CN1548546A - 一种基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：以十字型通道的微流控芯片作为操作平台；将含有细胞裂解剂、筛分剂的缓冲液加入到缓冲池中；然后将细胞液加入细胞池中；在缓冲池和废液池之间施加电压，单个细胞被引入到水平通道中，与缓冲液中的裂解剂接触，破裂，释放出的内涵物在电场下定向迁移完成电泳过程。本发明方法既可以实现单个细胞的连续进样、裂解，又可以分析单个细胞内的核酸、蛋白质、氨基酸、糖及其它物质，或并行分析上述物质，同时该方法具有相当的通量，克服了毛细管电泳技术操作复杂的不足。
Description
技术领域：
本发明主要涉及在微流控芯片平台上实现连续单细胞的进样、裂解及内涵物检测的分析方法。
背景技术：
传统的分析细胞内涵物方法以大量细胞为前提，获取某一内涵物(比如蛋白质，核酸等)含量的总值，该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该物质的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受，但在另外一些场合下，比如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时，传统方法将会平均掉该特异变化。因此，单个细胞层面的分析有助于疾病的早期诊断。此外，与传统方法相比，单细胞分析在信息的获取上相对准确；有可能检测活性周期较短的不稳定中间产物。
从技术角度来看，单个细胞的分析可以分为完整的单细胞分析和破碎的单细胞分析。本发明仅涉及到后一种技术。在该技术类别中目前已有的技术包括单细胞凝胶电泳和毛细管电泳。前者的对象更多的局限于DNA损伤的分析。毛细管电泳技术分析单细胞内涵物的方法相对比较成熟，但它存在着操作困难，通量低，不易完全自动化等缺点。
微流控芯片作为一种新型分析平台(又名芯片实验室，微全分析系统等)具有易自动化，集成化程度高等优势，目前在该平台上已经实现的有单细胞的培养、细胞的分离、分选、及细胞的输运、操纵和裂解，但其在单细胞内涵物分析检测方面的工作，世界范围内尚未充分展开。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种以微流控芯片为操作平台的单细胞内涵物的分析方法，该方法既可以实现单个细胞的连续进样、裂解，又可以分析单个细胞内的核酸、蛋白质、氨基酸、糖及其它物质，或并行分析上述物质，同时该方法具有相当的通量，克服了毛细管电泳技术操作复杂的不足。
本发明提供了一种基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：
以十字型通道的微流控芯片作为操作平台，垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池，水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池，见图1；
将含有细胞裂解剂、筛分剂、染料的缓冲液加入到缓冲池中，使缓冲液充满所有通道；
然后将细胞液加入细胞池中，使细胞在无电压的情况下，仅从细胞池流向空池，见图2；
当在缓冲池和废液池之间施加电压时，单个细胞在电动力、压力联合驱动下，被引入到水平通道中，见图3，与缓冲液中的裂解剂接触，破裂，释放出的内涵物在电场下定向迁移完成电泳过程。
利用荧光显微镜成像法验证了流体在压力和电动力联合作用时，十字通道处流体的流型。将荧光染料加入到细胞池中，染料在压力作用下向其他三个储液池流动(见附图4)，当在水平两端施加电压时，右侧缓冲池中的缓冲液在电渗驱动下流入水平通道，与压力驱动下的染料流体形成一个分界面(见附图5、6)，当电场强度超过100V/cm时，染料被顶回垂直通道中(见附图7)。上述实验过程证实了在压力、电动力联合作用下，染料可以连续流入水平通道，电场强度的大小可以作为调节阀，控制流入染料量的多少。
本发明中所用细胞浓度应在103个/mL-108个/mL之间，细胞浓度低于这个范围，耗时长。高于这个范围，由于细胞相互接触的机会大，难以做到单细胞分析。本发明中细胞裂解液可以选用任何一种已知的细胞裂解液，如十二烷基磺酸钠等。单细胞细胞裂解液浓度应在0.01％-0.9％之间，通常情况下裂解液浓度低于该范围，细胞在流过通道时仍保持完整，高于此范围，细胞裂解过快。本发明中筛分剂可以选用任何一种已知的筛分剂，如羟丙基甲基纤维素（HPMC)等，筛分剂浓度应在0.15％-10％之间，低浓度的筛分介质达不到筛分效果，高浓度的筛分介质粘度大，难以灌入通道中。
本发明用微流控芯片材料可以是石英、玻璃、硅或者PMMA、PDMS聚合物。
附图说明：
图1为芯片结构图；
图2为在压力作用下细胞流向空池过程示意；
图3为在电动力、压力联合驱动下细胞被连续引入到水平通道过程示意；
图4为染料流体在压力作用下向其他三个储液池流动照片；
图5为缓冲液在电渗驱动下流入水平通道的照片；
图6为在压力和电动力驱动下缓冲液与染料流体分界面处的照片；
图7为当电场强度超过100V/cm时，染料流体被顶回垂直通道中的照片；
图8为鲤鱼血红细胞的核酸检测图。
具体实施方式：
以激光诱导荧光的方法进行检测：首先把细胞和嵌入式染料混合，以保证细胞裂解后，核酸能迅速与染料结合。缓冲液池和废液池中分别依次加入缓冲液(内含细胞裂解液，筛分剂，染料等)，随后，在细胞池中加入细胞液，同时在缓冲池和废液池中插入铂电极，高压(该电压在通道内产生的场强在50V/cm-250V/cm之间)驱动单个细胞连续进入水平通道中。在该通道内完成单个细胞的裂解及释放的内涵物与染料的标记。当标记了染料的内涵物通过激光焦斑时，被激光激发出的荧光由光电倍增管采集。
实施例1
见附图1芯片结构图。运行缓冲液为10mM PBS，细胞为鲤鱼血红细胞，浓度约105个/mL。细胞裂解液为0.7％SDS。所用染料是YOYO-I(1uM)。激光波长488nm。细胞在缓冲池和废液池之间的通道内裂解，释放出的核酸带负电，如果缓冲液仅含PBS，则检测点在附图1B处。当缓冲液中含PBS及HPMC时，检测点在附图1A处
附图8所示的是鲤鱼血红细胞的核酸检测图。运行缓冲液为10mMPBS,，浓度约107个/mL 。细胞裂解液为0.7％SDS。激光波长488nm。在缓冲液池和废液池的通道中的电场强度为120V/cm，检测点在附图1B处检测。
Claims (8)
1、一种基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：
以十字型通道的微流控芯片作为操作平台，垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池，水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池；
将含有细胞裂解剂、筛分剂的缓冲液加入到缓冲池中，使缓冲液充满所有通道；
然后将细胞液加入细胞池中，使细胞在无电压的情况下，仅从细胞池流向空池；
在缓冲池和废液池之间施加电压，使单个细胞在电动力、压力联合驱动下，被引入到水平通道中，与缓冲液中的裂解剂接触，破裂，释放出的内涵物在电场下定向迁移完成电泳过程。
2、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：所述细胞液浓度在103个/mL-108个/mL之间。
3、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：所述细胞裂解液浓度在0.01％-0.9％之间。
4、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：所述筛分剂浓度在0.15％-10％之间。
5、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：所述电压在通道内产生的场强在50V/cm-250V/cm之间。
6、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：所述缓冲液中加入染料。
7、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：所述细胞液中加入染料。
8、按照权利要求1所述基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法，其特征在于：检测方式是激光诱导荧光法或者是电化学法。
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| CNA031116205A CN1548546A (zh) | 2003-05-09 | 2003-05-09 | 一种基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法 |
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| CN1548546A true CN1548546A (zh) | 2004-11-24 |
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| CNA031116205A Pending CN1548546A (zh) | 2003-05-09 | 2003-05-09 | 一种基于微流控芯片平台的连续单细胞内涵物的分析方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN1548546A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100357730C (zh) * | 2005-05-27 | 2007-12-26 | 南通大学附属医院 | 脂蛋白微流控芯片电泳检测方法 |
| CN100410658C (zh) * | 2005-09-12 | 2008-08-13 | 陕西师范大学 | 单细胞凝胶电泳装置 |
| CN103331097A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-10-02 | 陕西师范大学 | 聚二甲基硅氧烷微流控芯片在分离寡多糖中的应用 |
| CN111182971A (zh) * | 2017-10-03 | 2020-05-19 | 阿威尔斯医疗公司 | 用于基于氧化还原反应测定微生物的浓度和微生物对抗感染剂的敏感性的装置、系统和方法 |
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2003
- 2003-05-09 CN CNA031116205A patent/CN1548546A/zh active Pending
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