CN104383480A - 鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用，鳖甲煎丸可以通过抑制肺组织中促纤维化炎性因子TNF-α、TGF-β1和IL-1β的产生、抑制基质金属蛋白酶MMPs的活性、减少羟脯氨酸的含量等综合因素产生抗肺纤维化作用，具有提高模型动物存活率、抑制肺脏的炎症反应、减轻肺组织的损伤、减少肺脏纤维化组织的产生而发挥抗肺纤维化作用。本发明证实了鳖甲煎丸有治疗肺纤维化的作用，提供了鳖甲煎丸的新的用途。

Description

鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及鳖甲煎丸在治疗肺纤维化中的应用。
背景技术
肺纤维化一般指在毒物、自发免疫反应、药物副反应、感染、严重外伤等不同因素刺激下引起肺部炎症反应。该病的基本病程和病理为：肺脏早期损伤之后有肺泡炎，肺泡内有浆液和细胞成分，肺间质内有大量单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、肺泡巨噬细胞等炎症免疫细胞浸润，多种细胞因子分泌，此时肺泡结构尚完整；随着炎症免疫反应的进展，促纤维化因子生成增多或抗纤维化因子产生相对不足，炎症和异常修复导致肺间质细胞增殖，导致肺纤维化过程的细胞外基质(ECM)代谢异常，产生大量的ECM蛋白；进入晚期，肺泡结构为坚实的胶原代替，肺泡壁、气道和血管最终纤维化，严重影响肺的通气和换气功能，最终导致呼吸功能衰竭而死亡。该病的发病机理未完全阐明，目前临床上缺乏有效的治疗手段，死亡率很高。美国胸科学会(ATS)、欧洲呼吸学会(ERS)、日本呼吸学会(JRS)及拉丁美洲胸科协会(ALAT)对IPF的定义为：特发性肺纤维化(IPF)是一种原因不明，慢性、特发性、进行性肺间质纤维化的间质性肺炎。
发明内容
本发明的目的是提供一种鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
进一步地，所述鳖甲煎丸可以抑制肺组织中促纤维化炎性因子TNF-α、TGF-β1和IL-1β的产生。
进一步地，所述鳖甲煎丸可以抑制肺组织中基质金属蛋白酶MMPs的活性。
进一步地，所述鳖甲煎丸可以减少肺组织中羟脯氨酸Typ的含量。
进一步地，所述鳖甲煎丸的主要成分为：鳖甲胶、阿胶、蜂房(炒)、鼠妇虫、土鳖虫(炒)、蜣螂、硝石(精制)、柴胡、黄芩、半夏(制)、党参、干姜、厚朴(姜制)、桂枝、白芍(炒)、射干、桃仁、牡丹皮、大黄、凌霄花、葶苈子、石韦、瞿麦；功能主治：活血化瘀、软坚散结；用于胁癥下块。
本发明讨论了鳖甲煎丸对肺纤维化的作用，证实了鳖甲煎丸有治疗肺纤维化的作用，提供了鳖甲煎丸的新的用途。鳖甲煎丸具有提高模型动物存活率、抑制肺脏的炎症反应、减轻肺组织的损伤、减少肺脏纤维化组织的产生而发挥抗肺纤维化作用。
附图说明
图1本发明实施例提供的不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对博来霉素致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(HE染色，*100)。
图2本发明实施例提供的不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对博来霉素致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(Masson染色，*100)。
图3本发明实施例提供的不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(HE染色，*100)。
图4本发明实施例提供的不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(Masson染色，*100)。
具体实施方式
实施例1鳖甲煎丸对博来霉素致大鼠肺纤维化的治疗作用
本实施例通过采用博来霉素致大鼠肺纤维化模型，研究鳖甲煎丸是否具有抗肺纤维化的作用，并初步了解其肺纤维化的作用机理；所用鳖甲煎丸为武汉中联药业集团有限公司生产。
实验方法
1.1动物分组与造模
大鼠按Excel完全随机分组法分为6组，分别为：正常对照组(假手术组)，模型组，阳性药泼尼松，鳖甲煎丸高剂量、中剂量和低剂量组。除正常动物组外，其余大鼠均采用气管内注射盐酸博来霉素生理盐水(5mg/kg)的方法致大鼠肺纤维化。
1.2动物给药及待检测标本的采集方法
造模次日开始给予药物治疗。各组动物按应给予药液经口灌胃给药，1ml/100g体重，每日一次，持续1个月。
给药结束后所有大鼠称体重，腹主动脉放血致死，摘取肺脏并重量。一侧肺脏取材待测致纤维化因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β，基质金属蛋白酶(MMPs)和羟脯氨酸(Typ)。另一侧肺脏由支气管注入10％甲醛溶液，直至胸膜平展后结扎支气管，肺组织固定后自肺尖致肺底纵行取材待做病检(HE染色和Masson染色)。
实验结果
2.1肺组织致纤维化炎性因子(TNF-α、TGF-β1、IL-1β、MMPs和Typ)的变化
肺组织致纤维化炎性因子的测试结果显示，模型组大鼠肺脏的TNF-α、TGF-β1、IL-1β水平均略高于正常大鼠。5mg/kg的泼尼松和1.5、3.0g/kg的鳖甲煎丸连续经口灌胃给予模型大鼠1个月，均不同程度的降低了上述4个致纤维化因子的水平，但仅有1.5g/kg的鳖甲煎丸对TNF-α的降低呈现统计学的显著性差异(P<0.05，v.s模型组)。在此模型中，0.75g/kg的鳖甲煎丸则没有减少致纤维化炎性因子的作用。
致造模一个月末，胶原组织特有的成份羟脯氨酸的含量明显升高，5mg/kg的泼尼松和3个剂量组的鳖甲煎丸均明显降低了羟脯氨酸的含量(P<0.05或0.01，v.s模型组)，说明泼尼松和鳖甲煎丸均有抑制肺纤维化的作用。
在此模型中，虽然模型动物肺脏的基质金属蛋白酶MMPs没有明显升高，但5mg/kg的泼尼松和3.0、1.5g/kg的鳖甲煎丸均抑制了基质金属蛋白酶MMPs的活性，此作用可能与鳖甲煎丸的抗纤维化作用有关(表1，表2)。
表1.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对博来霉素致肺纤维化大鼠肺组织TNF-α、TGF-β1、IL-1β的影响
*P<0.05 v.s模型组
表2.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对博来霉素致肺纤维化大鼠肺组织MMPs和Typ的影响
**P<0.01，*P<0.05 v.s模型组
2.2肺组织病理切片HE染色
每只大鼠标本取同一片肺叶的两个组织块，石蜡包埋切片后HE染色，*100倍拍摄HE染色随机视野，每张照片拍摄四个视野，进行分级：
HE染色结果显示：
模型组大鼠肺组织破坏严重，表现为肺泡结构明显破坏，出现大片肺实变现象。肺泡也可见融合成大的空腔，并伴随明显的肺部炎性病变，可见大量淋巴细胞聚集、浸润及渗出性改变；泼尼松组大鼠的肺脏破坏程度明显减轻，可见部分结构正常的肺组织，但与模型组相比尚未出现统计学的显著性差异；1.5、3.0g/kg的鳖甲煎丸明显减轻了模型大鼠肺组织的破坏程度，肺实变明显减轻，炎性细胞浸润和纤维化的程度也明显轻于模型组大鼠(P<0.05，v.s模型组)；0.75g/kg的鳖甲煎丸也略减轻了肺脏的损伤程度(表3，图1)。表3.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对博来霉素致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(HE染色，mann-whitney检验)
**P<0.01，*P<0.05 v.s模型组
2.3肺组织病理切片Masson染色
Masson染色结果显示：
正常肺组织染色呈红色，镜下很少见到着色深蓝的纤维化组织，肺泡结构正常；模型大鼠肺脏布满着色深蓝色的纤维化组织，肺泡结构完全被破坏，肺组织实变；5mg/kg的泼尼松和1.5、3.0g/kg的鳖甲煎丸均不同程度的减少了纤维化组织，与模型组相比，具有统计学的显著性差异(P<0.05,v.s模型组)(表4，图2)。
表4.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对博来霉素致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(Masson染色，mann-whitney检验)
*P<0.05 v.s模型组
实验讨论
在博来霉素致大鼠肺纤维化的实验中，①.5mg/kg的泼尼松和鳖甲煎丸均有一定的抑制肺脏炎性肿胀的作用，并减轻了肺脏的重量；②.对肺组织中促纤维化炎性因子TNF-α、TGF-β1和IL-1β有一定的抑制作用，其中只有1.5g/kg的鳖甲煎丸抑制TNF-α的作用呈现出统计学的显著性差异，而TNF-α抑制剂是抗肺纤维化的靶点之一；③.5mg/kg的泼尼松和1.5、3.0g/kg的鳖甲煎丸明显降低了肺组织中基质金属蛋白酶MMPs的活性，该酶在肺纤维化的形成中有重要的作用。MMPs的抑制剂也是抗肺纤维化的作用靶点之一，因此这可能是鳖甲煎丸抗肺纤维化的作用机制之一；④.5mg/kg的泼尼松和0.75、1.5、3.0g/kg的鳖甲煎丸均显著减少了肺组织中羟脯氨酸(纤维化组织的主要成分)的含量，说明鳖甲煎丸具有较好的抗肺纤维化的作用；⑤.病理组织学检查显示，鳖甲煎丸可减轻博来霉素诱发的肺纤维化病变，明显抑制炎性细胞浸润，减轻肺组织的破坏，减少肺脏中的纤维化组织，以1.5g/kg和3.0g/kg的鳖甲煎丸作用显著。
实施例2鳖甲煎丸对百草枯致大鼠肺纤维化的治疗作用
本实施例通过采用百草枯致大鼠肺纤维化模型，研究鳖甲煎丸是否具有抗肺纤维化的作用，并初步了解其肺纤维化的作用机理；所用鳖甲煎丸为武汉中联药业集团有限公司生产。
实验方法
1.1动物分组
动物分组与博来霉素致肺纤维化相同。
1.2造模及给药方法
除正常对照组外，其余大鼠称重后均按0.1ml/100g的剂量一次性腹腔注射百草枯药液造模。
随后经口灌胃给予应给予的药液，1ml/100g体重，每日一次，连续1个月。
自造模后第3天开始，各组大鼠均出现程度不同的症状，包括：口鼻、乃至眼周出现有红色分泌物，部分大鼠出现呼吸变浅、频率加快、呼吸困难、消瘦等症状，并陆续有造模大鼠死亡。阳性对照药泼尼松组和鳖甲煎丸的高剂量组大鼠呼吸急促现象稍缓。
1.3检测标本采集方法
给药结束后所有存活大鼠称体重，腹主动脉放血致死，摘取肺脏并重量，计算肺脏的脏器系数。一侧肺脏取材待测致纤维化炎性因子TNF-α、
TGF-β1、IL-1β，基质金属蛋白酶(MMPs)和羟脯氨酸(Typ)，另一侧肺脏由支气管注入10％甲醛溶液，直至胸膜平展后结扎支气管，肺组织固定后自肺尖致肺底纵行取材待做病检(HE染色和Masson染色)。
实验结果
2.1对动物存活率的影响
由百草枯诱发的大鼠肺纤维化模型致1个月时大鼠的存活率为37％。5mg/kg的泼尼松和3.0g/kg的鳖甲煎丸均明显提高了动物的存活率，与模型组相比，P值分别小于0.025和0.01；1.5和0.75g/kg的鳖甲煎丸也不同程度的提高了动物的存活率，但与模型组相比未出现统计学的显著性差异。鳖甲煎丸在提高动物存活率方面呈现了良好的量效关系(表5)。
表5.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠存活率的影响
**P<0.01，*P<0.025 v.s模型组
2.2对肺脏重量及其脏器系数的影响
模型组动物肺脏的平均重量明显大于空白对照组(P<0.01)；5mg/kg的泼尼松和3.0g/kg的鳖甲煎丸均明显降低了大鼠肺脏的平均重量，与模型组相比，P值均小于0.05，与对动物存活率的影响相同；1.5和0.75g/kg的鳖甲煎丸也降低了大鼠肺脏的平均重量，但与模型组相比未出现统计学的显著性差异。
在对肺脏系数的影响方面，泼尼松和鳖甲煎丸呈现了与对肺脏重量相同的结果，但与模型组相比，均未出现统计学的显著性差异。鳖甲煎丸的此作用也呈现了良好的量效关系(表6)。
表6.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠肺脏重量及其脏器系数的影响
**P<0.01，*P<0.05 v.s模型组
2.3肺组织致纤维化炎性因子(TNF-α、TGF-β1、IL-1β、MMPs和Typ)的变化
在此模型中，致造模1个月末，大鼠肺脏TNF-α、TGF-β1、IL-1β、MMPs和Typ值均明显升高(P<0.01或0.05，v.s正常对照组)；5mg/kg的泼尼松均不同程度的减少了肺组织中TNF-α、TGF-β1、IL-1β含量和MMPs活性，但与模型组相比，尚未出现统计学的显著性差异，却明显减少了羟脯氨酸的含量(P<0.01，v.s模型组)，显示了其一定的抗纤维化作用；3.0和1.5g/kg的鳖甲煎丸均明显减少了肺组织中TNF-α、TGF-β1和IL-1β的含量(P<0.05或0.01，v.s模型组)。3个剂量组的鳖甲煎丸均显著性抑制了肺脏MMPs的活性、减少了羟脯氨酸的含量(P<0.01或0.05，v.s模型组)。
在此模型中，可能由于肺纤维化的程度显著轻于博来霉素模型大鼠，因此鳖甲煎丸显示了良好的抗肺纤维化作用(表7，表8)。
表7.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠肺组织TNF-α、TGF-β1、IL-1β的影响
**P<0.01，*P<0.05 v.s模型组
表8.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药2个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠肺组织MMPs和Typ的影响
**P<0.01，*P<0.05 v.s模型组
2.4肺组织病理切片HE染色
HE染色结果显示：
肺脏病理镜下观可见：模型大鼠肺组织结构破坏，肺泡壁塌陷，肺泡间隙有较多的炎性细胞浸润，但损伤程度明显轻于博来霉素所致的大鼠肺纤维化；5mg/kg的泼尼松和3.0g/kg的鳖甲煎丸组大鼠的肺脏破坏程度明显轻于模型动物，尚可见正常的肺泡结构，炎性细胞的数量也显著减少(P<0.01，v.s模型组)；1.5和0.75g/kg的鳖甲煎丸也不同程度的改善了肺脏损伤，但与模型组相比，未出现统计学的显著性差异(表9，图3)。
表9.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯素致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(HE染色，mann-whitney检验)
**P<0.01 v.s模型组
2.5肺组织病理切片Masson染色
Masson染色结果显示：
Masson染色结果显示，模型大鼠肺脏内有较多量着色深蓝色的纤维化组织，尤以支气管周围和肺组织边缘较多；5mg/kg的泼尼松和3个剂量组的鳖甲煎丸组均不同程度的减少了肺脏内的纤维组织含量，但仅以3.0g/kg的鳖甲煎丸呈现出统计学的显著性差异(P<0.05，v.s模型组)(表10，图4)。
表10.不同剂量的鳖甲煎丸连续经口灌胃给药1个月对百草枯致肺纤维化模型大鼠肺脏病理的影响(Masson染色，mann-whitney检验)
*P<0.05 v.s模型组
实验讨论
百草枯所致的大鼠肺纤维化模型较轻，因此较好的显示了鳖甲煎丸药物的防治作用。在百草枯致大鼠肺纤维化的实验中，①.5mg/kg的泼尼松和3个剂量组的鳖甲煎丸均提高了大鼠的存活率，尤以3.0g/kg的剂量显著，且鳖甲煎丸的此作用呈现了良好的量效关系；②.5mg/kg的泼尼松和3个剂量组的鳖甲煎丸均有一定的抑制肺脏炎性肿胀的作用，减轻了肺脏的绝对重量，尤以泼尼松和3.0g/kg的鳖甲煎丸作用显著，并降低了肺脏的脏器系数；③.1.5g/kg和3.0g/kg的鳖甲煎丸均明显减少了肺组织中促纤维化炎性因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β的含量，且0.75、1.5、3.0g/kg的鳖甲煎丸均明显降低了肺组织中基质金属蛋白酶MMPs的活性，减少了肺组织中羟脯氨酸的含量。这些因素都与肺纤维化密切相关，因此鳖甲煎丸的抗肺纤维化作用应该与这些环节有关；④.病理组织学检查显示，鳖甲煎丸可减轻百草枯诱发的肺纤维化病变，明显抑制炎性细胞浸润，减轻肺组织的破坏，减少肺脏中的纤维化组织，以3.0g/kg的鳖甲煎丸作用显著。
综合上述两个实施例，可以看出，鳖甲煎丸可以通过抑制肺组织中促纤维化炎性因子TNF-α、TGF-β1和IL-1β的产生、抑制基质金属蛋白酶MMPs的活性、减少羟脯氨酸的含量等综合作用产生抗肺纤维化作用，具有提高模型动物的存活率、抑制肺脏的炎症反应、减轻肺组织的损伤、减少肺脏纤维化组织的产生而发挥抗肺纤维化作用。鳖甲煎丸抗肺纤维化的有效剂量为0.75-1.5g/kg/日(大鼠)。

Claims (4)

1.鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
2.如权利要求1所述的鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于：所述鳖甲煎丸可以抑制肺组织中促纤维化炎性因子TNF-α、TGF-β1和IL-1β的产生。
3.如权利要求1所述的鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于：所述鳖甲煎丸可以抑制肺组织中基质金属蛋白酶MMPs的活性。
4.如权利要求1所述的鳖甲煎丸在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于：所述鳖甲煎丸可以减少肺组织中羟脯氨酸Typ的含量。
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