CN104382894A - 含笑内酯在制备治疗耐药白血病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含笑内酯在制备治疗耐药白血病的药物中的用途,所述耐药白血病是针对临床常用化疗药物阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷、氨甲喋呤、伊马替尼或环磷酰胺中的一种或两种以上耐受的耐药白血病。本发明含笑内酯对耐药白血病的细胞有较强的抑制活性。对耐药白血病的治疗带来了新的希望。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别涉及含笑内酯在制备治疗耐药白血病的药物中的用途。
背景技术
白血病是造血系统的一种恶性疾病,由于大量发育不成熟,无正常造血功能的幼稚细胞在骨髓和血液中聚集,从而导致造血障碍,免疫系统破坏等。目前治疗白血病的主要手段有化疗,骨髓移植等。然而虽然现行的治疗白血病的化疗药物能够改善患者一些相应的临床指标,但是很难取得一些比较有效的进展。近年来,对于化疗药物的多药耐药成为了临床上亟待解决的首要问题,多药耐药也已经成为白血病化疗失败和复发的主要原因之一。白血病多药耐药的机制主要是:白血病细胞表达多药耐药蛋白MDR1、多药耐药相关蛋白MRP、乳腺癌耐药蛋白BCRP、肺耐药蛋白LRP以及其他与耐药相关的信号通路等。其中MDR1是常见的多药耐药蛋白,又称作P-gp,是一种表达在细胞膜表面的糖蛋白,是ABC蛋白转运家族的重要成员,能够将摄入细胞内部的化疗药物泵出细胞外从而使细胞对化疗药物产生耐受。
过去三十年内,陆续有多种治疗白血病的化疗药物出现,虽然这些化疗药物能起到一定的缓解作用,改善一些相应的临床指标,达到有限的延长白血病患者的生命的作用,但是很难取得更效的进展,而且容易出现白血病的复发和对化疗药的耐受。目前临床常用的治疗白血病的药物为阿霉素、柔红霉素、长春新碱、阿糖胞苷、氨甲喋呤和环磷酰胺等。但是目前这些化疗药物在临床上都有一定程度的耐受现象,因此目前白血病的耐药问题已经成为一个亟待解决的重要科学问题。
含笑内酯是一类由玉兰中提取出来的有效成分,属于愈创木烷型倍半萜内酯类化合物,已经有文献报道[J.Nat.Prod.1993,56,90-98;Bioorg.Med.Chem.Lett.2003,11,1503-1510],其抗炎以及治疗白血病的活性[J.Med.Chem.2012,25;55(20):8757-69.],本发明在其基础上发现其对来源于耐药白血病病人的原代白血病细胞以及白血病的耐药细胞株均有明显的治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供含笑内酯在制备治疗耐药白血病的药物中的用途。
含笑内酯的结构式如下所示:
本发明采用的技术方案为:
本发明提供了含笑内酯在制备治疗耐药白血病的药物中的用途。
作为优选,所述耐药白血病是针对临床常用化疗药物阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷、氨甲喋呤、伊马替尼或环磷酰胺中的一种或两种以上耐受的耐药白血病。
所述耐药白血病是指急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病,慢性白血病以及浆细胞白血病、慢粒急变白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病,巨核细胞白血病,未分化型急性白血病或组织嗜碱细胞白血病、低增生性白血病类型的耐药白血病。
本发明所具有的有益效果:
本发明含笑内酯对耐药白血病的细胞有较强的抑制活性。对耐药白血病的治疗带来了新的希望。
附图说明
图1为:实施例2动物模型试验中不同的剂量的含笑内酯对小鼠生存期的影响结果图。
图2为:实施例2动物模型试验中死亡小鼠骨髓中CD45+的比例分析图。
具体实施方式
为了理解本发明,下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但不限定本发明的保护范围。
实施例1:细胞水平分析
采用MTT法,对含笑内酯对耐药性白血病细胞的杀伤活性进行验证,通过IC50分析可知,含笑内酯即MCL对耐药白血病的杀伤效果明显。
1).MTT法检测含笑内酯对肿瘤细胞系杀伤的实验方法:
(1)从液氮中复苏冻存的肿瘤细胞系(HL60、HL60/ADR、K562、K562/ADR、K562/G、KG1a)。冻存细胞从液氮中取出后放入37℃水浴中,融化后立即1000转离心8分钟,用新鲜的1640培养基重悬。放入37℃细胞培养箱中进行培养。
(2)当细胞处于对数期时,收集一定量的细胞,调节细胞浓度为2.5×104/ml(即5×103cell孔/200μL)。按照每孔200μL加入至96孔板中,边缘孔用生理盐水填充。
(3)稀释MCL的浓度。原液为20mM,按照稀释浓度每孔加入一定体积的含笑内酯,每个浓度设置3个复孔,设置7个浓度。分别为50μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM、0.5μM、0。
(4)将加入含笑内酯后的细胞96孔板放置于37℃细胞培养箱,5%CO2培养72小时。
(5)将细胞悬液中每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml),放入细胞培养箱中继续培养4小时。
(6)将96孔板离心(1800转离心15min),小心弃掉上清,每孔加入150μL DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪上检测OD570nm测量各孔的吸光值。
(7)根据得出的OD值,用Prism5软件分析,计算得出MCL对肿瘤细胞系的IC50值。
HL60:人急性髓系早幼粒细胞系
HL60/ADR:人耐阿霉素急性髓系早幼粒细胞系
K562:慢性粒细胞白血病细胞系
K562/ADR:人耐受阿霉素慢性粒细胞白血病细胞系
K562/G:人耐受伊马替尼慢性粒细胞白血病细胞系
KG1a:人多药耐药急性髓系白血病细胞系
采用以上细胞系,对MCL对耐药白血病的效果进行分析。共采用耐药白血病细胞系4株,分别为HL60/ADR、K562/ADR、K562/G、KG1a。
2)、检测阿霉素对肿瘤细胞系杀伤的试验方法:
(1)从液氮中复苏冻存的肿瘤细胞系(HL60、HL60/ADR、K562、K562/ADR、K562/G、KG1a)。冻存细胞从液氮中取出后放入37℃水浴中,融化后立即1000转离心8分钟,用新鲜的1640培养基重悬。放入37℃细胞培养箱中进行培养。
(2)当细胞处于对数期时,收集一定量的细胞,调节细胞浓度为2.5×104/ml(即5×103cell孔/200μL)。按照每孔200μL加入至96孔板中,边缘孔用生理盐水填充。
(3)稀释阿霉素的浓度。按照稀释浓度每孔加入一定体积的稀释后的阿霉素,每个浓度设置3个复孔,设置7个浓度。分别为10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.01μM、0。
(4)将加入阿霉素后的细胞96孔板放置于37℃细胞培养箱,5%CO2培养72小时。
(5)将细胞悬液中每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml),放入细胞培养箱中继续培养4小时。
(6)将96孔板离心(1800转离心15min),小心弃掉上清,每孔加入150μL DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪上检测OD570nm测量各孔的吸光值。
(7)根据得出的OD值,用Prism5软件分析,计算得出阿霉素对肿瘤细胞系的IC50值。
3)结果分析:
由表一的结果可知,MCL对HL60的IC50为4.3μM,对HL60/ADR的IC50为6.25μM,由此我们可知MCL对HL60和HL60/ADR的IC50值比较接近,也即MCL对HL60/ADR有同样的杀伤活性。而对于临床化疗药阿霉素(ADR)来说,ADR对HL60的IC50值为0.0165μM,而对于HL60/ADR的IC50值4.85μM,对耐药的HL60细胞,ADR的杀伤能力降低了200倍,由此MCL的优势能够得到很好的表现。同时,对于K562和K562/A02细胞的杀伤方面,MCL也表现出了同样的优势。
表1:MCL对不同细胞系的杀伤
实施例2动物模型试验
实验步骤:
(1)取临床病人(耐阿霉素急性髓系白血病)的外周血,加入15mL的生理盐,1800转离心10分钟后,弃上清。沉淀用15mL生理盐水重悬。
(2)另外取一个无菌的50mL离心管,提前放入15mL淋巴细胞分离液,将重悬的细胞悬液缓慢成滴的加入到淋巴细胞分离液上。在慢升慢降的离心机上1800转离心15分钟。
(3)用滴管小心的吸出中间的白膜层,放入预制了20mL生理盐水的离心管中。1800转离心10分钟,后弃上清,用30mL生理盐水重悬,取出10μL进行细胞计数。
(4)用生理盐水调整细胞浓度为2.5×107/mL。
(5)将200μL细胞悬液通过尾静脉注射移植到经过250cGay照射的NOD/SCID小鼠体内(在照射小鼠后的6-12个小时内进行移植),每只小鼠移植细胞数为5×106/只。
随机分成5组,control组、A-25组、A-50组、A-100组、ADR组,每组14只小鼠,移植8周之后进行给药。
Control组:对照组小鼠给予同样体积的生理盐水。
A-25组:含笑内酯的使用浓度为25mg/Kg,口服给药七次后停止给药,隔天给药一次。
A-50组:含笑内酯的使用浓度为50mg/Kg,口服给药七次后停止给药,隔天给药一次。
A-100组:含笑内酯的使用浓度为100mg/Kg,口服给药七次后停止给药,隔天给药一次。
ADR组:采用临床常用的化疗药阿霉素(ADR),尾静脉给药(2mg/Kg),隔三天给药一次,共给药三次。
观察小鼠的生存期。结果如图1所示:
由图1可知,不同剂量的含笑内酯均能显著延长小鼠的生存期,且随着含笑内酯浓度的提高,小鼠的生存期能够明显的增加。而临床化疗药物阿霉素(ADR)却缩短了小鼠的生存期。由此可知,对耐药白血病病人,与临床化疗药阿霉素相比,含笑内酯有明显的优势。同时对死亡小鼠骨髓中的CD45+%进行分析后发现,如图2所示,图2中0-5%代表轻微白血病;5%-10%代表轻度白血病;10%-50%代表中度白血病;50%-100%:重度白血病。由图2可以看出,未患病小鼠0-5%的比例在使用了含笑内酯治疗之后有了明显的提高,而对照组和阿霉素组未出现未患病小鼠。同时在使用含笑内酯进行治疗之后中度患病小鼠和重度患病小鼠的比例显著下调。而对照组和含笑内酯组的中度患病小鼠和重度患病小鼠的比例却居高不下。由此可知,相对于临床常用化疗药阿霉素,含笑内酯对于耐药白血病的疗效有明显的缓解作用。
Claims (2)
1.含笑内酯在制备治疗耐药白血病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途。其特征在于:所述耐药白血病是针对临床常用化疗药物阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷、氨甲喋呤、伊马替尼或环磷酰胺中的一种或两种以上耐受的耐药白血病。
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