CN104403002A - 乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)单克隆抗体。该抗体能够特异性识别Na₂-EDTA，及其螯合了Ca²⁺，Mg²⁺后的螯合物Ca-EDTA和Mg-EDTA，可用于从细胞蛋白质的角度深入探索Na₂-EDTA的可能生物效应。所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2014130的杂交瘤细胞株特异稳定分泌产生。

Description

乙二胺四乙酸二钠单克隆抗体

技术领域

该发明属生物技术领域。利用此单克隆抗体能特异性识别Na₂-EDTA及其螯合了Ca²⁺，Mg²⁺后的螯合物Ca-EDTA和Mg-EDTA的能力，应用于体外细胞实验及体内动物实验的Na₂-EDTA的生物效应研究。为研究Na₂-EDTA的生物效应提供了一种新的途径。 

背景技术

乙二胺四乙酸(EDTA)是一种有机化合物，不溶于冷水、醇及一般有机溶剂，微溶于热水，可溶于碱性溶液。钠盐的溶解度在22℃为10.8g/L，80℃为23.6g/L。一般用乙二胺四乙酸的钠盐(Na₂-EDTA)代替EDTA。Na₂-EDTA可以与大多数金属离子形成多个五环结构的比较稳定的螯合物，因此在工业、食品及医疗领域被广泛应用。但Na₂-EDTA几乎不可被生物降解，并且不能被沉淀吸附，因此在水体系统中成为持久性污染物。因其Ca²⁺螯合特性，Na₂-EDTA在口腔领域已成为常规试剂。Na₂-EDTA在水体系统的富集及其在医疗领域，尤其是口腔医学中的应用，都导致机体极易受到Na₂-EDTA的影响。深入了解Na₂-EDTA的生物效应是有必要的。已有多位学者从血管渗透性、细胞毒性、巨噬细胞功能和动物实验等方面证实了Na₂-EDTA的不良影响。目前认为其机制是Na₂-EDTA的金属螯合作用使金属蛋白和金属蛋白酶失去金属辅助因子，间接导致蛋白质活力的丧失。Na₂-EDTA的生物效应除了其突出的螯合作用，目前尚不知是否还存在其他机理，也未见相关文献报道。 

发明内容

本发明提供了抗Na₂-EDTA单克隆抗体，该抗体能够特异性识别Na₂-EDTA及其螯合了Ca²⁺，Mg²⁺后的螯合物Ca-EDTA和Mg-EDTA，可用于从细胞蛋白质的角度深入探索Na₂-EDTA的可能生物效应。所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2014130的杂交瘤细胞株4G1A6B4特异稳定分泌产生。 

保藏号为CCTCC NO:C2014130的杂交瘤细胞株4G1A6B4于2014年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，其地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO:C2014130。 

Na₂-EDTA间接竞争ELISA结果显示：该单克隆抗体能特异性识别Na₂-EDTA。 

抗体特异性鉴别实验显示：该单克隆抗体能特异性识别Ca-EDTA和Mg-EDTA，而对Fe-EDTA，Cu-EDTA，Zn-EDTA和Mn-EDTA的识别能力较差。可 能是因为抗体针对Na₂-EDTA的空间结构，Na₂-EDTA螯合了原子半径相对较小的Ca²⁺，Mg²⁺后空间结构变形小，抗体仍能识别，Na₂-EDTA螯合了原子半径较大的Fe²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺后空间结构变形大，导致单克隆抗体不能识别。 

hPDLF的western blotting结果显示：与Na₂-EDTA或Ca-EDTA共培养后的hPDLF与正常培养的hPDLF之间出现差异蛋白。说明hPDLF存在与Na₂-EDTA和Ca-EDTA直接发生作用的特定蛋白。 

因此，首先，本发明提供了能特异性识别Na₂-EDTA，Ca-EDTA和Mg-EDTA的单克隆抗体。 

其次，本发明提供了所述单克隆抗体用于从蛋白质角度探索Na₂-EDTA和Ca-EDTA在hPDLF的生物效应。 

再次，本发明提供了所述单克隆抗体可用于提纯上述发现的差异蛋白，进行蛋白特征检测。 

最后，本发明提供了所述单克隆抗体可用于从蛋白质角度探索其他细胞和组织与Na₂-EDTA，Ca-EDTA和Mg-EDTA之间的相互作用关系 

此外，本发明还提供了特异稳定分泌所述单克隆抗体的保藏号为CCTCC NO:C2014130的杂交瘤细胞株Na₂-EDTA 4G1A6B4。 

本发明筛选出了一株特异性强，稳定高效分泌具有抗Na₂-EDTA生物学活性的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体能特异性识别Na₂-EDTA及其螯合了Ca²⁺，Mg²⁺后的螯合物Ca-EDTA和Mg-EDTA，应用于Na₂-EDTA的生物效应研究，为研究Na₂-EDTA干扰组织和细胞的机制提供了一种新的手段和方法。 

本发明采取了以下主要解决的关键技术： 

本发明已成功建立的一株特异性强，稳定高效分泌具有抗Na2-EDTA生物学活性的杂交瘤细胞株，体内法制备了腹水抗体，通过亲和层析法获得高纯度抗体，应用于从细胞蛋白质的角度深入探索Na₂-EDTA的可能生物效应。 

技术路线： 

1.选择本研究选择了EDTA的衍生物，ITCBE作为抗原，通过其异硫氰苄基末端的氨基连接到载体蛋白质上，制得免疫原ITCBE-BSA，免疫BALB/C小鼠； 

2.在PEG 4000的作用下将免疫后获得的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合； 

3.反复采用ELISA进行筛选，用有限稀释法亚克隆获得单克隆细胞株，建立特异稳定表达抗Na₂-EDTA的杂交瘤细胞株； 

4.大量扩增，接种小鼠腹腔，制备腹水； 

5.收集腹水，进行ELISA效价检测、抗体亚类鉴别、抗体特异性检测、 亲和常数测定等。 

利用以上技术路线1-5，本发明申请人筛选出了特异、高效、稳定分泌小鼠抗Na₂-EDTA抗体的杂交瘤细胞株Na₂-EDTA 4G1A6B4，其保藏号为CCTCC NO:C2014130。 

6.采用组织块法培养了原代人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)，并根据MTT法筛选对hPDLF适宜的Na₂-EDTA干预浓度。在此浓度下，hPDLF与Na₂-EDTA或Ca-EDTA共培养后，采用上述制备的单克隆抗体通过western blotting检测hPDLF是否存在与Na₂-EDTA或者Na₂-EDTA的其他金属螯合物直接发生作用的特定蛋白。 

根据技术路线6发现与Na₂-EDTA或Ca-EDTA共培养后的hPDLF与正常培养的hPDLF之间出现差异蛋白。说明hPDLF存在与Na₂-EDTA和Ca-EDTA直接发生作用的特定蛋白。 

7.拟利用抗原抗体结合，通过此抗体进一步提纯此蛋白，进行蛋白特征鉴定，从细胞蛋白质的角度深入探索Na₂-EDTA对hPDLF可能的生物效应。 

8.拟进一步选择多种细胞探索是否存在与Na₂-EDTA直接发生作用的特定蛋白。 

9.拟采用动物实验探索组织与Na₂-EDTA的关系，进一步阐明Na₂-EDTA可能的干扰组织的机制，为人类健康作出应有的贡献。 

附图说明

图1.Na₂-EDTA间接竞争ELISA的标准曲线 

图2.Na₂-EDTA McAb与其他金属螯合物的交叉反应 

图3.非竞争ELISA法检测Na₂-EDTA McAb亲和常数 

图4.hPDLF的western blotting 

具体实施方式

本发明由以下实施例来例证，但应当注意的是，以下实施例仅用于例证和解释本发明，而不是对本发明保护范围的限制。 

实施例1制备抗Na₂-EDTA的单克隆抗体 

以EDTA(乙二胺四乙酸)的衍生物，ITCBE(1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸,Dojindo Laboratories，Japan)作为抗原，通过其异硫氰苄基末端的氨基连接到载体蛋白质BSA(牛血清白蛋白,Ameresco，USA)上，制得免疫原ITCBE-BSA。根据常规方法经皮下多点免疫BALB/c小鼠(购于四川大学华西实验动物中心)，间接ELISA筛选抗体滴度最高的小鼠。间接ELISA的操作如下：(1)抗原包被：用包被缓冲液稀释ITCBE-OVA至100ng/mL，加入96孔酶标板中，100μL/孔，对照板用抗原OVA，操作同上，4℃过夜；(2)封闭：PBST洗板3min×3次，拍干，加入浓度为1％的酪蛋白，150μL/ 孔，37℃孵育1h；(3)加入血清：弃酪蛋白液，拍干，以1：100稀释后的血清开始4倍梯度稀释，然后加入96孔板，100μL/孔，37℃孵育2h；(4)加二抗：PBST洗板3min×3次，拍干，加入稀释比例为1:5000的HRP-山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；(5)显色：PBST洗板3min×3次，拍干，加入现配的TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育15min；(6)终止：加入1mol/L H2SO4终止液，100μL/孔；(7)检测：调整酶标仪波长为450nm，检测吸光度值(OD450nm)。细胞融合前3天，对血清效价达到1:10万的小鼠进行加强免疫，用PBS稀释抗原ITCBE-BSA后直接腹腔注射，剂量100μg，体积为500μL。3日后取脾细胞与SP2/0(SP2/0-Ag14，小鼠骨髓瘤细胞，由四川大学基础与法医学院免疫教研室提供)经PEG 4000(聚乙二醇，Merck，USA)进行融合。采用间接竞争ELISA和有限稀释法亚克隆，获得能高效、稳定分泌特异性抗Na₂-EDTA的杂交瘤细胞株。间接竞争ELISA的操作如下：(1)抗原包被：用CB稀释ITCBE-OVA 100ng/mL，加入96孔酶标板中，100μL/孔，对照板和实验板操作相同，4℃过夜；(2)封闭：PBST洗板3min×3次，拍干，加入浓度为1％的酪蛋白，150μL/孔，37℃孵育1h；(3)加竞争物：实验板每孔加入竞争物10μg/mL EDTA，50μL/孔，对照板每孔加入PBS，50μL/孔；(4)加入细胞上清：弃酪蛋白液，拍干，杂交瘤细胞上清液分别加入实验板和对照板，50μL/孔，37℃孵育45-60min；(5)加二抗：PBST洗板3min×3次，拍干，加入稀释比例为1:5000的HRP-山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；(6)显色：PBST洗板3min×3次，拍干，加入现配的TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育15min；(7)终止：加入1mol/L H2SO4终止液，100μL/孔，测OD450nm。(8)结果判读：选择实验板(加竞争物EDTA)OD450nm低，对照板(加PBS)OD450nm高的检测孔判定为阳性克隆。采用有限稀释法进行亚克隆。收集筛选到的阳性克隆孔里的杂交瘤细胞并计数，用RPMI-1640调整细胞浓度至100个/10mL，加入96孔板，100μL/孔，再补液100μL/孔，37℃，5％CO2饱和湿度培养。10-12天后再次采用间接竞争ELISA方法筛选。亚克隆与筛选反复进行直到细胞群落为单克隆并且检测的阳性率为100％为止。 

根据检测结果，确定以4G1A6B4建株，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2014130。 

将该杂交瘤细胞经扩增后接种于已预先用液体石蜡致敏7天的经产BALB/C小鼠腹腔，10～14天后收集小鼠腹水用于后续试验研究。 

采用饱和硫酸铵盐析初步纯化腹水抗体。(1)取20mL腹水与20mL生理盐水混合，加入40mL饱和硫酸铵溶液，4℃过夜；(2)12000rpm 4℃低温离心20min，弃上清，20mL生理盐水溶解沉淀，边搅拌边加入5mL饱和硫 酸铵溶液，4℃静置20min，12000rpm 4℃低温离心20min，弃上清；(3)重复(2)2次；(4)最后用少许生理盐水溶解沉淀物，0.01mol/L，pH 7.4PBS透析过夜，至钠氏试纸检测无NH4⁺。纯化后初步测抗体蛋白浓度。 

采用双抗体夹心ELISA法检测抗体亚类。根据抗体亚类鉴别结果为IgG1，采用HiTrap^TM Protein G HP亲和层析柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典)进一步高度纯化抗体。(1)过滤抗体：将上述初纯后的抗体用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液以1：5的比例稀释，再用0.22μm的滤膜过滤；(2)平衡柱床：PBS缓冲液平衡亲和层析柱(柱床体积为5ml)，流速1ml/min，体积大于10倍柱床体积(约50mL)；(3)上样：将上述抗体溶液以0.5ml/min的流速通过亲和层析微球柱。收集流穿液，连续上柱2次；(4)洗涤：用10倍柱床体积(约50mL)的0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液洗涤微球；(5)洗脱：用0.1mol/L pH 2.8甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱微球柱。以1ml/min流速分次加入，每次约1/2柱床体积(2.5ml)，分管收集(每管1ml)。收集液立即用1mol/L pH 9.0Tris-HCl缓冲液调节pH值至7.0左右。洗脱至考马斯亮蓝G250染液检测无蛋白为止；(6)纯化后抗体处理：用0.01mol/L pH 7.4的PBS透析，换液2-3次，6-8h/次。透析后用PEG20000浓缩至1-2mL，4℃保存。检测蛋白浓度，根据测得蛋白浓度进行适当稀释，加入等体积无菌甘油分装，-20℃保存。 

在0.001-10μmol/L的Na₂-EDTA浓度下，采用间接竞争ELISA(标准操作程序,如前所述)测得吸光度值。以加入竞争物Na₂-EDTA的检测孔的OD450nm(B)与未加竞争物的对照孔的OD450nm(B0，最大吸光度值)的比例(B/B0％，称为结合率)作Y轴，以竞争物Na₂-EDTA的浓度作X轴，绘制Na₂-EDTA的间接竞争ELISA标准曲线(图1)。计算结果显示曲线的IC50为0.187μmol/L。所述杂交瘤分泌的抗体对Na₂-EDTA的灵敏度较高。 

实施例2实施例1制备的抗Na₂-EDTA单克隆抗体的交叉反应 

本研究选用了人体常见的几种阳离子Ca²⁺，Mg²⁺，Fe ²⁺，Fe ³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺分别与Na₂-EDTA络合，作为交叉反应物质。在0.001-10μmol/L的浓度下，采用间接竞争ELISA测得吸光度值(ELISA的标准程序操作如实施例1所述)。如实施例1中所述绘制ELISA标准曲线的方法分别绘制曲线，然后分别计算曲线的IC50。根据IC50，分别计算交叉反应率。计算方法如下：交叉反应率CR(％)＝[EDTA的IC50]/[交叉反应离子-EDTA的IC50]。交叉反应结果显示：K2-EDTA，Ca-EDTA和Mg-EDTA的IC50分别为0.185，0.171和0.181μmol/L，与EDTA的IC50十分接近，说明本研究制备的EDTA McAb在EDTA螯合了K+，Ca2+和Mg2+后仍能识别特异性识别，对于追踪EDTA在体内的生物效应具有重要意义。 

检测结果如图2所示，该单克隆抗体能特异性识别Ca-EDTA和Mg-EDTA，而对Fe-EDTA，Cu-EDTA，Zn-EDTA和Mn-EDTA的识别能力较差。可能是因为抗体针对Na₂-EDTA的空间结构，Na₂-EDTA螯合了原子半径相对较小的Ca²⁺，Mg²⁺后空间结构变形小，抗体仍能识别，Na₂-EDTA螯合了原子半径较大的Fe ²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺后空间结构变形大，导致单克隆抗体不能识别。 

实施例3实施例1制备的抗Na2-EDTA单克隆抗体的亲和常数 

96孔酶标板分别包被浓度为1μg/mL(1:1)，0.5μg/mL(1:2)和0.25μg/mL(1:4)的包被抗原ITCBE-OVA(OVA，卵清蛋白)过夜。一系列稀释的已知浓度的Na₂-EDTA单克隆抗体(5μg/mL；稀释比例为1:1,1:4,1:16,1:64,1:256,1:1024,1:4096)与固相载体上的抗原反应。按照间接ELISA的标准程序操作(如实施例1所述)，最后测得相应OD450nm。 

以抗体浓度的对数作X轴，以相应的OD450nm作Y轴，得到关于McAb的3条反应曲线。通过曲线拟合，以每条曲线的平坦段即最大吸光度值作为OD100，利用曲线方程求得吸光度值达到最大吸光度值的50％时所对应的抗体浓度。然后按Beatty等推导的公式，Kaff＝(n-1)/2(n[Ab]′T-[Ab]T)，根据3条反应曲线([Ab]T表示1μg/mL抗原浓度曲线求得的抗体浓度，同理，[Ab]′T表示0.5μg/mL的抗体浓度；[Ab]″T表示0.25μg/mL的抗体浓度，n为抗原浓度之间的倍数关系)，得到K1＝1/2(2[Ab]′T-[Ab]T)；K2＝1/2(2[Ab]″T-[Ab]′T)；K3＝3/2(4[Ab]″T-[Ab]T)。Kaff＝(K1+K2+K3)/3。 

间接ELISA检测结果曲线拟合后如图3所示。应用曲线方程求得3条曲线的OD50对应的[Ab]T为0.197，[Ab]′T为0.299，[Ab]″T为0.578。根据公式，Kaff＝(n-1)/2(n[Ab]′T-[Ab]T)，计算得K1＝1.246；K2＝0.584；and K3＝0.709。最后的Kaff＝(K1+K2+K3)/3＝0.846，IgG的平均分子量为150kDa，计算得抗体亲和常数为Kaff＝1.78×108L/M，属高亲和力抗体。 

实施例4利用实施例1制备的抗Na2-EDTA单克隆抗体进行初步探索 

由四川大学华西口腔医院口腔颌面外科门诊提供的因正畸治疗需要拔除的前磨牙，牙体及牙周健康。采用组织块法培养原代人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)。选择第五代至第八代细胞作为实验细胞。 

采用MTT法检测Na₂-EDTA对的hPDLF的细胞毒性，为后续试验筛选适宜的EDTA浓度。从5mmol/L开始以1:2梯度稀释，设置8个梯度浓度的Na₂-EDTA，与hPDLF在5％CO2，37℃共培养48h。加入MTT(10μL，5mg/ml)后继续培养4h。加入100μL DMSO，置摇床上10min，使甲臜(蓝紫色结晶)充分溶解。在酶联免疫检测仪测量OD570nm。按照下列公式求得viability(％)。 

viability(％)检测孔均值(OD)-空白对照均值(OD))]× ＝[1-(阴性对照均值(OD)-空白对照均值(OD)  100％ 

结果显示即使EDTA在0.039-5mmol/L(0.001％-0.146％)这样低的浓度下干预48h，hPDLF的存活率都受到相当大的影响(98.9％-30.4％)。口腔临床应用浓度高达17％，所以本研究选择生存率在90％的Na₂-EDTA浓度，0.15mmol/L(0.004％)作为后续western blotting的干预浓度。此外，已有实验证实Ca²⁺可以拮抗Na₂-EDTA的毒性。本实验同时选用相同浓度的Ca-EDTA作干预试剂。 

Western blotting的操作：0.15mmol/L Na₂-EDTA或Ca-EDTA与第5代hPDLF共培养48h后收集蛋白样品以及单纯hPDLF蛋白样品；配制10％分离胶和3.75％浓缩胶；将制好的凝胶置于电泳槽中，预电泳后依次加入蛋白标准品及待分析样品。电泳时，浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V，电泳至溴酚染料线移动到凝胶底部即停止电泳；将凝胶放在阴极侧滤纸上，PVDF膜平放在凝胶上，电泳槽加满转膜液，恒流300mA转膜2h；转膜结束后取出PVDF膜，用3％的BSA在杂交袋中4℃封闭过夜；封闭后的杂交膜在适当位置剪开，分别放杂交袋中，分别加入1：1000稀释的Na₂-EDTA McAb和1：1000稀释的内参抗体GAPDH抗体，4℃孵育过夜；PBS-T洗涤三次(3min/次)后分别加入1:5000稀释的针对相应动物源的HRP-标记二抗，37℃孵育1h；PBS-T洗涤三次(3min/次)，加入ECL发光液，在暗室将杂交后印迹膜在胶片上曝光，曝光结束后进行显影、定影及图像采集。 

采用前期制备的Na₂-EDTAMcAb，检测单纯hPDLF、hPDLF与0.15mmol/L Na₂-EDTA、Ca-EDTA分别共培养48h后的细胞裂解物蛋白样品的western blotting结果显示：在蛋白标准品指示分子量为65kDa处有一特别明显的特异性蛋白条带；而未加入EDTA或者Ca-EDTA共培养的正常hPDLF，即对照蛋白样品，在相应的位置未见明显的蛋白条带(图4)。此结果发现与EDTA，Ca-EDTA共培养后的hPDLF和单纯hPDLF之间有差异蛋白，初步证实存在与EDTA直接发生作用的特定蛋白。 

Claims (6)

1.抗乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2014130的杂交瘤细胞株特异稳定分泌产生。 

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于能够特异性识别Na₂-EDTA。 

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于能够特异性识别Na₂-EDTA螯合了Ca²⁺，Mg²⁺后的螯合物Ca-EDTA和Mg-EDTA。 

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体在用于体外细胞实验追踪Na₂-EDTA的生物效应。 

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体在用于体内动物实验追踪Na₂-EDTA的生物效应。 

6.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO:C2014130的杂交瘤细胞株4G1A6B4。