4-4)和透镜(4-3,4-5,4-6)组成.
参见图1和图2,微流控芯片1上缓冲液储液池BT和缓冲液废液储液池BWT之间是6条分离泳道,6条进样通道出口端通过加工在中层基片上的小孔和位于底层基片上的公共样品废液通道连接在一起,并通过上层和中层玻璃基片的相应位置小孔,使位于底层基片的公共的样品废液通道与置于上层基片的公共的样品废液池SWT相通。参见图3,三通电磁阀3-4的b端口通过联接管道与接口3-6相连,接口3-6安装在微流控芯片公共的样品废液池SWT上面,将密封胶管插入废液储液池SWT上部作为接口,插入的密封胶管始终保持不与SWT储液池内的电泳缓冲液的液面相接触,同时保证接口的气密性。在微流控芯片上6个样品储液池S1-6中分别加入5微升三种不同的样品溶液,其中S1和S2中加2.0×10-5M罗丹明123和2.0×10-5M荧光素钠的混合溶液,S3和S4中加4.0×10-5M罗丹明123和4.0×10-5M荧光素钠的混合溶液,S5和S6中加8.0×10-5M罗丹明123和8.0×10-5M荧光素钠的混合溶液,在其他储液池BT、BWT和SWT加入150,150和5微升的20mmol/L pH9.2的硼砂电泳缓冲液,保持分离泳道两端储液池BT和BWT的液面高度相同,样品储液池S1-6中液面的高度小于分离泳道两端储液池BT和BWT的液面高度,公共的样品废液池SWT中的液面高度小于储液池S1-6中液面的高度。
操作步骤是:
首先设定电触点真空表的最大真空度为-500mbar,最小真空度为-50mbar。将三通电磁阀b端和a端连通,c端截止。接通微型真空泵电源,使真空瓶内形成负压,真空瓶内的真空度为-50-500mbar,当瓶内真空度达到设定真空度上限时,电触点真空表关闭微型真空泵电源,当瓶内真空度低于设定真空度下限时,电触点真空表启动微型真空泵,使瓶内真空度稳定在设定的范围内;将激光线聚焦在分离泳道上距通道十字交叉点30mm的检测点处,用激光荧光法检测电泳分离结果。在分离泳道BT端施加+2000V高电压,BWT端接地。
在进样阶段,使三通电磁阀b端和c端连通,定时器同时开始计时,真空瓶3-3经接口3-6与微流控芯片公共的样品废液池SWT相通,使公共的样品废液池SWT中形成负压,微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液等在大气压的作用下通过加工在下层基片上的公共样品废液通道SWbus向公共的样品废液池SWT流动,在0.5秒内同时在6个进样通道和分离泳道的交叉处形成稳定的样品塞。
通过定时器在0.5秒时自动将三通电磁阀b端切换到与a端连通,使三维芯片毛细管阵列电泳系统从进样阶段切换到分离阶段。由于三通电磁阀的a端直接与大气相通,从而使公共的样品废液池SWT与大气相通,它与其它液池之间的压力差立即同时消失,从而使在6个进样通道和分离泳道的交叉处形成样品塞被加在分离泳道上的电场所产生的电渗流带入分离泳道,开始电泳分离,同时记录电泳图,6条泳道同时分离得到的电泳图见图4,罗丹明和荧光素钠的平均迁移时间分别为15.3和33.0s,其相对标准偏差分别为3.5 and 1.5%.且在测定范围内荧光强度和浓度的线性关系良好,罗丹明和荧光素钠的校正曲线的回归系数分别为0.996和0.999。
Claims (6)
1、一种负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,其特征在于:系统主要由含有多个毛细管电泳分离单元的三维毛细管阵列电泳微芯片,微型真空泵作为负压源的负压进样和分离的装置,高压直流电源和激光荧光检测系统组成;所述三维毛细管阵列电泳微芯片由三层基片制成,在上层基片上有公共的缓冲液池(BT)、公共的缓冲液废液池(BWT)、各样品溶液池(S1-Sn)和公共的样品废液池(SWT);在中间一层的基片上有多个毛细管电泳分离单元的通道网络,每个分离单元均由一条分离泳道和一条进样通道组成,分离泳道的进口端通过一根公共的缓冲液通道(Bbus)联接在一起,并通过在上层基片相应位置处的小孔与公共的缓冲液池(BT)联在一起,分离泳道的出口端通过在上层的基片相应位置处的小孔与缓冲液废液池(BWT)相连通,每条进样通道的进口端也与上层的基片相应位置处各样品溶液池(S1-Sn)相连通;在底层基片上有一条公共的样品废液通道(SWbus),各个分离单元中的进样通道出口端通过加工在中层基片上的小孔和位于底层基片上的公共样品废液通道连接在一起,并通过上层和中层玻璃基片的相应位置小孔,使位于底层基片的公共的样品废液通道与置于上层基片的公共的样品废液池(SWT)相通;所述负压进样装置由微型真空泵、真空瓶、电触点真空表、三通电磁阀、定时器,接口组成,通过接口与公共的样品废液池(SWT)相连;所述高压直流电源的正、负极与公共的缓冲液池(BT)与缓冲液废液池(BWT)中的电泳缓冲溶液相连接;所述激光荧光检测系统由电荷偶合检测装置、滤色片、激光器、和透镜组成。
2、根据权利要求1所述的负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,其特征是使用一个微流控芯片负压进样装置,当三通电磁阀b端和c端连通时,在公共的样品废液池(SWT)中形成负压,微流控芯片上其他储液池中的样品溶液和缓冲液在大气压的作用下通过加工在下层基片上的公共样品废液通道向公共的样品废液池(SWT)流动,在0.5秒内同时在多个进样通道和分离泳道的交叉处形成稳定的样品塞。
3、根据权利要求1所述的负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,其特征是所述负压进样装置,通过定时器在0.5秒时自动将三通电磁阀由b端和c端连通切换到b端和与a端连通,使公共的样品废液池(SWT)与大气相通,它与其它液池之间的压力差立即同时消失,从而使在多个进样通道和分离泳道的交叉处形成样品塞被加在分离泳道上的电场所产生的电渗流带入分离泳道,开始电泳分离。
4、权利要求1所述的负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,其特征是阵列芯片毛细管电泳芯片中毛细管电泳分离泳道与公共的样品废液通道在二个不同的平面上,使用一个负压进样装置就能实现多泳道微芯片毛细管电泳的同时进样和分离分析。
5、根据权利要求1所述的负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,其特征是在公共的缓冲液通道(Bbus)中放置了一根直径5微米的铂丝,并通过在上层基片相应位置处的小孔与公共的缓冲液池(BT)联在一起;分离泳道的出口端通过在上层的基片相应位置处的小孔与缓冲液废液池(BWT)相连通,将一个可调高压直流电源的正、负极与公共的缓冲液池(BT)与缓冲液废液池(BWT)中的电泳缓冲溶液相连接,在三通电磁阀b端切换到与a端后,多个进样通道和分离泳道的交叉处形成样品塞被加在分离泳道上的相同的电场所产生的电渗流带入分离泳道,在多个分离泳道中同时进行平行测定。
6、根据权利要求1或4所述的负压进样三维芯片毛细管阵列电泳系统,其特征是公共的缓冲液池(BT)、公共的缓冲液废液池(BWT)、和公共的样品废液池(SWT)储液池容积为120μL,每个样品池容积为15μL,三维玻璃毛细管电泳微芯片的通道网络的宽度为60微米、深度为20微米,公共的缓冲液通道(Bbus)的宽度为1000微米、深度为20微米,公共样品废液通道(SWbus)的宽度为1000微米、深度为60微米。
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