CN104396592A - 一种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测新方法。选用生产中应用的大豆品种并用无菌水洗净后晾干，超净工作台中，用0.1%的升汞反复消毒3次以上。把蛭石装入直径10cm的塑料营养钵中在高温、高压蒸汽灭菌锅中灭菌，把消毒后的大豆种子分别粘取土壤和根瘤菌，用消毒种子做对照，同时播种在营养钵中，并装入带有透气灭菌盖的无菌袋中，方入光照培养箱中养，定期定量浇入灭菌后的霍格兰营养液，至大豆第4片复叶完全展开，若对照不结根瘤，则测定粘取土壤并结瘤大豆的根瘤固氮酶活性，同时分离该根瘤中的根瘤菌并进行16srDNA鉴定，与根瘤菌所结根瘤的固氮酶活性进行比对，保留分离获得的高固氮活性大豆根瘤菌。

Description

一种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测新方法
技术领域
本发明涉及一种从土壤中分离豆科植物根瘤菌和固氮活性同步检测新方法，尤其是土壤中大豆根瘤菌的分离和固氮活性同步检测新方法。
背景技术
大豆是中国重要的粮食作物，在国民经济和人们日常生活中具有重要作用。大豆生长发育过程中不同于非豆科植物的显著特点是土壤中根瘤菌侵染大豆根系表皮细胞并形成根瘤，从而使大豆可利用空气中的N2并逐步转化为NH3，进而吸收、利用并完成蛋白质的合成。正常田间条件下大豆根瘤固氮量平均可达100 kg N/hm2，最高可达到160 kg N/hm2，根瘤固氮可提供大豆一生需氮总量的25%-60%。可见：根瘤共生固氮在满足大豆生长发育对氮素营养需求上具有极其重要的作用。然而空气中的这些氮气分子是稳定的气体，必须合成为NH3才能被植物所利用。目前氨的合成主要有工业合成法和生物固氮两种途径。生物固氮是指某些微生物和藻类通过其体内固氮酶的作用将分子氮转变为NH3的过程，生物固氮过程能把空气中的氮气还原成NH3并为植物所利用。豆科植物的根瘤是土壤中根瘤菌侵入根系而形成的共生固氮体，根瘤由土壤中入侵的根瘤菌和大豆根系组织构成，是大豆生物固氮的场所。大豆根瘤固氮需要寄主植物将碳水化合物供给根瘤菌，根瘤菌利用这些碳水化合物进行呼吸作用产生电子和能量ATP，在固氮酶催化下把空气中的N2还原成NH3，根瘤固氮既需要能量的供应，又需要有高固氮活性的根瘤菌。因此，发现、分离和纯化高固氮活性的大豆根瘤菌并应用到大豆生产中对提高大豆根瘤固氮能力，进而提高大豆产量和改善品质具有重要作用。
目前已有的土壤中大豆根瘤菌分离、纯化和固氮能力鉴定方法均采用土壤稀释平板划线分离、鉴定方法，该方法需要从大量的土壤微生物中进行形态初步鉴定，然后进一步纯化和鉴定，然后再对固氮活性做进一步检测。根瘤菌分离方法繁琐、工作量大，且根瘤菌分离与固氮活性检测脱节，效果验证准确率低。
本项发明所涉及的这种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测新方法是在多年试验基础上，利用土壤中根瘤菌与大豆的相互识别和在大豆根系上形成根瘤的特殊作用，可准确地从根瘤中分离土壤中入侵的大豆根瘤菌并同步检测根瘤固氮活性，实现了土壤中根瘤菌分离与固氮活性的同步检测，对从土壤中发现和分离具有高固氮活性的大豆根瘤菌具有重要作用。
发明内容
大豆根瘤是土壤中根瘤菌侵染根系表皮细胞形成的一种瘤状物，由土壤中入侵的根瘤菌和大豆根系组织构成，是大豆生物固氮的场所。在根瘤内部，根瘤菌可利用空气中的N2并逐步转化为NH3，进而被大豆吸收、利用并完成蛋白质的合成。利用土壤中根瘤菌与大豆的相互识别和在大豆根系上形成根瘤的特殊作用，可准确地从根瘤中分离土壤中入侵的大豆根瘤菌并同步检测根瘤固氮活性，从而建立一种能够快速、简便并同步测定根瘤固氮活性的新方法，在发现、分离和利用土壤中高活性大豆根瘤菌方面具有重要作用。
本项发明解决其技术问题所采用的技术方案是：选择生产中使用的大豆种子并用无菌水洗净后晾干，在超净工作台无菌风下用0.1%的升汞反复消毒3次以上待用。把蛭石装入直径10cm的塑料营养钵中，在高温、高压蒸汽灭菌锅中灭菌后，用消毒后的大豆种子粘取待分离大豆根瘤菌的土壤，同时用消毒后的大豆种子粘取生产中应用的根瘤菌，用不粘任何土壤及根瘤菌的消毒种子做对照，同时播种在营养钵中并装入带有透气灭菌盖的无菌袋中，在光照培养箱中培养，定期定量浇入灭菌后的霍格兰培养液，直至大豆第4片复叶完全展开后，若不粘任何土壤及根瘤菌的消毒种子不结根瘤，则采用乙炔还原法测定粘取土壤并已结根瘤大豆的根瘤固氮酶活性，同时分离该根瘤中的根瘤菌并进行16s rDNA检测，与生产中应用的根瘤菌所结根瘤的固氮酶活性进行比对，保留分离获得的固氮活性较高的大豆根瘤菌。
本发明的有益效果是：（1）利用土壤中根瘤菌与大豆的相互识别和在大豆根系上形成根瘤的特殊作用，使土壤中大豆根瘤菌分离更准确并减少工作量；（2）实现了土壤中根瘤菌分离、固氮活性检测同步进行，使发现、分离和有目的选择高活性根瘤菌同步完成。
具体实施方式
选择生产中常用的大豆品种并用无菌水洗净后晾干，超净工作台中无菌风下用1%的升汞反复消毒3次以上待用。把蛭石装入直径10cm的塑料营养钵中在高温、高压蒸汽灭菌锅中灭菌后，用消毒后的大豆种子分别粘取土壤和生产中应用的根瘤菌，用不粘任何土壤及根瘤菌的消毒种子做对照，同时播种在营养钵中，并装入带有透气灭菌盖的无菌袋中，在光照培养箱中培养，定期定量浇入灭菌后的霍格兰营养液，直至大豆第4片复叶完全展开，若对照不结根瘤，则采用乙炔还原法测定粘取土壤并已结根瘤大豆的根瘤固氮酶活性，同时分离该根瘤中的根瘤菌并进行16s rDNA鉴定，与生产中应用的根瘤菌所结根瘤的固氮酶活性进行比对，保留分离获得的高固氮活性大豆根瘤菌。
应用实例
2013年，从黑龙江省穆棱市共和水库山林中取回土壤，并按上述“一种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测新方法”中叙述的具体实施方式，选用黑农37号大豆为供试品种，超净工作台中无菌风下，用0.1%升汞反复消毒3次待用。设3个处理，每处理20次重复，具体见下表。
表1 试验处理方法
按上述处理方法，在光照培养箱中培养45天后，检测发现对照大豆没有形成根瘤，证明实验过程中除供试土壤和市场上购买的大豆根瘤菌外，无其它任何根瘤菌进入该试验。
处理1和处理2的大豆全部结瘤，对处理1大豆所结根瘤利用乙炔还原法测定根瘤固氮酶活性，同时进行根瘤中根瘤菌的分离和16s rDNA鉴定，对处理2所结根瘤只进行根瘤固氮酶活性测定。
16s rDNA检测结果表明：分离得到的20个菌株均为大豆根瘤菌，但分别属于2个不同亚种。对根瘤固氮酶活性检测结果表明：其中一个亚种的固氮酶活性平均值为1.107mmolC2H4·g-1·h-1，与处理2所结根瘤固氮酶活性平均值0.8101mmolC2H4·g-1·h-1相比显著增高，另外一个亚种的根瘤固氮酶活性较低，仅为0.6203mmolC2H4·g-1·h-1。利用该方法，我们从穆棱市共和水库山林土壤中分离获得一株固氮活性较高的大豆根瘤菌。

Claims (1)

1.一种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测新方法，其特征是：
大豆种子用无菌水洗净后晾干，用0.1%的升汞反复消毒3次以上待用，把装有蛭石的塑料营养钵在高温、高压蒸汽灭菌锅中灭菌，用消毒后的大豆种子分别粘取土壤和生产中应用的根瘤菌，用不粘任何土壤及根瘤菌的消毒种子做对照，同时播种在营养钵中，并装入带有透气灭菌盖的无菌袋中，在光照培养箱中培养，定期定量浇入灭菌后的霍格兰营养液，直至大豆第4片复叶完全展开，若对照不结根瘤，则采用乙炔还原法测定粘取土壤并结瘤大豆的根瘤固氮酶活性，同时分离该根瘤中的根瘤菌并进行16s rDNA鉴定，与生产中应用的根瘤菌所结根瘤的固氮酶活性进行比对，保留分离获得的高固氮活性大豆根瘤菌。
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