CN104391057B

CN104391057B - 用于检测猪组织中赭曲霉毒素a的预处理试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN104391057B
Application number: CN201410682086.0A
Authority: CN
Inventors: 侯亚莉; 李玉平; 朱英才; 周莉; 丁平; 苏亮; 何义刚; 米自由; 范首军
Original assignee: CHONGQING ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Current assignee: CHONGQING ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-11-24
Also published as: CN104391057A

Abstract

本发明提供了一种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、提取液1、提取液2、IAC柱、淋洗液和洗脱液。本发明还提供了利用所述预处理试剂盒进行猪组织中赭曲霉素A检测的方法，其特征在于用所述试剂盒对猪组织进行预处理后，在一定的液谱和质谱条件下经液质联用技术，对赭曲霉素A进行定量检测。本发明提供的试剂盒和方法具有检测限低、灵敏度高的特点，具有较高的稳定性、精密度和准确性。

Description

用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于食品化学检测领域，特别涉及一种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒及其应用。

背景技术

赭曲霉素A(Ochratoxin A，OTA)是曲霉属和青霉属菌产生的一类毒性化合物，常常污染食品和饲料。OTA在世界范围造成经济损失居毒枝菌素的第二位，仅次于黄曲霉毒素。赭曲霉毒素具有致畸、致癌、致突变、免疫学毒性等毒性，国际癌症研究机构(IARC)将赫曲霉毒素A定为2B类致癌物。赭曲霉毒素主要靶器官是肾脏，能引起肾脏疾病。动物试验表明，赭曲霉毒素A可导致实验动物肝肾损害，诱发肝肾肿瘤，造成肾肿大；也可造成肠炎、淋巴坏疽、肝肿大等疾病。

赫曲霉毒素A在谷物中自然产生，特别在大麦中广泛存在，一般易感染赫曲霉毒素A的食品包括：大豆、绿豆、咖啡豆、酒、葡萄汁、调味品、草本植物等。动物吃了含赫曲霉毒素A的饲料后会导致体内赫曲霉毒素A蓄积，因此在动物性食品中，尤其是猪的肾脏、肝脏、肌肉、血液等中常有赫曲霉毒素A被检出；人们通过食用被赭曲霉毒素A污染的食品，从而将赭曲霉毒素A引入人体，造成毒性伤害。随着对赭曲霉毒素A危害的深入研究，公众逐渐认识到对社会经济和人类健康造成严重的威胁，各国政府对药品食品中赭曲霉毒素A的分布及检测也给与了极大的关注，世界粮农组织和世界卫生组织食品添加剂专家委员会(The JointFAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)经过对是赭曲霉毒素A毒性的评价后，将是赭曲霉毒素A每周的最大耐受摄入量定为0.1ug·kg-1。美国、欧盟和我国对食品、饲料中的是赭曲霉毒素A制定了严格的限量标准。

我国在食品方面已相继出台了很多霉菌毒素的法定标准(参见GB2715-2005食品中真菌毒素限量[s]和GB2761-2011食品中真菌毒素限量[S]，但对赭曲霉毒素A在食品中的检查仅限于谷物及其制品、豆类及其制品，猪组织中赭曲霉毒素A无标准出台。

因此，急需开发猪组织中赭曲霉毒素A残留的高效测定方法。

发明内容

鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种用于猪组织的预处理试剂盒，以及利用该试剂盒连同色谱净化超高液相色谱-串联质谱测定猪组织中赭曲霉毒素A的方法。该试剂盒和方法可用于猪组织中赭曲霉毒素A残留的测定，为拟定食品中赭曲霉毒素A的标准提供技术服务。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、提取液1、提取液2、IAC柱、淋洗液和洗脱液；

所述缓冲液为1mol/L的磷酸溶液；

所述提取液1为乙酸乙酯；

所述提取液2为0.5mol/L、pH8.4的碳酸氢钠溶液；

所述淋洗液为150g氯化钠、2.5g碳酸氢钠溶于水中，加0.1ml吐温-20并用水定容至1L获得的溶液；

所述洗脱液为甲醇：乙酸(V:V)＝49:1的甲醇/乙酸混合液。

一种检测猪组织中赭曲霉素A的方法，包括如下步骤：

(1)获取标准曲线：

a.将赭曲霉毒素A标准品溶于体积比为99:1的冰醋酸：苯配制成1μg/mL的OTA标准品储备液；

b.将OTA标准品储备液用色谱流动相溶液稀释成不同浓度的系列OTA标准溶液；

c.将空白样品猪组织进行匀浆处理，并利用所述的试剂盒对空白样品猪组织匀浆进行预处理：

i.并准确称取2.0g空白样品猪组织匀浆，加入0.6ml缓冲液中，涡旋混匀后，用5ml提取液1提取3次，再用5ml提取液2提取2次；

ii.所得提取后的溶液再经缓冲液调节pH至6.8-8.0，然后将所得溶液通过IAC柱；

iii.用10ml淋洗液淋洗，3ml洗脱液洗脱；

iv.收集洗脱后的溶液，用氮气吹干获得空白样品产物；

d.将上述系列OTA标准溶液分别注入空白样品产物中，获得系列梯度浓度的标准曲线溶液；

e.取10μl上述系列梯度浓度的标准曲线溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测，以标准曲线溶液中的OTA浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(2)检测待测样品：

a.采集待测猪组织进行匀浆处理；

b.利用权利要求1所述的试剂盒按照第(1)步中c部分i～iv所述的步骤对待测猪组织匀浆进行预处理，将氮气吹干后的待测样品产物溶于1ml色谱流动相溶液获得供试品溶液；

c.将10μl供试品溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测，将测得定量离子峰面积代入上述标准曲线可获得供试品溶液中OTA的浓度。

所述色谱流动相溶液由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为5mM醋酸铵0.01％甲酸水溶液；流动相流速为：0.35ml/min采用梯度洗脱，按表1所示参数进行。

所述超高液相色谱-串联质谱仪在检测时的色谱条件为：采用粒径为1.7um，柱内径2.1mm，柱长为100mm的C₁₈柱；质谱条件为：电喷雾离子化源ESI源，质谱参数如表2所示：

表1.流动相梯度

时间/min	A相/％	B相/％
			0	30	70
2	80	20
			6	80	20
6.5	30	70
			12	30	70

表2.质谱参数表

电喷雾电压(SV:伏)

定量离子

碰撞能量

定性离子

碰撞能量

采集模式

		(CE:伏)		(CE:伏)
						3500	404/292.01	24	404/358.02	14	正离子

所述预处理试剂盒的制备方法，包括如下步骤：配制1mol/L的磷酸溶液作为缓冲液；以乙酸乙酯作为提取液1；配制0.5mol/L、pH8.4的碳酸氢钠溶液作为提取液2；将150g氯化钠、2.5g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1ml吐温-20并用水定容至1L配制得到淋洗液；按体积比49:1配制甲醇：乙酸溶液作为洗脱液；上述溶液连同IAC柱一起组装成所述试剂盒。

所述预处理试剂盒在检测猪组织中赭曲霉素A方面的应用。

本发明提供了用于液质联用检测组织中赭曲霉素A的预处理试剂盒。经本发明的试剂盒预处理过的猪组织通过液质联用技术测定其中的赭曲霉素A含量，可有效排除干扰，保证待测物的稳定。所述试剂盒灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于猪组织中赭曲霉毒素A的残留测定。

此外，本发明还提供了用所述预处理试剂盒检测猪组织中赭曲霉素A的方法，该方法通过免疫亲和色谱净化超高液相色谱-串联质谱对猪组织样品进行分析，检测猪组织样品中赭曲霉毒素A的残留量，减少了假阳性。提高了测定的准确性，有较强的实用性。该方法对赭曲霉毒素A残留的检测具有重要的指导意义。可用于国家标准的制定、企业现有产品质控方法的提升。

附图说明

图1为正离子模式的标准溶液总离子流图

图2为正离子模式的供试样品总离子流图

图3为正离子模式的加样回收总离子流图

图4为正离子模式的空白样品总离子流图

图5为实施例2～4获得的标准曲线图谱

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

主要仪器设备

串联四级杆质谱仪(美国热电公司)、ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国热电公司)、离心机(金坛市富华仪器有限公司)、超纯水机(美国Milipore)、Syncronis C18色谱柱(美国热电公司)

主要试剂及其来源

赭曲霉毒素A标准品(美国Sigma)、乙腈、甲酸、乙酸铵均为国产色谱纯；IAC柱(北京华安麦科生物技术有限公司)

生物材料的来源和记载出处

本发明使用的猪组织均可以商购获得。

实施例1预处理试剂盒的制备

制备步骤：

配制1mol/L的磷酸溶液作为缓冲液；以乙酸乙酯作为提取液1；配制0.5mol/L、pH8.4的碳酸氢钠溶液作为提取液2；将150g氯化钠、2.5g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1ml吐温-20并用水定容至1L配制得到淋洗液；按体积比49:1配制甲醇：乙酸溶液作为洗脱液；上述溶液连同IAC柱一起组装成预处理试剂盒。

实施例2 1号猪组织中赭曲霉素A的测定

步骤：

1.获取空白样品

将市面上购买的几种猪组织样品分别经质谱检测，最终确定将不含OTA的猪组织作为获取标准曲线的空白样品，以此作为基质加入至OTA标准溶液中获得标准曲线溶液，以避免整个检测过程中出现基质效应的干扰，确保本发明的严谨性和准确度。

2.获取标准曲线：

a.将赭曲霉毒素A标准品溶于冰醋酸：苯(99:1V/V)配制成1μg/mL的OTA标准品储备液；

c.将空白样品猪组织进行匀浆处理，并利用本发明所述的试剂盒对空白样品猪组织匀浆进行预处理：

i.准确称取2.0g匀浆后的空白样品于50mL具塞离心管中，加入0.6ml缓冲液中，涡旋混匀后，用5ml提取液1提取3次，再用5ml提取液2提取2次；

iii.用10ml淋洗液淋洗，3ml洗脱液洗脱；

iv.收集洗脱后的溶液，用氮气吹干获得空白样品产物；

d.分别取1ml的上述系列OTA标准溶液注入上述空白样品产物中，获得系列梯度浓度的标准曲线溶液，其浓度分别为0.1、0.5、1、5、10ng/mL；

e.取10μl系列标准曲线溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测，每个浓度点重复测定3次，取平均值。以OTA在空白样品中的浓度为横坐标，定量子离子(m/z 404/292.01)峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

f.所述超高液相色谱-串联质谱仪在检测时的色谱条件为：采用粒径为1.7um，柱内径2.1mm，柱长为100mm的C₁₈柱；色谱流动相溶液由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为5mM醋酸铵0.01％甲酸水溶液；流动相流速为：0.35ml/min采用梯度洗脱，按表1所示梯度进行；质谱条件为：采用电喷雾离子化源ESI源，质谱参数如表2所示。

表1.流动相梯度

时间/min	A相/％	B相/％
			0	30	70
2	80	20
			6	80	20
6.5	30	70
			12	30	70

表2.质谱参数表

3.检测待测样品：

a.采集1号猪组织进行匀浆处理；

b.利用所述试剂盒对1号猪组织匀浆按照第1步中c部分i～iv所述的步骤进行预处理，将氮气吹干后获得的1号待测产物溶于1ml 5mM醋酸铵0.01％甲酸水溶液：乙腈(8:2)溶液获得1号供试品溶液；

c.将10μl 1号供试品溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测，所述超高液相色谱-串联谱仪在检测时的色谱条件和质谱条件与第1步骤中的f步骤描述的相同。将测得的定量离子的峰面积代入上述标准曲线公式计算得出1号供试品溶液中赭曲霉毒素A的浓度c。

4.根据计算公式可以计算出每一千克1号猪组织中赭曲霉素A的含量x；

式中：

x—样品中赭曲霉毒素A的浓度，μg/kg；

c—从标准曲线中得出的测试溶液中赭曲霉毒素的浓度，ng/ml；

m—样品取样量，g。

结果：

1.将本身不含OTA的猪组织作为空白样品，所述空白样品经质谱检测，其在正离子模式下的总离子流图如图4所示。

2.第2步中的e步骤利用液质联用技术检测标准曲线溶液获得的其中一个正离子模式下的总离子流图如图1所示，进一步获得的所述标准曲线对应的线性回归方程为：C＝2×10^-5X-0.1078，C代表浓度，X代表峰面积；相关系数R²＝0.9995；线性范围是0.1-10ng/ml；

3.第3步c步骤测得的1号供试品溶液的定量离子峰面积响应值为：23350，将该值代入上述标准曲线对应的直线回归方程式，得出1号供试品溶液中的赭曲霉毒素A浓度c为0.3529ng/ml；

4.将c代入计算公式得出x＝0.18μg/kg，即每一千克1号猪组织中赭曲霉素A的含量为0.18μg。

实施例3.2号猪组织中赭曲霉素A的测定

步骤：

1.标准曲线的获得：

详细步骤与实施例2的第2步相同。

2.检测待测样品

a.收集2号猪组织进行匀浆处理；

b.与实施例2第3步b步骤相同，获得2号供试品溶液；

c.将10μl 2号供试品溶液注入超高液相色谱-串联质谱仪，所述超高液相色谱-串联质谱仪在检测时的色谱条件和质谱条件与实施例2第2步骤中的f步骤描述的相同。将测得的定量子离子的峰面积代入上述标准曲线公式计算得出2号供试品溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

3.与实施例2第4步骤相同。

结果：

1.第1步骤获得的所述标准曲线对应的线性回归方程为：C＝2×10^-5X-0.1078，C代表浓度，X代表峰面积；相关系数R²＝0.9995；线性范围是0.1-10ng/ml；

2.第2步中c步骤测得的2号供试品溶液正离子模式下的总离子流图如图2所示，其定量离子峰面积响应值为：10822，将该值代入上述标准曲线对应的直线回归方程式，得出2号供试品溶液中赭曲霉毒素A的浓度c为0.22ng/ml；

3.将c代入计算公式得出x＝0.11μg/kg，即每一千克2号猪组织中赭曲霉素A的含量为0.11μg。

实施例4.3号猪组织中赭曲霉素A的测定

步骤：

1.标准曲线的获得：

详细步骤与实施例2的第2步相同。

2.检测待测样品

a.收集3号猪组织进行匀浆处理；

b.与实施例2第3步b步骤相同，获得3号供试品溶液；

c.将10μl 3号供试品溶液注入超高液相色谱-串联质谱仪，所述超高液相色谱-串联质谱仪在检测时的色谱条件和质谱条件与实施例2第2步骤中的f步骤描述的相同。将测得的定量子离子的峰面积代入上述标准曲线公式计算得出3号供试品溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

3.与实施例2第4步骤相同。

结果：

2.第2步中c步骤测得的3号供试品溶液的定量离子峰面积响应值为：3674，将该值代入上述标准曲线对应的直线回归方程式，得出3号供试品溶液中赭曲霉毒素A的浓度c为0.073ng/ml；

3.将c代入计算公式得出x＝0.036μg/kg，即每一千克3号猪组织中赭曲霉素A的含量为0.036μg。

实施例4.本发明试剂盒和检测方法的质量控制

1.线性关系

精密吸取上述系列标准曲线溶液各10μl，进样分析，标准曲线回归方程为：C＝1×10^-5X-0.007，相关系数为0.9995，表明线性关系良好。

2.检测限及定量限

a.取6个平行空白猪组织样品进行添加回收试验，按照上述样品提取与净化步骤处理后，UPLC-MS/MS条件进行分析，测得基线噪音，求其平均值。计算实际确证的最低定量离子的信噪比，以子离子信噪比大于等于10(S/N≥10),并且符合欧盟委员会2002/657/EC决议所规定的阳性样品确证条件，所对应的添加浓度定位定量限。

b.检测限为样品实际添加并且符合样品阳性确证条件的最低添加浓度，以离子信噪比大于等于3(S/N≥3)来确定。

c.根据6个平行空白猪组织样品进行添加回收试验，得到OTA的检测限为0.03μg/kg，定量限为0.10μg/kg。而OTA目前在食品中的限量是5μg/kg。该结果表明，本方法检测限低于食品限量标准。

3.精密度试验

系列标准曲线溶液中浓度为1ng/ml的标准溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果表明，6次进样峰面积的RSD值在1.4％-3.8％范围内，精密度良好。

4.稳定性试验

取回收率试样项下的中间浓度的样品溶液，每个8小时进样分析，记录峰面积，结果表明，在0-24小时之内，样品溶液基本稳定。

5.加样回收率试验

取精密称取猪组织匀浆2g，分别加入不同浓度水平的标准品溶液适量，按照实施例2第2步骤操作，得到的正离子模式下的加样回收总离子流图如图3所示，计算回收率及相应的RSD值，结果(见表3)表明，本方法回收率实验结果良好。

表3 回收率试验(n＝6)

Claims

1.一种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、提取液1、提取液2、IAC柱、淋洗液和洗脱液；

所述缓冲液为1mol/L的磷酸溶液；

所述提取液1为乙酸乙酯；

所述提取液2为0.5mol/L、pH8.4的碳酸氢钠溶液；

所述洗脱液为甲醇：乙酸(V:V)＝49:1的甲醇/乙酸混合液。

2.一种检测猪组织中赭曲霉素A的方法，包括如下步骤：

(1)获取标准曲线：

c.将空白样品猪组织进行匀浆处理，并利用权利要求1所述的试剂盒对空白样品猪组织匀浆进行预处理：

i.并准确称取2.0g空白样品猪组织匀浆，加入0.6ml缓冲液中，涡旋混匀后，用5ml提取液1提取3次，提取所得的溶液再用5ml提取液2提取2次；

iii.用10ml淋洗液淋洗，3ml洗脱液洗脱；

iv.收集洗脱后的溶液，用氮气吹干获得空白样品产物；

(2)检测待测样品：

a.采集待测猪组织进行匀浆处理；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述色谱流动相溶液由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为5mM醋酸铵0.01％甲酸水溶液；流动相流速为：0.35ml/min采用梯度洗脱，按表1所示参数进行：

表1.流动相梯度

。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述超高液相色谱-串联质谱仪在检测时的色谱条件为：采用粒径为1.7μm，柱内径2.1mm，柱长为100mm的C₁₈柱；质谱条件为：电喷雾离子化源ESI源，质谱参数如表2所示：

表2.质谱参数表

5.权利要求1所述的预处理试剂盒的制备方法，包括如下步骤：配制1mol/L的磷酸溶液作为缓冲液；以乙酸乙酯作为提取液1；配制0.5mol/L、pH8.4的碳酸氢钠溶液作为提取液2；将150g氯化钠、2.5g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1ml吐温-20并用水定容至1L配制得到淋洗液；按体积比49:1配制甲醇：乙酸溶液作为洗脱液；上述溶液连同IAC柱一起组装成所述试剂盒。

6.权利要求1所述的预处理试剂盒在检测猪组织中赭曲霉素A方面的应用。