CN104419685A - 人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体。由保藏号为CGMCC No.7459的小鼠杂交瘤细胞产生。本发明还提供所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。所述单克隆抗体可用于检测转基因牛奶与奶粉中的人α-乳清白蛋白。本发明的人α-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，直接对外源表达蛋白进行检测，避免了基因提取费时费力且容易污染的问题；本发明检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。

Description

人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备与应用，尤其涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

α-乳清白蛋白（α-LA）是分子量小、酸性的、高亲和性的Ca²⁺结合蛋白。它几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中。人α-乳清白蛋白的分子量为14.1KD。α-乳清白蛋白是人乳中的重要组成成分，约占总蛋白含量的25-35%，而在牛奶中只占总蛋白含量的2-5%。α-乳清白蛋白可与Ca²⁺、Zn²⁺等多种二价阳离子结合，能促进微量元素的吸收。在乳腺分泌细胞中，α-乳清白蛋白作为调节亚基通过与半乳糖苷转移酶相互作用催化乳糖的合成。最近还发现人α-乳清白蛋白的不同折叠突变体具有杀菌和诱导肿瘤细胞死亡的功能，还能与油酸形成复合物杀死皮肤的乳突淋瘤，具有广阔的应用前景。

由于α-乳清白蛋白具有如此重要的功能，人α-乳清白蛋白可以被开发成婴幼儿食品，保健品，运动饮料以及抗菌、抗肿瘤药物等。据FAO预测，全球每年婴幼儿食品市场为58亿美元，人α-乳清白蛋白已成为这些产品的重要成分，加上其它产品开发，人α-乳清白蛋白的市场前景非常巨大。但是目前市场上供应的α-乳清白蛋白主要是从牛奶中纯化的牛α-乳清白蛋白，不过由于牛α-乳清白蛋白在牛乳中含量低（1.2g/L），纯化工艺复杂，而且成本偏高，生产的α-乳清白蛋白无法满足市场需求。更重要的是，牛α-乳清白蛋白并不具备人α-乳清白蛋白的一些营养价值和重要功能，因此人α-乳清白蛋白具有广阔的开发应用前景。但是由于来源有限，限制了人α-乳清白蛋白作为药用蛋白和保健品的使用，因此人们开始利用转基因动物即动物乳腺生物反应高效表达重组人α-乳清白蛋白。

同时，与转基因相伴而生的生物安全问题引起了公众和管理部门的强烈关注和重视。建立精准、快速的检测技术并科学、系统地进行生物安全评价，可防止转基因动物或产品在研究、生产、销售时发生扩散、污染等安全隐患进行检测和监测技术储备和支撑。这不仅是维护消费者知情权和在国际贸易中维护国家利益的必要手段，也是我国履行国际义务、维护国家形象的重要保障。

乳铁蛋白的检测方法有很多，其中ELISA检测法以其快速、准确、灵敏且一次能处理多个样而倍受关注。目前国内外用于ELISA检测的抗体为多克隆抗体，而以单克隆抗体为基础建立起的免疫学检测试剂盒很少。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一株能分泌产生所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

杂交瘤细胞ZZY hLY7E1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC No.7459。

本发明还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体，其由所述杂交瘤细胞株分泌获得。

本发明还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法，用重组蛋白α-LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗α-LA的5株细胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1。取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好）注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得人α-乳清白蛋白单克隆抗体。

经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞7E1效价最高。7E1细胞亚型为IgG1。7E1细胞能与免疫原α-LA反应，不与筛选原牛乳铁蛋白（bLA）反应。用细胞7E1制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。

本发明还提供前述人α-乳清白蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白中的应用。

所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人α-乳清白蛋白。Western Blot检测显示抗体7E1只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。

本发明还提供前述人α-乳清白蛋白单克隆抗体在制备用于检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白试剂盒中的应用。

所述人α-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：

1）洗涤液；

2）底物显色液；

3）反应终止液；

4）人α-乳清白蛋白标准品。

所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H₂SO₄。

本发明的有益效果：本发明的人α-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测，同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。

附图说明

图1为免疫抗原（6his-MBP-CCG343）及检测抗原(PGEX-6P-1-CCG343)的表达纯化；

其中，1a：6his-MBP-CCG343样品；1b：6his-MBP-CCG343穿柱液；1c：6his-MBP-CCG343洗脱1；1d：6his-MBP-CCG343洗脱2；2a：PGEX-6P-1-CCG343样品；2b：PGEX-6P-1-CCG343穿柱；2c：PGEX-6P-1-CCG343洗脱1；2d：PGEX-6P-1-CCG343洗脱2；

图2为实施例2Western-blot检测结果图；

其中，1为PGEX-6P-1-CCG343；2为6his-MBP-CCG343；

图3为杂交瘤细胞上清与样品Wester-blot试验结果；

其中，3：转人乳铁蛋白基因奶牛牛奶样品；5：牛乳清白蛋白；4：转人α-乳清白蛋白基因奶粉样品；

图4为转基因牛奶及奶粉样品Western Blot检测；

其中，1：转人α-乳清白蛋白基因牛奶样品；2：转人α-乳清白蛋白基因奶粉样品；3：三元极致牛奶样品；4：人α-乳清白蛋白；5：牛α-乳清白蛋白；6：三元极致牛奶样品；

图5为转基因牛奶样品的检测标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

转人α-乳清白蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室；单克隆抗体和多克隆抗体由中国检验检疫科学研究院动检实验室构建；日本大耳白兔购自军事医学科学研究院实验动物中心；人α-乳清白蛋白购自Sigma公司。

酶标板购自宏捷成生物公司；HRP标记试剂盒（CatNo31488）购自Pierce公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB（可溶型）购自天根生物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司；IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司，石蜡油购自BBI公司。

层析柱购自Phamacia公司；涡旋仪购自江苏海门市其林贝尔公司；高速微量离心机购自美国Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适性恒温仪购自eppendorf公司；台式冷冻离心机、真空浓缩仪购自eppendorf公司；电热恒温水浴锅购自PolyScience公司；NanoDrop1000紫外/可见分光光度计购自NanoDrop公司；恒温鼓风干燥箱、摇床购自中国智成公司；紫外凝胶成像系统购自UVP公司；PYY-6C型稳压稳流电泳仪、DYCP-31C微型水平电泳槽购自北京六一厂；高压灭菌锅、-80℃冰箱购自日本三洋公司；混合型球磨仪购自Retsch公司；酶标仪，BIO-RAD。

转基因牛奶、奶粉样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，非转基因牛奶及脱脂奶粉购自超市。

实施例1原核表达人α-乳清白蛋白

1、委托宝生物工程（大连）有限公司合成429bp的人α-乳清白蛋白基因连接到pMBP和pGEX-6P-1载体，分别命名为6his-MBP-CCG343和pGEX-6P-1-CCG343，表达并纯化两种蛋白，其中6his-MBP-CCG343为制备单克隆抗体的免疫抗原，PGEX-6P-1-CCG343为制备单克隆抗体的检测抗原，蛋白纯化见图1。其中洗脱1+洗脱2作为免疫抗原，共10mL（0.8mg/ml），洗脱1+洗脱3作为检测抗原共4mL（0.7mg/ml）。

实施例2制备人乳清白蛋白多克隆抗体，并对原核表达的两种蛋白进行验证

1、兔免疫血清的制备

选择同一批次健康的雌性日本大耳白兔4只，随机分为2组，实验组和对照组，实验组3只免疫hLA（sigma），对照组1只用PBS缓冲液代替hLA免疫，每只兔子皮下注射总量为2mL用佐剂乳化好的抗原，每只兔子5mg，在第3次加强免疫，每只兔子5mg，后7天，耳静脉采血，检测血清中抗体滴度（间接ELISA法），如滴度未达到1:10⁴，OD1.0以上，则再加强免疫。在抗体滴度已达到1:10⁴后的第10天，心脏采集兔血，分离血清，-20℃保存备用。

2、多克隆抗体的提取

采用IgG的纯化提取试剂盒，按说明书提取血清中的IgG，具体操作如下：

（1）10mL平衡缓冲液平衡柱子，流速为1mL/min；

（2）1mL注射器将抗体推入纯化柱中上样；

（3）10mL的结合缓冲液冲洗柱子，流出的液体收集在EP管中；

（4）4mL洗脱液进行洗脱，每mL洗脱蛋白加0.1mL中和缓冲液。

（5）收集的液体用考马斯亮蓝测定浓度，-20℃储存备用。

纯化结果通过考马斯亮蓝验证，洗脱管2和洗脱管3能满足要求，浓度约为2mg/mL。

3、多克隆抗体与原核表达载体Western-blot试验

选择1号管和2号管的兔血清分别与PGEX-6P-1-CCG343和6his-MBP-CCG343进行Western-blot试验，结果在相应位置均有目的条带，见图2。

由于多克隆抗体的免疫抗原与原核表达的抗原来源不同，前者来源于人奶（产品编号L7269|CAS号9051-29-0|Sigma）此结果证实表达的抗原具有结合相应抗体的能力，可用于制备单克隆抗体，前期工作中也尝试使用编号为L7269的抗原制备单克隆抗体，但结果未筛选到特异性的单克隆抗体，所以后期使用原核表达的抗原制备单克隆抗体。

实施例3单克隆抗体抗体的制备

1、小鼠抗体的制备

选择6周龄同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作为实验动物，随机分为2组，实验组5只（1#、2#、3#、4#、5#小鼠），对照组2只。实验组用6his-MBP-CCG343作为免疫原进行免疫，用PBS缓冲液代替hLA进行免疫作为阴性对照。每只小鼠皮下注射总量为100μL用佐剂乳化好的抗原（250μLPBS溶解1mg抗原后与250μL弗氏不完全佐剂混合，共500μL，每只小鼠注射100μL）。第一次基础免疫剂量为每只小鼠200μg，加强免疫免疫剂量为每只小鼠200μg，基础免疫时使用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用弗氏不完全佐剂乳化。基础免疫后间隔10天进行加强免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加强免疫后7天，尾静脉采血，检测血清中抗体滴度（间接ELISA法），如滴度未达到1:10⁴，OD1.0以上，则再加强免疫。在抗体滴度达到1:10⁴后的第10天眼眶采血，分离血清，-20℃保存备用。

2、间接ELISA法检测免疫小鼠的抗体水平

以PGEX-6P-1-CCG343作为包被抗原，包被浓度：10μg/mL，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000；对照组血清1:3000稀释。

hLA间接ELISA法测定的基本操作步骤如下：

（1）包被：将PGEX-6P-1-CCG343用包被液（磷酸缓冲液pH9.6）稀释至10μg/mL，用微量加样器吸取稀释后的抗原加入96孔酶标板，100μL/孔，置4℃冰箱过夜。

（2）洗涤：取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入PBST洗涤液，300μL/孔，静置1min，重复操作3～5次。

（3）封闭：用微量加样器按200μL/孔加1%BSA，放入37℃温箱2h。

（4）洗涤：同步骤2）。

（5）加待检样本：用PBS缓冲液将血清稀释，血清稀释倍数依次为：1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600；放入37℃温箱1h；

（6）洗涤：同步骤2）。

（7）加酶标抗体：用PBST洗涤液将HRP标记的山羊抗小鼠二抗稀释到工作浓度1:5000，每孔加100μL，37℃温箱孵育45min。

（8）洗涤：同步骤2）。

（9）加底物溶液：避光按100μL/孔加入TMB底物溶液，室温孵育15min。

（10）终止反应：室温下加终止液50μL/孔，终止反应。

（11）测OD450值：检测450nm波长下的OD值，检测结果见表1。

表1.经三次免疫后小鼠血清效价的测定结果

	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800	1:25600	PBS
									1#	2.500	2.569	2.346	2.285	2.101	1.783	1.438	0.076
2#	1.959	1.620	1.336	1.121	0.748	0.571	0.314	0.068
									3#	2.479	2.518	2.328	2.298	2.024	1.594	1.256	0.066
4#	2.396	1.947	1.511	1.272	0.997	0.675	0.525	0.070
									5#	2.533	2.627	2.408	2.479	2.444	2.181	1.873	0.069

结果显示，1#、2#、3#、4#、5#小鼠均已达到融合标准，取5#小鼠终加强免疫。

3、阳性杂交瘤细胞株亚克隆及建株

采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显微镜视野1/3时吸取上清进行筛选，方法同hLA酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法，待亚克隆阳性率达到100%时，正式建株得5株细胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1，每株细胞冻存5支以上。以上5株进行交叉ELSIA检测（24孔板上清），结果及说明5株细胞均能结合免疫抗原和检测抗原（见表2）。

表25株细胞株交叉ELISA检测结果

4、杂交瘤细胞上清与样品Wester-blot试验

抽取2株ELSIA较高的杂交瘤细胞上清与转人乳铁蛋白基因奶牛牛奶、牛乳清白蛋白、转人α-乳清白蛋白基因奶粉（浓度为5%）3种样品进行Wester-blot试验，Western Blot检测的基本操作步骤如下:

（1）电泳：上样20μL，Marker4μl；先90V，后150V。

（2）转膜：0.45μm孔径的NC膜，湿转，50mA恒流转膜50分钟。

（3）封闭：用Western Blot封闭液（1%BSA-TBST），室温封闭30min。

（4）孵育一抗：血清稀释液（1%BSA-TBST）（1:1000），室温孵育30min后，放于4℃过夜。

（5）洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

（6）孵育二抗：加山羊抗兔IgG，1:10000稀释，室温孵育40min。

（7）洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

（8）显色、曝光：ECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒。

WB检测结果显示，两株杂交瘤细胞上清只能与转人α-乳清白蛋白基因奶粉有特异性条带，与转人乳铁蛋白基因奶牛牛奶、牛乳清白蛋白无反应，说明这两株细胞的特异性较好（见图3）。用牛-α乳清白蛋白（bLA）进行筛选，结果只有7E1细胞株不与其反应，选取7E1进行腹水生产，并纯化单克隆抗体。

实施例4hLA单克隆抗体的应用

取转基因牛奶、奶粉及非转基因牛奶及奶粉进行Western Blot检测。奶粉浓度：5%（每100ml溶液中所含奶粉为5g），上样量均为20μl。步骤同hLA Western Blot检测。

样品检测结果显示，抗体7E1只与人α-乳清白蛋白、转人α-乳清白蛋白基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及牛α-乳清白蛋白反应，见图4。

实施例5双抗体夹心ELISA检测

1、7E1单克隆抗体和兔多克隆抗体效价检测

（1）包被：hLA和bLA，2μg/mL，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。

（2）抗体：第一列1:1000，往后1：3倍比稀释，最后一列为PBS，37℃，30min。

（3）二抗：山羊抗小鼠（兔）IgG-HRP，1:5000，37℃，20min。

（4）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色10min。

（5）终止：加入终止液（2M H2SO4）50μL/孔。

（6）读数：以450nm单波长测定各孔OD值。

结果显示，单抗与bLA无交叉，抗体效价为1:81000；多抗与bLA及hLA均有反应，效价均为1:81000，与bLA反应性略弱，见表3。

表37E1单克隆抗体和兔多克隆抗体效价检测结果

2、单克隆抗体HRP标记及使用浓度确定

严格按照产品说明书进行操作，具体参见Pierce（CatNo31488）产品说明。

HRP标记抗体按不同的稀释进行效价检测，选择OD值为2.0左右的点作为抗体的稀释度。单克隆抗体-HRP按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释，PBS作为空白对照。

酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法检测步骤：

（1）包被：hLA，2μg/mL，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。

（2）封闭：加150μL/孔封闭液，37℃、2小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。

（3）加待测样品：

HRP标记抗体，第一个孔1:500稀释（1%BSA），往下以1:2的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

（4）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色10min。

（5）终止：加入终止液（2M H₂SO₄）50μL/孔。

（6）读数：以450nm单波长测定各孔OD值。

抗体-HRP效价检测结果显示，1:500稀释时，OD值为1.917，且倍比稀释后OD值明显变小，所以选择1:500作为后续实验的检测。结果见表4。

表4抗体-HRP效价检测结果

单抗-HRP稀释度	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000	1:16000	1:32000	PBS
									7E1-HRP	1.917	1.401	0.688	0.166	0.077	0.063	0.042	0.040

3、兔多抗包被条件的确定

多抗按不同浓度包被后，检测最佳包被浓度。

ELISA配对检测步骤：

（1）包被：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312μg/mL的兔多抗，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。

（2）抗原：终浓度1ug/ml，PBS作为阴性对照，37℃，1h；

（3）加二抗：小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500稀释，100μL/孔，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

（4）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色15-30min。

（5）终止：加入终止液（2M H₂SO₄）50μL/孔。

（6）读数：以450nm单波长测定各孔OD值。

结果显示，免疫抗原及筛选抗原明显可区分，当多抗包被浓度为20ug/ml时，OD值接近2.0，且倍比稀释后明显变小，所以选择20ug/ml作为包被浓度点，见表5。

表5多抗包被浓度检测结果

多抗梯度包被ug/ml	20	10	5	2.5	1.25	0.625	0.312	0
									B-Lac	0.207	0.192	0.188	0.162	0.175	0.183	0.167	0.098
H-Lac	1.734	1.316	1.012	0.655	0.456	0.261	0.250	0.045
									PBS	0.076	0.068	0.085	0.105	0.140	0.079	0.094	0.101

实施例6人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒的组建

1、本实施例提供一种用于人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测的试剂盒，其组成如下：

（1）包被多克隆抗体的酶标板；

（2）辣根过氧化物酶标记抗体；

（3）洗涤液PBST；

（4）底物显色液TMB；

（5）反应终止液2M H₂SO₄

（6）人α-乳清白蛋白标准品

2、包被多克隆抗体的酶标板的制备：

（1）包被：将兔多抗用磷酸缓冲液（pH9.6）包被液稀释至20μg/mL，用微量加样器吸取稀释后的多抗加入96孔酶标板，100μL/孔，置4℃冰箱过夜；

（2）洗涤：取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入PBST洗涤液，300μL/孔，静置1min，重复操作3～5次；

（3）封闭：用微量加样器按200μL/孔加1%BSA，放入37℃温箱2h；

（4）洗涤：同步骤2），置4℃冰箱保存备用。

实施例8人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒用于检测人α-乳清白蛋白

1、hLA标准品的检测灵敏度

hLA标准品原始浓度2mg/mL，分别按照1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀释（标准品稀释液是PBS缓冲液），PBS作为阴性对照。ELISA检测方法同实施例5步骤3，检测结果见表6。

表6针对hLF标准品灵敏度检测结果

稀释倍数	1:1	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1：128	PBS
										hLA浓度（ng/mL）	2000	1000	500	250	125	62.5	31.25	15.6	0
OD复孔1	1.293	1.303	0.877	0.468	0.375	0.258	0.266	0.246	0.179
										OD复孔2	1.385	1.345	0.826	0.479	0.368	0.254	0.236	0.186	0.196

结果显示，免疫抗原稀释至1:8时，P/N＞2.1，因此检测限为250ng/mL。

2、牛奶样品的检测灵敏度

转基因牛奶与非转基因牛奶混合，得到含转基因成分为50%、20%、10%、5%、1%、0.1%、0.05%的模拟样品，非转基因牛奶作为阴性对照。ELISA配对检测方法同实施例5步骤3，检测结果见表7。

表7针对牛奶模拟样品灵敏度检测结果

结果显示，模拟样品含转基因成分为5%时，P/N＞2.1，因此检测限为5%。标准曲线在5%～50%范围内线性良好，标准曲线见图5。

3、奶粉样品的检测灵敏度

转基因奶粉与非转基因奶粉混合，得到含转基因成分为100%、50%、20%、10%、5%、1%、0.1%、0.05%的模拟样品，非转基因奶粉作为阴性对照。ELISA配对检测方法同实施例5步骤3。（样品稀释液是非转基因奶粉）

结果显示，模拟样品含转基因成分为5%时，P/N＞2.1，因此检测限为5%，见表8。

表8针对牛奶模拟样品灵敏度检测结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC NO.7459。

2.人α-乳清白蛋白单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌获得。

3.权利要求2所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用重组蛋白α-LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗α-LA的杂交瘤细胞，注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化即得。

4.权利要求2所述的人α-乳清白蛋白单克隆抗体在制备用于检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述的人α-乳清白蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白中的应用。