CN1699984A - 一种多通道微流控芯片、其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

微流控芯片具有体积小、分析速度快的特点，可实现高度自动化和集成化，是当前分析化学领域发展的前沿。尽管微流控芯片结合激光诱导荧光检测已可进行384通道的高通量检测，但是多通道电化学检测至今还未见报道。本发明提供了一种多通道微流控芯片，该芯片采用高分子材料聚甲基丙烯酸甲酯为材料，运用光刻和蚀刻等技术制作了单晶硅阳模，微通道采用热压法或原位聚合法制作。将检测电极通道集成于基片上，可在电极内填充功能材料，并且可以有效的精确控制工作电极与分离通道的距离，简化了实验操作。本发明充分的发挥了电化学检测在微流控芯片中的优势，首次研制了应用于电化学检测的多通道微流控芯片，能够高效率、高通量地对样品进行分析。

Description

一种多通道微流控芯片、其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微流控芯片领域，研制了一种基于聚甲基丙烯酸甲酯为材料、应用于电化学检测的多通道微流控芯片。本发明还提供了该芯片的制备方法与应用。

背景技术

自20世纪90年代初Manz等提出“微全分析系统”的概念以来，分析系统的集成化与便携化成为现代分析仪器的主要发展趋势。与传统的毛细管电泳技术相比，微流控芯片具有样品用量少、分离速度快的优点，但同时对检测的灵敏度和响应速度的要求更高。最常用的检测方式是激光诱导荧光检测(LIF)，但是该方法检测所需仪器昂贵，并且庞大笨重。电化学检测(ED)灵敏度高，且所需仪器体积小、易于集成，在尺寸上与芯片实验室的概念匹配。印制的厚膜电极、碳糊、碳纤维作为电极材料也已在微流控芯片电化学检测中得到了广泛的应用。

最常见的制作芯片的材料是玻璃和石英。玻璃和石英有很好的电渗性质和光学性质，可采用标准的刻蚀技术加工，容易对通道表面进行改性，但难以得到宽深比较大的通道，加工成本高，封接难度大。高分子聚合物作为微流控芯片的材料越来越受到关注。各种类型的高分子聚合物，包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯等都已广泛的用于芯片制作。

与此同时，芯片的集成度也得到了极大的提高，通道的设计形式非常多样。有关微流控芯片的专利申请也日益增多。对2001-2005年的美国专利以microfluidic和chip为关键词组合检索，共有11项专利。其中关于多通道芯片的专利有1项(200401133068，Multi-channel microfluidic chip for electrosprayionization)，该专利设计了一种应用于质谱分析的芯片；关于电化学检测的专利为1项(20020079219，Microfluidic chip having integrated electrodes)，该专利设计了一种将电极集成于一体的芯片，电极的材料可以金属或导电墨水，在塑料薄膜上将通过电沉积、印刷或其它方式制作电极，该专利主要是侧重于新型电极的制作。

对1985-2005年的中国专利以“多通道”与“芯片”为关键词组合检索有4项专利。其中微流控芯片专利2项，分别是：申请号02256483，发明名称为一种多通道芯片安培检测仪及检测系统，该专利设计了并列的恒电位电流—电压变换器，主要是安培检测仪的设计；申请号：02353129，多通道微流控芯片，为外观设计专利，设计了应用于激光诱导荧光的多通道芯片。以“微流控”与“芯片”为关键词检索共有28项专利，其中应用于电化学检测的专利为1项，申请号03145053，发明名称为电化学检测-微流控芯片及制作方法和再生方法。该专利发明了一种电化学检测—微流控芯片，将含微沟道的硅橡胶聚二甲基硅氧烷基片与载玻片上的电极条对齐，形成微流控通道，微通道出口与检测电极之间距离为20-60微米，电化学检测为柱端检测模式。该发明以商品化的铬板玻璃为材料，通过光刻和湿法腐蚀工艺制作出玻璃硬模板，用于PDMS的模塑成型，制得组成微流控芯片所需的微通道和用于制作电极的软模板。该玻璃硬模板在操作中可反复使用，制作的PDMS微沟道尺寸均一、形状重现性好。周小棉、林炳承等发明了一种微流控芯片(申请号02274236，一种微流控芯片)，芯片的宽度为4～6cm，长度为7～9cm，厚度为1～3mm，具有十字构型微通道，该芯片由一块一面集成有十字构型微通道的聚合物平板A和一块聚合物材质的封接平板B叠合而成；两个平板中间形成封闭通道，在其中任意一块平板上设置有通道的进出口，其特征在于：平板B的厚度为100μm～600μm。十字构型微通道可以按一正一反相间排布。

从有关微流控芯片的专利检索可以看出，尽管微流控芯片电化学检测所采用的芯片材料与电极材料多种多样，芯片的制作方法较之传统的玻璃芯片也有了长足进展，但仍未突破单通道的局限性，因此，电化学检测在微流控芯片中的优势并未得到真正发挥。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种应用于电化学检测的多通道微流控芯片。

本发明的另一个目的是提供上述多通道微流控芯片的制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述多通道微流控芯片在电化学检测方面的应用。

本发明提供了一种多通道微流控芯片。该芯片由缓冲液池、样品池、检测池、进样通道、分离通道、电极通道和电极通道中的电极等组成。该芯片缓冲液池伸出若干分离通道，每条分离通道上，各有一个样品池、检测池、进样通道和电极通道以及电极通道中的电极，检测池在分离通道的另一端；样品池通过进样通道与分离通道相通；电极通道一端与外接电源相通，另一端靠近检测池。不同分离通道、进样通道、样品池、检测池之间互不相通。

本发明的微流控芯片可以以有机玻璃作为材质。例如，采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯等高分子聚合物为材料，在本发明的一个实施例中，以聚甲基丙烯酸甲酯作为微流控芯片的材质。

本发明的微流控芯片中，该微流控芯片的分离通道、进样通道、电极通道的高度为25～100微米，宽度为25～100微米，分离通道的长度为40～80毫米；进样通道长度1～5毫米，进样通道与分离通道的交点到分离通道远端端点间的距离为35～75毫米。

本发明的微流控芯片中，电极通道与检测池边缘的距离为25-50微米。

本发明的微流控芯片中，样品池的直径为1～3毫米，检测池的直径为3～6毫米，各检测池圆心之间的距离为8～15毫米。

本发明的微流控芯片中，各分离通道之间平行，相邻两分离通道之间距离为7～20毫米；该微流控芯片的各电极通道之间平行，相邻两电极通道之间距离为7～20毫米。

本发明的微流控芯片中，进样通道与分离通道夹角为30～90度。

本发明的微流控芯片中，每条检测通道上还可以增加一个废液池，废液池通过另一段进样通道与分离通道相通，废液池的直径为1～3毫米。

本发明的微流控芯片中，缓冲液池的横截面可以为平行四边形，宽为4～10毫米，长为24～49毫米，长与宽之间的夹角为30～90度。

本发明的微流控芯片中，缓冲液池、样品池、检测池、废液池的高度为1～3mm。

本发明的微流控芯片的通道数可根据实际情况确定，如所用材质的性质，待测样品的数量及其中各成分的性质差别，外接电压控制仪器的接线，等等。在本发明的一个实施例中，制备了一个4通道的多通道微流控芯片。

另一方面，本发明提供了上述多通道微流控芯片的制备方法，包括以下几个步骤：

(1)用热压法或原位聚合法在基片上制作分离通道、进样通道和电极通道，并在电极通道内填充功能碳糊材料作为工作电极；

(2)在盖片上采用金刚钻打孔制作缓冲液池，通过激光打孔制作样品池、检测池和废液池；

(3)封合基片与盖片。

上述制备方法可按如下步骤具体操作：

(1)单晶硅阳模的制作

将芯片设计图形用CAD软件绘制，图形线宽均为25～100μm，采用高清晰激光照排系统输出在透明的胶片上(背景透明，所需图像为黑色)，即得光刻掩模。

通过化学气相沉积(CVD)在基片上沉积一层氮化硅薄膜作为牺牲层，在此基片上通过旋转覆膜技术覆一层SU-8光敏胶(正光胶)，于烘箱中60℃处理10～15min；将光刻掩膜覆盖在基片上，通过曝光成像的原理将光刻掩膜上的图形转移到基片表面的光胶层上；再通过干法腐蚀的方法将光胶层上的平面二维图形加工成具有一定深度的立体结构。即可得到具有凸起的通道的单晶硅阳模。制作好的阳模依次用H₂O₂∶H₂SO₄溶液(体积比为1∶4)，丙酮和二次蒸馏水清洗，以除去表面的氧化物。

(2)通过热压法或原位聚合法复制通道

将PMMA有机玻璃片切割成一定尺寸，超声清洗，自然晾干，在热压装置中将PMMA基片加热到软化温度(106℃)，通过在单晶硅阳模上施加一定的压力(4英寸面积上加力20～30kN)，并保持30～60s，即可在PMMA基片上压制出与阳模互补的微通道，然后在加压的条件下，将阳模和刻有微通道的PMMA基片一起冷却后脱模，就得到所需的微通道。

热压法所需仪器简单，操作方便，但是通道容易变形。我们尝试了采用紫外光引发原位聚合甲基丙烯酸甲酯制备微流控芯片，将聚合物单体甲基丙烯酸甲酯与引发剂混合，并添加一定量的功能性单体(甲基丙烯酸或4-乙烯基吡啶等)。将该混合物中注入模具中，采用紫外光引发聚合，芯片脱模后，即得到刻有微通道的PMMA基片，该法能够有效的消除通道变形的问题。

在电极通道内小心地填充碳糊(或其它功能材料)作为工作电极，刮去多余的碳糊，在红外灯下固化12～16小时。

(3)在盖片上制作储液池

常规的芯片制作大都采用金刚钻打孔，本发明中的缓冲液池采用金刚钻打孔。由于本发明研制的是多通道芯片，对样品池、废液池、检测池之间的相对位置要求非常精确，因此样品池、废液池、检测池的制作采用激光打孔。PMMA在紫外激光作用下可降解成易挥发的小分子。用铜箔制备光刻掩膜以确定打孔位置，用紫外激光通过显微物镜和光刻掩膜，将激光能量聚焦在可光解的PMMA盖片上，使光刻掩膜在PMMA盖片上所界定区域内发生激光溅射。调整激光强度和盖片表面所接受的脉冲数，可控制激光烧蚀的深度。通过本发明所提供的方法可得到精确大小和位置的储液池孔。

(4)芯片封合

在显微镜下对准PMMA基片与盖片，使电极通道与检测池边缘距离25～50μm左右(电极通道与分离通道末端距离)，将此基片与盖片固定用二片盖玻片夹紧，放置在108℃烘箱内保温10～15min，即可得到所需的PMMA多通道微流控芯片。

本发明还提供了上述微芯片的应用，即将该多通道微流控芯片与控制设备相连接，加入缓冲液与样品，控制电压完成待测组分的分离、分析和检测。

将芯片与控制设备连接，加入分离液和样品，控制电压完成样品的分离、分析和检测。其原理是，在电场的作用下，利用样品中各成分在缓冲液中迁移率的不同而实现分离，分离后的样品中的待测成分依次到达检测池而被检出。由于本发明所设计的多个检测池互相独立，因此可以对样品中的同一物质进行高通量检测，也可对样品中的多种物质采用不同的电化学检测方法进行测定。

具体测定步骤如下：

首先，根据实际需要对芯片的通道进行改性与修饰。

其次，在图3所示的多通道芯片示意图中，在缓冲液池1中插入铂丝作为高压分离正极，在样品池2中插入铂丝作为高压进样正极，在废液池3中插入铂丝作为进样负极。4为检测池，池内为三电极体系：工作电极、参比电极与对电极。将工作电极用银胶以铜丝引出，参比电极为自制的Ag/AgCl电极，对电极为铂丝。三电极之间的相对位置见图4。铜丝直径为0.5～1mm，长1～2cm，铂丝的直径为0.5～1mm，长1～2cm，参比电极为自制的Ag/AgCl参比电极。Ag长度约为0.5～1mm，长1～2cm，通过电镀使之沉积上一层约100～300nm厚的AgCl，即得Ag/AgCl参比电极。

再次，将芯片上所有电极的引出线连接到多通道电化学分析仪的相应的工作电极接线、对极接线和参比电极接线端口。

然后，将微流控芯片高压电源的加电压接线分别连接储液池。

随后，将电化学分析仪的方法设置与参数设置按照实际需要进行设定；将微流控芯片高压电源的电压施加方式在程序中进行设定。

最后，采用真空减压法使多通道芯片的进样通道与分离通道均充满缓冲溶液。在样品池2中加入样品，施加高压，样品溶液即充满进样通道5，当启动储液池1与检测池4之间的高压时，分离通道与进样通道交叉口的样品溶液即被带入分离通道，开启已设定的程序，对样品进行测定。

本发明充分发挥了电化学检测在微流控芯片中的优势，首次将多通道微流控芯片成功应用于电化学检测。本发明的微流控芯片用于鉴定化工、生物、医药等行业的样品，可以同时分离、分析和检测复杂样品中的成分，又避免了现有常规分析方法中由荧光试剂导致的高成本和干扰问题，具有高通量和高灵敏度的优点。此外，本发明的微流控芯片的通道宽深比较大，制备过程简易，成本低廉，因此，本发明在电化学检测领域将有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为多通道微流控芯片掩膜设计图。其中圆的半径为4英寸(与单晶硅模大小相同)；5为进样通道，长度为1～5mm，5下方与之在同一直线上的三条线段均为进样通道，尺寸与5相同；6为分离通道，长度为40～80mm。5与6的夹角为30～60度，进样通道的有效程度为35～75mm(5与6的交点到分离通道右侧端点间的距离)，6上方与之平行的三条线段亦为分离通道，尺寸与6相同，相邻两分离通道垂直间距为8～15mm，相邻两分离通道端点之间水平间距为6～10mm。所有通道的线宽均为25～100μm；7为工作电极通道，长度为7～9mm，7右侧有三条与之平行的线段，均为工作电极通道，长度分别为13～15、19～21、25～27mm，相邻两工作电极之间水平距离为6～10mm。

图2是划片后的单晶硅阳模示意图。

图3应用于电化学检测的多通道微流控芯片示意图。其中，1：缓冲液池；2为样品池；3为废液池；4为检测池。5为进样通道；6为分离通道；7为工作电极通道。

图4是分离通道出口与工作电极相对位置示意图。其中，4为检测池；6为分离通道；8为填充的碳糊作为工作电极；9为Pt丝，作为对电极；10为Ag/AgCl参比电极。

具体实施方式

实施例1 A片的制作

A片为基片，其制作包括单晶硅阳模、分离进样微通道、工作电极的制作，具体制作过程为：

(1)掩膜的制作：采用CAD软件绘制图1所示的设计图，进样通道长度(指样品池与废液池边缘之间的距离)为2.828mm，4条工作电极通道长度分别为7、13、19、25mm，相邻两工作电极之间水平间距为6mm，分离通道长50mm，进样通道与分离通道的交点距分离通道右侧端点为45mm，相邻两分离通道垂直间距为7mm，所有线宽均为50μm。将此设计图采用高清晰激光照排系统输出在透明的胶片上，即得光刻掩膜。

(2)单晶硅阳模的制作：在550～700℃通过化学气相沉积(CVD)在基片上沉积—层氮化硅薄膜作为牺牲层，在此基片上通过旋转覆膜技术覆一层SU-8光敏胶(正光胶)，于烘箱中60℃处理10min；将光刻掩膜覆盖在基片上，通过曝光成像的原理将光刻掩膜上的图形转移到基片表面的光胶层上；再通过干法腐蚀的方法将光胶层上的平面二维图形加工成具有一定深度的立体结构。即可得到具有凸起的通道的单晶硅阳模，通道的深与宽均为50μm。制作好的阳模依次用H₂O₂∶H₂SO₄溶液(体积比为1∶4)，丙酮和二次蒸馏水清洗，以除去表面的氧化物。

(3)通过热压法复制微通道

基片厚度为0.5～2mm，在本实施例中，选用的基片厚度为1mm。将1mm厚的PMMA有机玻璃片切割成长方形，尺寸为4.0×8.0cm，超声清洗，自然晾干，在热压装置中将PMMA基片加热到106℃，通过在单晶硅阳模上施加一定的压力(4英寸面积上加力20kN)，并保持30s，即可在PMMA基片上压制出与阳模互补的微通道，然后在加压的条件下，将阳模和刻有微通道的PMMA基片一起冷却后脱模，就得到所需的微通道。

(4)工作电极的制作

4条工作电极通道长度分别为7、13、19、25mm，电极通道为宽、深度均为50μm的电极沟槽，其轴向与分离通道垂直，向槽内小心地填充碳糊作为工作电极，刮去多余的碳糊，在红外灯下固化12h，即完成基片的制作。

实施例2 B片的制作

B片为盖片，其结构包括各种储液池孔，包括1个缓冲液池、4个样品池、4个废液池和4个独立的电化学检测池。具体制作过程为：

(1)B片的尺寸为4.0×8.0cm，厚度为1～3mm，在本实施例中选用厚度为2mm的PMMA。用蒸馏水洗涤盖片，并置于0.1mol/L的NaOH溶液中浸泡30min，再用蒸馏水洗涤并用氮气吹干。

(2)缓冲液池的制作：缓冲液池的横截面为平行四边形，宽为5mm，长为34mm，长与宽之间的夹角为45度。由于对缓冲液池大小要求不是特别精确，在本实施例中采用金刚钻打孔即可。缓冲液池的高度为B片的厚度，即2mm。

(3)样品池、废液池和电化学检测池的制作：采用LAM66激光烧蚀机进行激光打孔。用铜箔制备光刻掩膜，精确确定所需打孔的位置。用紫外激光通过显微物镜和光刻掩膜，将激光能量聚焦在可光解的PMMA盖片上，选择激光频率为50Hz，对应的单位长度接受激光的脉冲设定为500脉冲/mm，在光刻掩膜所界定的区域内发生激光溅射，样品池与废液池为直径为1mm的圆孔，电化学检测池为直径为3mm的圆孔，储液池的高度均为B片的厚度，即2mm。

实施例3 A片与B片的封合以及电极的制作

采用热压法对A片与B片进行封合。具体制作过程为：

(1)将A片、B片超声清洗，自然晾干。

(2)将A片与B片在显微镜下精确对准，使工作电极与储液池边缘的距离为30μm左右。对准位置后，将基片与盖片用两块玻璃片固定夹紧放入烘箱，程序升温至108℃，保温2分钟，再程序降温至45℃即可。

(3)各电极的制作：缓冲液池1里面的用于提供高压的电极为Pt丝，长10mm，直径为0.5mm；样品池2以及废液池3的电极为长5mm，直径为0.5mm；检测池4为三电极工作体系，工作电极以银胶用铜丝引出，铜丝直径为0.5mm，长1cm，对电极为长5mm，直径为0.5mm，参比电极为自制的Ag/AgCl参比电极。Ag长度约为1.5cm，直径为0.5mm，通过电镀使之沉积上一层约300nm厚的AgCl，即得Ag/AgCl参比电极。

实施例4多通道微流控芯片制作实例2

1 A片的制作

A片为基片，其制作包括单晶硅阳模、分离进样微通道、工作电极的制作，具体制作过程为：

(1)掩膜的制作：采用CAD软件绘制图1所示的设计图，进样通道长度为4mm，4条工作电极通道长度分别为8、15、22、29mm，相邻两工作电极之间水平间距为8mm，分离通道长40mm，进样通道与分离通道的交点距分离通道右侧端点为35mm，进样通道与分离通道之间的夹角为30度。相邻两分离通道垂直间距为7mm，所有线宽均为100μm。将此设计图采用高清晰激光照排系统输出在透明的胶片上，即得光刻掩膜。

(2)单晶硅阳模的制作：在550～700℃通过化学气相沉积(CVD)在基片上沉积一层氮化硅薄膜作为牺牲层，在此基片上通过旋转覆膜技术覆一层SU-8光敏胶(正光胶)，于烘箱中60℃处理10min；将光刻掩膜覆盖在基片上，通过曝光成像的原理将光刻掩膜上的图形转移到基片表面的光胶层上；再通过干法腐蚀的方法将光胶层上的平面二维图形加工成具有一定深度的立体结构。即可得到具有凸起的通道的单晶硅阳模，通道的深与宽均为100μm。制作好的阳模依次用H₂O₂∶H₂SO₄溶液(体积比为1∶4)，丙酮和二次蒸馏水清洗，以除去表面的氧化物。

(3)采用原位引发聚合法复制PMMA基片上的微通道

经过划片后的硅模尺寸为4×8cm，将与硅模同样尺寸的PMMA基片(厚度0.5mm)超声洗净晾干，采用原位引发聚合复制微通道。通过一系列优化实验获得了光引发原位聚合的条件，建立了使用的甲基丙烯酸甲酯紫外光引发原位聚合制备微流控芯片技术。聚合溶液的配方为：单体甲基丙烯酸甲酯100ml，光热混合引发剂偶氮二异丁腈0.2g，光引发剂安息香0.2g和本体修饰剂如甲基丙烯酸1-2g。聚合条件为：热预聚温度80-90℃，预聚时间15-20min。将该混合物注入模具中，采用紫外光引发聚合。注模后光聚合条件为：温度20-35℃，紫外光波长356nm，功率20w，与紫外灯距离5-6cm，聚合时间约30-60min。由偶氮二异丁腈和安息香组成的复合快速光引发系统可以大大缩短光聚合时间，使用传统的光引发剂安息香甲醚需要4-6h，而热聚合需要8-10h，光聚合系统也可以采用日光引发聚合，因为是快速聚合，避免了紫外光过度照射芯片，防止了芯片发黄的问题。

(4)工作电极的制作

4条工作电极通道长度分别为8、15、22、29mm，电极通道为宽、深度均为100μm的电极沟槽，其轴向与分离通道垂直，向槽内小心地放入直径为50μm的碳纤维作为工作电极，用导电银胶将碳纤维固定，即完成工作电极的制作。

2 B片的制作

B片为盖片，其结构包括各种储液池孔，包括1个缓冲液池、4个样品池、4个废液池和4个独立的电化学检测池。具体制作过程为：

(1)B片的尺寸为4.0×8.0cm，在本实施例中选用厚度为3mm的PMMA。用蒸馏水洗涤盖片，并置于0.1mol/L的NaOH溶液中浸泡30min，再用蒸馏水洗涤并用氮气吹干。

(2)缓冲液池的制作：缓冲液池的横截面为平行四边形，宽为5mm，长为46mm，长与宽之间的夹角为30度。由于对缓冲液池大小要求不是特别精确，在本实施例中采用金刚钻打孔即可。缓冲液池的高度为B片的厚度，即3mm。缓冲液池距离盖片上下边缘的距离分别为7mm和10mm。

(3)样品池、废液池和电化学检测池的制作：采用LAM66激光烧蚀机进行激光打孔。用铜箔制备光刻掩膜，精确确定所需打孔的位置。用紫外激光通过显微物镜和光刻掩膜，将激光能量聚焦在可光解的PMMA盖片上，选择激光频率为50Hz，对应的单位长度接受激光的脉冲设定为800脉冲/mm，在光刻掩膜所界定的区域内发生激光溅射，样品池与废液池为直径为2mm的圆孔，电化学检测池为直径为5mm的圆孔。最右侧的电化学检测池圆心距离盖片右侧边缘为4.5mm，距离盖片上侧边缘距离为11mm。储液池的高度均为B片的厚度，即3mm。

3 A片与B片的封合以及电极的制作

采用热压法对A片与B片进行封合。具体制作过程为：

(1)将A片、B片超声清洗，自然晾干。

(2)将A片与B片在显微镜下精确对准，使工作电极与储液池边缘的距离为50μm左右。对准位置后，将基片与盖片用两块玻璃片固定夹紧放入烘箱，程序升温至108℃，保温2分钟，再程序降温至45℃即可。

(3)各电极的制作：缓冲液池1里面的用于提供高压的电极为Pt丝，直径为1mm，长45mm，其中插入缓冲液池部分长度为40mm；样品池2以及废液池3的电极为长2cm，直径为0.5mm；检测池4为三电极工作体系，工作电极以银胶用铜丝引出，铜丝直径为0.5mm，长2cm，对电极为长2cm，直径为0.5mm，参比电极为自制的Ag/AgCl参比电极。Ag长度约为1.5cm，直径为0.5mm，通过电镀使之沉积上一层约100nm厚的AgCl，即得Ag/AgCl参比电极。

实施例5多通道微流控芯片应用于海水中有机磷农药的高通量检测

(1)多通道微流控芯片的制作

按照实施例1、2、3的方法制作4通道微流控电化学检测芯片

(2)制备模拟磷酸酯水解酶

有机磷水解酶的催化活性中心是两个二价金属离子与四个组胺酸残基所组成的团簇。在天然磷酸酯水解酶中，金属离子是Zn²⁺，当Zn²⁺为其它二价金属离子如Co²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺所代替时，该团簇仍然对有机磷酸酯的水解具有催化作用。我们采用一系列的二价金属离子作为功能单体，以求得到催化性能最佳的分子印迹模拟磷酸酯水解酶，并将印迹聚合物修饰到通道内部。由于有机磷酸酯农药在模拟磷酸酯水解酶的催化作用下可以生成对硝基苯酚，可以用安培法进行检测。

采用标准方法制备模拟磷酸酯水解酶。即将功能单体在溶液中排列在印迹分子周围，交联干燥后将其研磨、破碎、筛分得到一定粒径的分子印迹介质，最后洗脱除去模板分子。典型的制备过程如下：将1mmol 4(5)乙烯基咪唑，4mmol二乙基(4-硝基苄基)磷酸酯(diethyl(4-nitrobenzyl)phosphonate，D4NP)，2mmolCoCl₂溶于250ml氯仿中。真空脱气5min后加入0.1mmol偶氮二异丁晴引发聚合，60℃水浴反应24h，得到蓝色聚合物。聚合物经机械研磨后，过筛。取粒径为25μm左右的粒状产物，用甲醇和乙酸抽提，除去D4NP，然后干燥，即得分子印迹模拟磷酸酯水解酶。

以催化活性(反应速度)、选择性等来描述印迹聚合物的催化性能。沿用对传统聚合物的表征方法，如通过吸附实验进行比表面积测定、孔容测定、孔径大小及其分布测定、孔形状测定等对分子印迹聚合物的结构表征。采用元素分析、重量分析、核磁共振等对分子印迹聚合物的化学成分分析。

(3)多通道微流控芯片的改性与修饰

PMMA芯片通道内部为憎水性，需要进行改性后方可将分子印迹模拟磷酸酯水解酶修饰到通道内部。

通过溶胶—凝胶法将模拟磷酸酯水解酶修饰到通道内部，可以大幅度提高催化的比表面积，可以极大的提高催化效率。

(4)采用电化学法进行检测

首先，将4通道芯片上三电极的引出线连接到电化学工作站(CHI1030，上海辰华仪器公司)的相应的工作电极，对电极和参比电极连接线端口。

其次，将微流控芯片高压电源(CDY-500L，山东省化工研究院仪器仪表研究所)的加电压接线分别连接各储液池。

再次，将电化学分析仪的方法设置与参数设置按照实际需要进行设定：方法设定为安培检测(amperometric i-t curve)，sampling time设定为300s，检测电位设为0.9V(vs.Ag/AgCl)，灵敏度设为1×10^-6A。将微流控芯片高压电源的电压施加方式在程序中进行设定。进样电压设为300V，进样时间为20s；分离电压设为300V，施加高压时间为240s。

最后，采用真空泵将各分离、进样微通道充满溶液，将微流控芯片通道依次用0.1MHCl、二次蒸馏水、0.1MNaOH、二次蒸馏水、缓冲液清洗。在缓冲液池1中加入20mmol/L的硼砂-NaOH缓冲液(pH为9.6)，在样品池2中加入有机磷农药对氧磷标准溶液(或实际样品，即经0.22μm滤膜过滤的海水)，在废液池3中加入20mmol/L的硼砂-NaOH缓冲液(pH为9.6)，施加进样高压，标准(样品)溶液即充满进样通道5，当启动缓冲液池1与检测池4之间的高压时，分离通道与进样通道交叉口的标准(样品)溶液即被带入分离通道，开启已设定的电化学工作站程序，通过对有机磷农药水解产物对硝基苯酚的检测，即可对样品中的有机磷农药进行定量测定。在样品池2中加入不同浓度的有机磷农药对氧磷标准溶液，测定对氧磷水解产物对硝基苯酚氧化峰的峰电流，即可建立峰电流与有机磷农药的浓度所对应的线性相关关系。在所设定的条件下，对硝基苯酚的出峰时间为52s左右，测定结果表明，不同通道之间检测结果相对标准偏差小于10％(n＝3)，同一通道3次测定结果相对标准偏差小于5％。进样1×10^-5mmol/L对氧磷，4通道得到的平均浓度为9.6×10^-6mmol/L，相对偏差为4％。以上结果表明，本发明所研制的多通道微流控电化学芯片可以成功的应用于实际样品的高效、快速测定。

Claims (10)

1.一种多通道微流控芯片，其特征在于，该芯片缓冲液池伸出若干分离通道，每条分离通道上，各有一个样品池、检测池、进样通道和电极通道以及电极通道中的电极，检测池在分离通道的另一端；样品池通过进样通道与分离通道相通；电极通道一端与外接电源相通，另一端靠近检测池。

2.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片的分离通道、进样通道、电极通道的高度为25～100微米，宽度为25～100微米，分离通道的长度为40～80毫米；进样通道长度1～5毫米，进样通道与分离通道的交点到分离通道远端端点间的距离为35～75毫米。

3.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片的电极通道与检测池边缘的距离为25-50微米。

4.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片样品池的直径为1～3毫米，检测池的直径为3～6毫米，各检测池圆心之间的距离为8～15毫米。

5.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片的各分离通道之间平行，相邻两分离通道之间距离为7～20毫米；该微流控芯片的各电极通道之间平行，相邻两电极通道之间距离为7～20毫米。

6.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片的进样通道与分离通道夹角为30～90度。

7.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片的每条检测通道上还有一个废液池，废液池通过另一段进样通道与分离通道相通，废液池的直径为1～3毫米。

8.如权利要求1所示的微流控芯片，其特征在于，它以聚甲基丙烯酸甲酯为材质。

9.一种如权利要求1所述多通道微流控芯片的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)用热压法或者原位聚合法在基片上制作分离通道、进样通道和电极通道，并在电极通道内填充功能碳糊材料作为工作电极；

(2)在盖片上通过金刚钻打孔制作缓冲液池，通过激光打孔制作样品池、检测池、废液池；

(3)封合基片与盖片。

10.一种如权利要求1所述的多通道微流控芯片的应用，其特征在于，将多通道微流控芯片与控制设备相连接，加入缓冲液与样品，控制电压完成待测组分的分离、分析和检测。

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