CN104379125A - 金环胡蜂毒提取方法及用此的功能性化妆料组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能性化妆品组合物制造用金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于，包括一系列连续实施过程：在储藏容器中放入乙醇浓度达15%～50%的乙醇溶液的提前准备过程；取所述乙醇溶液1L，然后从活着的金环胡蜂中选择15～100只工蜂，放入所述储藏容器，盖上盖子密封，使金环胡蜂掉进所述乙醇溶液中，致使金环胡蜂的行动变得迟钝的金环胡蜂投放过程；将此在阴凉处于室温下成熟6个月以上优选地成熟一年以上的成熟过程；将成熟的液体分离的成熟液分离过程。

Description

金环胡蜂毒提取方法及用此的功能性化妆料组合物

技术领域

本发明涉及利用金环胡蜂的功能性化妆品组合物的制造方法。具体是，为有效发挥金环胡蜂对皮肤保湿以及治疗粉刺等各种抗炎效果而开发的利用金环胡蜂的金环胡蜂毒提取方法及用此的功能性化妆料组合物。

背景技术

金环胡蜂的普通工蜂的大小一般达25～37mm，大小在韩国生长的大胡蜂类中最大，喜欢在人迹罕见之处挖地盖屋栖息，以植物汁液或蜂蜜等为食，夏天还吃各种昆虫类，冬季缺乏食物时喜欢攻击其它蜂箱，导致养蜂人一直视其为害虫。

尤其是，体格大，下巴厉害，皮坚固，毒针比一般蜂蜜强六百倍，连螳螂都很容易成为金环胡蜂的猎物。金环胡蜂一般在攻击普通蜂箱时，其攻击性非常强，一只可以杀死数百只蜂，而且人也不例外，被其毒针蜇几次，严重时还会导致死亡。

另外，最近最受瞩目的蜂毒方面的研究，已经摆脱仅在一部分使用的蜂针阶段，开始从蜜蜂甚至毒性较强的金环胡蜂在内的大胡蜂上提取毒，其毒实施中和以后用于疾病的治疗。

此蜂毒的主要成分为蛋白质，其抗炎效果可达抗生素(Mycin)的千倍，可用于治疗关节炎等已知疾病，还可以用于粉刺、黄褐斑、细纹等皮肤疾病的改善。

毒的强度达蜜蜂的550倍时会含有叫做缩氨酸(Peptide)的物质，经研究发现，这种成分对心脏心律不齐的症状有效，从几年前开始已在日本掀起大胡蜂热风。

但是，随着医疗和化妆品市场对这些蜂毒关注度的加大，政府或企业为提取蜂毒，免费提供装备，但一般以对通过蜂箱的蜂施加电气冲击的方法采集蜂毒，而且只能对蜜蜂有效，效率极低，利用几个月的时间提取量只有5g多。

因其生产性极低，蜂受到电气冲击，容易受到刺激而死亡，导致养蜂人不太愿意使用这种蜂毒采集器。

而金环胡蜂与蜜蜂相比，其毒性可达550倍，其毒性也可以发挥蜜蜂具有的各种功效，换言之，一只金环胡蜂的功效等于蜜蜂的550倍。

但金环胡蜂的危险性大，针的威力大，较长，可刺进一般厚度的衣服，专门提取工作人员在一只只提毒的过程中被蜇的概率极高，但是对从八月份开始缺食物进入侵养蜂户的蜂箱而造成较大损害的金环胡蜂进行抓捕后使用，可提高蜜蜂的生产量的同时获得更多收入。

(专利文献1)韩国专利公开第10-1000-0039050号(1999年06月05日)

(专利文献2)韩国专利注册第10-1018352-0000号(2011年02月22日)

发明内容

技术问题

本发明的目的在于开发一种皮肤容易吸收且直接产生刺激的成分被充分中和的状态下涂抹在皮肤后，可发挥皮肤保湿、抗炎治疗及美白效果的金环胡蜂毒提取方法及用此的功能性化妆料组合物，以解决上述问题。

技术方案

为实现所述目的，本发明提供一种金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于，包括以下一系列连续实施过程：在储藏容器中放入乙醇浓度达15％～50％的乙醇溶液的提前准备过程；取所述乙醇溶液1L，然后从活着的金环胡蜂中选择15～100只工蜂，放入所述储藏容器，盖上盖子密封，使金环胡蜂掉进所述乙醇溶液中，致使金环胡蜂的行动变得迟钝的金环胡蜂投放过程；将此在阴凉处在室温下成熟6个月以上优选地成熟一年以上的成熟过程；将成熟的液体分离的成熟液分离过程。

本发明还提供一种利用根据权利要求1所述的方法提取的金环胡蜂毒提取物的功能性化妆料组合物。

有益效果

如上所述，本发明的有益效果在于，利用皮肤保湿效果和抗炎以及美白效果突出的金环胡蜂制造液体，然后将此液体单独或与其它物质混合制成化妆品使用，提供一种治疗皮肤和改善皮肤状态效果尤为突出的功能性化妆品。

对皮肤的生态乃至色素均能发挥作用而达到美白效果。

最佳实施方式

下面对本发明的具体实施方式详细进行描述，以便本领域的技术人员容易理解和实现。

首先，其实施过程包括：在储藏容器中放入乙醇浓度达15％～50％的乙醇溶液的提前准备过程；取所述乙醇溶液1L，然后从活着的金环胡蜂中只选择15～100只工蜂，优选地1L以20只～80只左右的比例放入所述储藏容器，盖上盖子密封，使金环胡蜂掉进所述乙醇溶液中，致使金环胡蜂的行动迟钝的金环胡蜂投放过程；然后将此在阴凉处在室温下成熟6个月以上优选地成熟一年以上的成熟过程；将成熟的液体分离的成熟液分离过程。

此时乙醇的度数通过渗透压现象，使含有金环胡蜂的各种成分，在有限的时间内渗出，相反，乙醇成分渗入金环胡蜂，以防止腐蚀，作为实现缓慢成熟的必要条件，一般可以利用乙醇浓度15％～50％的乙醇溶液。本发明的实施例利用的是在市场上容易选购的泡酒(乙醇度数为30度)。

放入金环胡蜂是因为在未发现普通的金环胡蜂时，养蜂户用捕虫网等道具抓捕金环胡蜂，其数量有限且持续，需及时捕获以后放进去。

相反，未发现金环胡蜂时将活着的金环胡蜂一只一只地放进所述储藏容器中，盖上储藏容器的盖子之后，金环胡蜂掉进酒里，行动变得迟钝以后，再放进其它金环胡蜂，使相同的过程反复，以防一次放的数量太多而被蜇的现象。

此时之所以放入活着的对象，是因为死去的大胡蜂的蜂毒会迅速固化，以免提取的药效降低。

本发明的蜂毒提取对象只限于金环胡蜂，因为东方胡蜂、黄蜂、黑尾胡蜂、小型虎头蜂等用本发明的方式提取蜂毒，容易发生副作用，而且本发明的用途在于化妆品，所以本发明应注意大胡蜂的混入。

此后还可以包括加热本发明的所述分离的成熟液以减少乙醇浓度的乙醇分离过程。此时，在所述成熟过程中应防止光最少化的较暗处的内容物变质为宜，而在乙醇分离过程应减少所发生的一些味道和乙醇的量，以提升其作为化妆品材料的效用性。

所述的本发明的提出，可在现有养蜂户被金环胡蜂严重受害的状况下，获得本发明的效率的同时对金环胡蜂有效进行采集和销售，并减少因大胡蜂造成的蜜蜂收获量的损失，从而增加农户的收入。

如上所述，已知一般蜂毒的抗炎效果强达普通抗炎剂即Mycin的1000倍左右，而且皮肤上的粉刺和黄褐斑等也属于一种炎症，涂上根据本发明的提取的液体后，随着乙醇的蒸发，毛孔打开，蜂毒渗入皮肤而对各种粉刺和黄褐斑等所发挥的效果突出。

一般化妆品等外用剂是身体较健康的普通人的长期使用产品，有别于以治疗特定疾病为目的使用一段时间的医药品类产品，而且医药品除了治疗效果之外，还需考虑其副作用才能决定其价值，但化妆品是其安全性得到绝对保证以后才能研究其有效性，必须进行至今为保证化妆品原料和完成品的安全性而利用人体皮肤进行的试验为宜。

因此，采用本发明的提取物对人体皮肤发生初级刺激、眼睛粘膜刺激试验，以证明组合物的有效性，对人体皮肤的美白效果也进行试验后发现本发明的组合物对人体皮肤确实具有美白效果。

在以下实验例中，根据本发明的方法，将40只金环胡蜂(工蜂)放入1.8L的泡酒(乙醇度数30度)中，在室温下成熟1年并使用从中提取的金环胡蜂毒分别制造精华素和乳霜化妆品进行了试验。

1、〔三种金环胡蜂毒化妆品的人体皮肤一次刺激试验〕

1)试验背景

一般化妆品等外用剂是身体较健康的普通人的长期使用产品，有别于以治疗特定疾病为目的使用一段时间的医药品类产品，而且医药品除了治疗效果之外，还需考虑其副作用才能决定其价值，但化妆品是其安全性得到绝对保证以后才能研究其有效性。

包括化妆品在内的外用剂可诱发的皮肤反应，根据其症状样态，可分为急性接触性皮炎(Acute Contact Dermatitis)、刺激性接触性皮炎(Irritant Contact Dermatitis)、变应性接触性皮炎(Allergic Contact Dermatitis)、光毒性皮炎(Phototoxic Contact Dermatitis)、光变应性接触性皮炎(Phototoxic Contact Dermatitis)、接触性荨麻疹(Contact Urticaria)及炎症反应的引发皮肤不适感的肉眼观察不到的现象即主观刺激感(Sensory Iritation)和粉刺、皮肤变化(Hyper/Hypopigmentation)、局部副作用、精神性副作用等。

至今以来，为确保化妆品原料和成品的安全性，一般利用人体皮肤和动物进行了试验。

利用人体皮肤的试验的优点在于，可在实际使用条件下观察皮肤刺激的优势，但是因时间上的需求、受试者之间的个体差异、试验人主观要素的介入、刺激性强的物质对受试者带来痛苦、对刺激水平低的物质进行比较时只经过一次接触其差异不明显等有限因素，利用人体进行试验先利用动物进行了试验。

但是在化妆品开发阶段的动物试验从环保和保护动物的角度，容易受到社会的遣责，在欧洲的ECCD(European Community Cosmetics Directive，欧盟化妆品指令)六次修订案中，已从1998年开始停止对原料和产品的动物试验，决定分阶段应用可取代的试验法，根据‘EUCosmetic Direct 7号’条款，对于皮肤刺激(Skin irritation)、光毒性(Phototoxicity)、皮肤吸收(Dermal absorption)、腐蚀皮肤(Skin corrosivity)、诱变力(Mutagenicity)、眼刺激(Eye irritation)等，从2009年开始禁止实施动物禁止法，从2013年开始对全身毒性(Systemic toxicity)部分禁止实施动物实验禁止法。

随之，迄今在全世界范围内对体外实验(in vitro)试验法进行了开发，为在实际产品开发上应用此种方法，各国都持续展开有关方面的研究加以确认。

但一直以来，因体外实验(in vitro)取代试验或动物试验法无法正确反映人体皮肤的机制的问题，人体试验是必须进行的。

2)试验目的

本试验是为确认原料和化妆品对人体皮肤有无初级刺激而进行。

3)试验机构

-机构名称：(株)专业皮肤(DERMAPRO)/皮肤科学研究所

-地址：首尔市瑞草区方背洞919-1号

4)试验时间

2011年07月25日～2011年07月28日

5)试验物质

表1

名称由赞助商提供(Name of test materials supplied from sponsor)

编号*：试验物质涂敷顺序

*金环胡蜂毒化妆品35：精华素化妆料组合物中金环胡蜂毒提取物35重量％。

*金环胡蜂毒化妆品50：精华素化妆料组合物中金环胡蜂毒提取物50重量％。

*金环胡蜂毒化妆品100：金环胡蜂毒提取物100重量％。

6)试验方法

6-1试验对象

选择30多名符合受试者选择标准及其它标准的18岁～60岁之间的男性或女性为对象进行了试验。

每个志愿者在遵守细节的书面同意书上签字，用数字加上了固有编号。

6-1-1选定标准

选择下述条件的志愿者作为试验对象组。

①18岁～60岁之间无疾病的男、女性

②试验之前认真倾听试验目的和内容等，自愿在书面同意书上签字的志愿者

③试验期间努力协助实验上的需求事项，有异常症状时可及时联系者

④试验期间，可跟踪观察的志愿者

6-1-2排除标准

对于符合下述项目的志愿者，从试验对象组中排除。

(1)妊娠或哺乳期或六个月以内有怀孕计划的女性

(2)试验部位有纹身、伤疤、汤伤等痕迹而阻碍评分者

(3)阻碍感染性皮肤疾病或其它试验目的的皮肤疾病患者

(4)正在服务中的治疗药物对皮肤反应有影响者

(5)对于化妆品、医药品或日常光照射，容易受到刺激或有过敏症状者

(6)皮肤属于特应性皮肤者

(7)正在服用避孕药、抗组胺药、消炎药物者

(8)有毛孔角化症或皮肤划纹症者

(9)对于贴片用胶布，容易产生刺激反应或过敏症状者

(10)同时参与其它试验者

(11)参与之前的相同试验的时间未过4周者

(12)除了其它的上述事项之外，根据临庆试验负责人的判断不能进行临床试验者。

6-1-3限制事项

①受试者在贴着贴布的期间，做到试验部位(背)不沾水。

②让服用治疗身体的药物或使用者通知试验负责人。

6-1-4试验对象数或计算依据

根据功能性化妆品等审查规定的毒性试验法第七项(1)人体贴布试验方法，选择30名以上受试者施行了试验。

6-1-5试验中止及淘汰标准

对于在本试验过程中不遵守试验日程的受试者，询问是否继续参与之后决定是否中断，对于其它发生副作用、无法跟踪观察和违反协议者决定停止试验。

①原同意临床试验的受试者又表示不同意

②试验的过程中因试验物质严重产生副作用者

③因突发事故或患上疾病百无法进行试验者

④根据其它试验人的判断，认为不适合进行试验

6-2试验材料

智商室(IQ chamber):化学技术诊断有限公司(Chemotechnique Diagnostics AB)(瑞典)微孔磁带(Micropore tape):3M/医疗外科部门移液器(Medical-Surgical Division Microman)(M250):吉尔森(Gilson),法国

打标记笔(Marking pen):皮肤标记苗条(Skin marker Slim)(瑞典)

6-3试验方法

①将试验部位用70％乙醇清洁之后使之干燥。

②直接使用委托人提供的试验物质。

③取20L试验物质装入IQ chamber以后，放在试验部位等部位，用微孔磁带(microporetape)固定住。

④贴布贴48小时，摘下贴布之后，用皮肤市场(skin market)在试验部位上做出标志，过30分、24小时以后对各试验部位进行观察。

6-4判定标准

摘除贴布以后过30分、24小时时实施观察，对于皮肤反应，根据弗罗施&克里门(Frosch&Kligman)法和反映美国化妆品、盥洗品和芳香品协会(The Cosmetic、Toiletry、and FragranceAssociation；CTFA)的指导原则(guideline)的表2的标准实施了评价。

表2

记录补丁测试反应(Recording of patch test reactions)

6-5结果计算方法

对于48小时和72小时的平均反应度进行了比较，以对各物质的平均反应度为准，对其结果进行了判定。

7)试验结果

7-1试验对象

共31名全程参与本试验。

受试者的平均年龄为40.9±9.5岁，最高年龄达53岁，最低年龄为20岁。

以问卷调查的方式对试验对象的皮肤特性进行了调查，其结果见表3。

表3

志愿者的皮肤特点(Skin characteristics of volunteers)(n＝31)

皮肤特性	频率(数)	比率(％)
			干性皮肤	11	36.67
中性皮肤	16	53.33
			油性皮肤	3	10.00

干油性皮肤	1	3.33
			问题皮肤	0	0.00
其它皮肤疾病	0	0.00
			对刺激的感受性	3	10.00
对灼热感的感受性	1	3.33
			化妆品副作用(一年以内)	0	0.00
金属过敏(镍过敏)	9	30.00
			光敏感性	2	6.67
幼儿湿疹、特应性经验	0	0.00
			拉的感觉	6	20.00

7-2结果

试验物质#21、#22、#23在试验期间达4～7名受试者产生了1+grade的皮肤反应(表4)。

表4

表4：人皮肤原发性刺激试验结果(Results of human skin primary irritation test)(n＝31)

编号*：试验物质的涂敷顺序

8)结论

试验物质#22在作为人体皮肤初级刺激水平的中度刺激、其它试验物质(#21、#23)是轻度刺激范畴内的物质进行了判断。

而且，发明人向韩国化学融合试验研究院也委托皮肤刺激性试验(GLP)以‘食品医药品安全厅告示第2009-116号’的方法进行试验的结果，本试验物质没有诱发红斑、结痂、浮肿等现象，P.I.I指数为“0.0”，故被判断为非刺激性物质(Non irritant)。(报告编号：TBH-000407)

2.[眼睛粘膜刺激性试验(GLP)]

发明人向韩国化学融合试验研究院委托进行眼睛粘膜刺激性试验(GLP)，并按照‘食品医药品安全厅告示第2009-116号’的方法试验的结果，被判定为“本试验物质诱发了结膜的眼睛刺激”，I.A.O.I指数在非清洗组和清洗组显示指数全部为‘0.7’而评为‘无刺激物’。(报告编号：TBH-00048)

之所以进行所述眼睛粘膜刺激试验，是因为化妆品不论其用途是什么，其成分通过手或其它原因进入眼睛的概率极高，对皮肤无害，但对眼睛有害则作为化妆品仍应判断为存在危险性，因此进行了试验。

3.[以美白功效评价为目的的人体试验]

1)绪论

肤色会根据性别、个体差异、年龄、地区、季节和身体部位或者健康状态或压力等情绪出现变化。一般女性比男性，年轻人比老年人存在更多色素。

人的肤色是根据黑色素(melanin)、胡罗卜素(carotene)和血红蛋白(hemoglobin)的量决定，其中在黑色素细胞(melanocytes)中合成的黑色素为最大的决定性因素。

黑色素在皮肤表皮(epidermis)的基底层(basal layer)中存在的色素细胞即黑色素细胞中合成后转移到周边角质细胞(keratinocytes)。

已知黑色素是在酪氨酸(tyrosine)被酪氨酸酶(tyrosinase)变成(3,4-二羟基苯基)-丙氨酸(DOPA)、红痣素(DOPAchrome)等的复杂的化学变化过程生成。

黑色素的生产异常地少会发生低色素病变。

相反，生产过多会形成女人感到皮肤困扰的原因之一即黄褐斑和雀斑，甚至与皮肤癌(melanoma)也有密切关系。

黑色素是色素和蛋白质的复合的即苯酚物质，分为在神经细胞中合成的神经黑色素(neuronal melanin),和在皮肤、毛囊、眼睛等部位存在的皮肤黑色素(cutaneous melanin)。

美白化妆品使用的比较典型的美白成分有熊果苷(Arbutin)、曲菌酸(Kojic acid)、抗坏血酸维生素C(Ascorbic acid)等。

大部分的美白成分阻碍酪氨酸酶(tyrosinase)的活性，抑制黑色素色素的形成，或还原生成的黑色素色素而产生美白效果。

利用人体的美白试验包括以下两种方法。

第一、对自然生成的过度沉着色素的部位(例：黄褐斑)使用试样以测定美白效果的方法；第二、对皮肤照射紫外线，以人工方法使色素沉着以后使用试样以测定美白效果的方法(人工色素沉着法)。

利用自然发生的过度沉着色素部位、黄褐斑部位等时所需时间较长，而且具有过度沉着色素部位的受试者也不好找，但有利于测定出实际美白效果。

但是，利用人工色素沉着的美白效果测定方法是，只需两三个月的时间即可确认试样的美白效果，受试者也相对地容易寻找，因此目前很多研究室都利用人工色素沉着法实施美白试验。

本研究是以人工色素沉着法实施了试验，利用分光光度计(Spectrophotometer)和色素皮肤分析仪(Mexameter)测定肤色的同时由皮肤科专家医师并行肉眼评价而评价试样的美白效果。

为了将委托人提供的试样‘[J-007]’的美白效果与对照试样进行比较评价，对受试者的前臂内侧照射紫外线，以人工方法使色素沉着部位生成。

将试样的对照试样分别利用八周的时间在试样的指定使用位置，由受试者自己每天涂两次该试样，涂试样位置是由受试者随意选定，在双盲(double blind)条件下进行了研究。

2)研究方法

2-1)研究目的

在韩国女性成人受试者的前臂内侧诱发人工黑化之后，利用八周的时间使用试样(根据本发明的方法提取的金环胡蜂毒提取物)和对象试样的同时对试样的皮肤美白效果进行了评价。

5-2)概要

为了将美白功效与对照试样进行比较评价，招募了二十名以上的成人女性受试者。

在受试者的前臂内侧皮肤照射紫外线，诱发人工黑化之后，利用八周的时间涂试样和对照试样的同时并行实施了仪器测定和肉眼评价。

2-3)日程和程序

本试验的具体日程如表5所示。

表5

本试验的试验程序如表6所示。

表6

2～4)受试者

2-4-1)受试者的招募和选定方法

向受试者明确说明实验目的和方法以后，由受试者自由决定是否参与，然后在参加同意书上签字之后参与实验。具体程序如下。

-IEC KOREA(株)通过事先进行的受试者招募调查(体格检查、Medical examination*)确保适合的受试者加以管理。

-临床试验计划确定下来以后，从IEC韩国(株)的受试者数据库中自动选择符合本临床试验受试者条件的受试者。

-向被选的受试者随机地打电话，说明临床试验的具体内容，使同意试验内容的受试者在试验第一天来本公司。

-试验第一天，应用按研究目的和方法适当组成的问卷(受试者的选定与排除条件)，由研究负责人(皮肤科专家医师)最终选择拟参与本研究的受试者。

最终选定受试者的问卷调查纸上将受试者选定条件、排除条件、制约事项等内容根据研究内容适当地进行编制，该问卷调查是在开始研究之前进行。

-向受试者说明研究日程、参与费用、可预测的危险性(搔痒症、色素沉着脱失等)、中途淘汰标准。

受试者根据说明内容，自由决定是否参与试验之后在参加同意书上签字。

受试者发生副作用时，委托人根据合同书上注明的受试者补偿规定，说明可以适当获得补偿。

-参与本试验的受试者的隐私受到保护。

但告知根据医学目的，在不公开受试者身份的范围内利用试验资料。

-在临床试验参与同意书上签字的受试者开始进行试验。

*体格检查(Medical examination)：根据IEC KOREA(株)的普通受试者选定和排除条件，与受试者进行面谈、招募以后在数据库上注册。

2-4-2)参与试验的受试者数

根据委托人的申请招募了25名的受试者。

2-4-3)选定条件

2-4-3-1)受试者数据库上应用的一般选定条件

-韩国女性

-体重：以在数据库注册为目的的招募调查中不予以考虑，选定各具体研究的最终受试者时，由研究负责人对可能影响研究的受试者进行判断和排除。

-可以理解韩国语，可以阅读所提供的文件，或听取研究人员的说明以后可以理解

-已购买国民健康保险者

-脊柱严重扭曲或弯曲者被排除

*此一般事项不在病例报告表(Case Report Form)上单独记录。

2-4-3-2)人工色素沉着以后，在美白功效评价试验中适用的受试者选定条件

将以下选定条件，在试验开始日由皮肤科专家医师对受试者进行问卷调查，然后记录在病例报告表上。

-理解研究内容，且自觉编制临床试验参与同意书后签字者

-身体健康无急、慢性疾病者，包括皮肤病

-光皮肤类型符合II,III和IV者(表7)

-周岁18岁以上60岁以下的成人女性

-试验期间可跟踪进行观察者

表7

按照菲茨帕特里克(FITZPATRICK)的光皮肤类型问卷调查方法选择适合人工黑化的光皮肤类型为II、III、IV的受试者。

2-4-4)排除条件

2-4-4-1)在受试者数据库上应用的一般排除条件

-生活上受法律限制者

-有严重疾病者

-未成年人或根据国内法不能参与临床研究者

-IEC KOREA(株)的干部职工

-不能紧急联络，或者试验期间无法响应招集者

-符合以下条件者

·试验期间重复参与多项临床研究者(可能重复参与者)

·重复参与试验的限制期限未过者：参与同样类型试验以后未过六个月者

·健康状态:本条件是可确保受试者安全的条件，须严格执行，并通过问卷调查确认。

·妊娠期或哺乳期女性，或者采用从医学角度上不适当的避孕方法者

·最近五年内接受器官(肝、肺、肾脏等主要器官)移植手术，或者接受器官切除手术者、接受脑手术者、有手术后遗症者

·有心血管系统疾病、内分泌系统疾病、消化系统疾病、神经系统疾病和泌尿系统疾病者

·长期服用或者正在适用抗组胺药物、类固醇、过敏抑制剂或者具有类似功能的药品者

·有严重哮喘者

·有药物过敏史者，可能对实验室使用的物质(手套、粘贴剂等)过敏者

·具有以下皮肤疾病者：荨麻疹(urticaria),浮肿(oedema),湿疹(eczema),复发性疱疹(recurrent herpes),过去3个月内爆发过带状疱疹(herpes zoster having erupted in the last 3months),斑色的玫瑰糠疹(pityriasis versicolour),一个突然增加的炎症或结节或囊肿性痤疮痤疮(common acne with a sudden rise of inflammation or nodular or cystic acne),牛皮癣(psoriasis),鱼鳞癣(ichthyosis),扁平苔癣(lichen planus),慢性红斑狼疮(chronic lupuserythematosis),瘢痕疙瘩(keloid scars),严重的色素沉着症(severe pigmentation disorders)(白癫风(vitiligo),黄褐斑(chloasma),多个雀斑(multiple lentigines),众多或先天性色素痣(numerous or congenital nevi),特别是大尺寸的),多汗(hyperhidrosis),背部多发(dorsalhyperpilosity)

·有免疫系统疾病或正在接受免疫抑制剂治疗者

·一天抽烟数量达10根以上，或者每天喝酒量达三杯以上者

-皮肤属于敏感类或特应性皮肤类型者

*在临床研究上编制的病例报告书(Case Report Form)上没有记录此一般排除条件。但是，重复参与试验限制期限和当前健康状态等是在病例报告书上予以记录。

2-4-4-2)人工色素沉着以后，在美白功效评价试验上应用的受试者排除条件试验开始日由皮肤科专家医师对于以下选定条件向受试者进行询问，并在病例报告书上进行记录。

-正妊娠期或哺乳期，或三个月内有怀孕计划者

-有精神疾病或皮肤疾病者

-有哮喘、糖尿病、高血压等慢性消耗性疾病者

-为治疗皮肤疾病而将含类固醇的皮肤外用剂已使用一个月以上者

-皮肤属于敏感、过敏或特应性皮肤类型者

-有光变态反应或光敏化病历者

-参加同样试验并未过六个月者

-研究开始之前三个月内在试验部位使用同样或类似化妆品或医药品者

-研究开始三周以内参与使用同样试验部位的其它试验者

-光线照射部位有点、粉刺、红斑、毛细血管扩张等皮肤异常症状者

-最近五年内接受器官移植手术或切除手术者

-最近三周内长时间服用中药(补药)者

-有消化系统、免疫系统、心血管系统、内分泌系统、泌尿系统疾病者

-对药物反应敏感或对实验上通常使用的物质有过敏反应经历者

-研究开始之前六个月以内接受试验部位的皮肤疾病治疗经历者

-最近八个月以内发生过持续24小时以上发高烧者

-最近一个月以内打过预防针，准备在或者试验期间打预防针者

-其它根据研究负责人员的判断不适合试验者

2-4-5)限制条件

-试验期间被受试者限制的事项

-试验期间禁止服用或使用阿司匹林、抗炎药物、抗组胺药、类固醇(包括中药)药物。

-试验期间禁止打预防针或接受免疫抑制剂的治疗。

-试验期间在试验部位上除了被提供的本试样之外不能使用其它美白化妆品。

-避免试验部位暴露在阳光下。

-必须按时涂试样，不能错过。

-试验期间不进行有违日常生活规律的活动。

2-4-6)受试者义务事项

为保护受试者和正确进行研究而受试者须遵守的事项

-遵守试样的使用方法、限制事项以及其它检验日程和访问日程。

-对试验期间在自己身上发生的所有疾病和症状详细进行报告。

-试验结束为止，对本试验的信息进行保密。

-认真诚实地填写与试验有关的资料。

2-4-7)研究进行途中受试者淘汰标准

即使是根据受试者的选定和排除标准选定的受试者，但试验过程中发生以下淘汰标准时，根据主管负责人和研究人员判断，在试验结算核算中予以排除。

-试验期间三天以上未涂试样时，以不履行受试者义务事项为由从研究中排除。

-紫外线照射部位有瘙痒感或出现红斑等有害现象

-试验途中发生不可预测的有害现象或副作用

-试验途中试验部位过度地暴露在紫外线下，或者饮酒、吸烟等而影响准确评价

-接受可能影响研究内容的其它治疗

-受试者自己撤回同意参加

-受试者不能跟踪观察

-发生由于受试者个人原因引起的淘汰标准

-研究负责人判断受试者不能继续进行试验

-受试者不遵循试验的限制条件或义务事项

2-4-8)有关受试者的人体试验进行规定

-在进行试验的过程中，临床试验负责人和研究负责人须尽全力保障受试者的人身安全，发生任何有害现象，须迅速采取措施，将其有害现象减少到最小。

-进行试验的过程中受试者报告因试样皮肤有刺激反应或有害现象时，就开始擦掉涂的试样，症状仍然没有好转，则接受皮肤科专家医师的适当评价和治疗。

-因紫外线照射过度而在皮肤表面上发生伴随水泡的红斑时，应安排其适当接受皮肤科诊断和治疗。

-发生其它非正常的皮肤反应时，临床试验负责人和研究负责人进行皮肤科评价同时采取适当措施，对病例和状况详细进行记录。

2-5)试样

2-5-1)试样信息

-名称(试样代码)试样：[J-007](试样A)

含主要成分的试样(以下用“试样”或“试样A”标记)

*利用以上提出的方法，将提取的金环胡蜂毒提取物制造成乳霜，并作为试样提供。

-对照试样：[J-008](试样B)

未含有主要成分的试样(以下用“对照试样”或“试样B”标记)

-按以上方法向委托人领取试样。试样信息的确认是试验结束后填写报告之前向委托人领取。

性状试样：乳霜状

对照试样：乳霜状

试样管理编号试料：A2122(试样A)

对照试样：A2123(试样B)

-领取试样以后在IEC KOREA(株)登记试样加管理编号后在试样上贴上标签。

-分析：委托人应确认试样是否正确，提供有关试样的信息(性状等)。IEC KOREA(株)未进行鉴定试样的稳定性、物理特性的化学分析。

-容器(或包装状态)：泵式塑料容器

-领取的试样量：试样25个，对照试样25个

-领取日期：2011年09月29日

-保存方法：避开高温和光线照射，在5～25℃之间的温度下存放。

IEC KOREA(株)将试样自报告书签发之日起存放180天，委托人没有其它要求的情况下废弃。

2-5-2)试样的使用方法

使用方法如下。

-试样的使用位置：前臂内侧的人工黑化部位

(各试样的使用部位可随机安排)

-试样使用量：适当量

-试样使用周期：一天两次(早，晚)

-试样使用期限:八周

-试样使用方法：受试者在自家，将指定的试样涂在自己指定的位置。注意避免人工黑化部位，或者用涂试样的手指涂其它试样。

2-5-3)试样的有效成分

-试样名称：[J-007]

-成分名称：大黄蜂提取物(Hornet Extract)

-含量(％)：33.3％

2-6)试验原理及装备

2-6-1)试验原理

在皮肤上照射紫外线，则皮肤的黑色素细胞活性和黑色素生成增加而肤色变黑。随着时间的推移，黑色素细胞的活性逐渐正常，黑色素逐渐减少而恢复原来的肤色。涂具有美白效果的物质后，因美白物质的活性，黑色素减少和黑色素细胞的活性更加快速减少而肤色的恢复速度更加加快。将具有美白效果的物质和非美白物质，在同样条件下涂一定时间后，用色差计测定肤色，并由受训练的专家来并行实施肉眼判定，对美白效果进行比较和确认。

2-6-2)紫外线照射装置(Solar simulator)

进行试验期间，为利用质量均衡的紫外线而使用人工紫外线照射装置(Solar simulator),以与太阳光线类似的辐射光谱，装配在特定波长不发生峰值的氙弧灯(xenon arc lamp)的紫外线照射装置(Solar simulator)。

用于试验的紫外线照射装置(Solar simulator)的机型为多端口的太阳模拟器(Multi-portsolar simulator)601(Solarlight co.,US),其特征如下。

-装配300瓦特氙弧灯(watt xenon arc lamp)，通过六个液体光导(liquid light guide；LLG)，以直径达8mm大小的圆形放射紫外线。通过六个LLG放射的紫外线的强度是通过在各LLG上端装配的光圈，可单独进行调节。2mm厚的肖特wg320滤波器(Schott WG320filter)和ug11滤波器(UG11 filter),除去紫外线C和可视光线区的波长之后使用。

2-6-3)光量测定仪(PMA2100UV meter)

本研究使用的光量测定仪为PMA 2100 UV meter(Solarlight Co.,US),D在紫外线照射装置LLG的末端结合紫外线传感器(UVB sensor)(PMA 2103)之后测定光强度。测定值以MED/min单位表示。1.0MED/min是与21Mj/cm2相同的光能。光强度是在向各受试者照射紫外线之前测定并在病例报告上进行记录。

2-6-4)使用分光光度计(Spectrophotometer)测定肤色

使用分光光度计(Spectrophotometer)CM2600d(Minolta,Japan)仪器测定肤色。此仪器放射白色光线，测定在表面反射的光线，将颜色按CIE颜色标准表达。测定值以L*a*b*值表示。L*是表示明度的值，肤色越透亮，值越高。a*是表示皮肤红-绿，b*表示皮肤的黄-蓝。分光光度计(Spectrophotometer)的探测器(probe)定为3mm，将自动测定三次以后显示的平均值作为有效数据加以利用。

2-6-5)使用色素皮肤分析仪(Mexameter)MX18测定黑色素指数(Melanin index)

色素皮肤分析仪(Mexameter)MX18(Courage+Khazaka GmbH,Germany)是只利用窄段波长的肤色测定仪(Narrow-band reflectance spectrophotometer),适合测定皮肤的黑色素和血红蛋白量。测定值以黑色素指数(Melanin index、MI)和红斑指数(Erythema index、EI)表达。EI是以反射光的红色和绿色波长的比率为基准计算，MI是以整体反射光中红色光的比率计算。色素皮肤分析仪(Mexameter)MX18是利用放射绿色光和红色光的二极管，用计算机计算仪器上放射的光线的总量和反射的光线量而显示结果。

本试验是利用色素皮肤分析仪(Mexameter)MX18反复三次测定MI之后，将其平均值作为有效数据利用。然后将各测定结果在病例报告上记录下来。

2-7)试验过程

2-7-1)决定最少红斑量(MED)

根据用紫外线照射装置太阳模拟器(Solar simulator Multiport)601(Solarlight Co.,USA)对皮肤照射紫外线以后确认最少红斑量的已知研究结果(表8)，决定根据肤色(ITA°)的最少红斑量。用肤色测定仪(SpectrophotometerCM2600d)测定被选受试者的前臂内侧肤色。

表8

用分光光度计(Spectrophotometer)测定的肤色和最少红斑量

*最少红斑量是根据IEC KOREA(株)面向韩国进行的现有同类研究结果决定，并使用本研究机构使用的紫外线照射装置和光量测定仪，在相同条件下照射紫外线。

2-7-2)诱发人工色素沉着

以对受试者决定的最少红斑量为准对受试者的前臂内侧照射紫外线。光量的强度为定为2.0MED/min,试验部位是避开毛过多或肤色有相差的部分，选择了干净平坦的部位。决定最少红斑量之后分三次累计照射0.5～3.0MED的紫外线。紫外线照射量根据各受试者的黑化程度有差异，黑化程度是根据研究人员的肉眼判定以及分光光度计(Spectrophotometer)CM2600d的L*相差值(黑化后-黑化前)决定。(表9)

表9

在前臂内侧照射的紫外线量(根据Spectrophotometer CM2600d的L*相差值)

*两、三次照射日L*值比初始值大3以上，或者肉眼观察到黑化时，或者观察到严重红斑或水泡等时，根据研究人员的判断省略紫外线照射。

从三次紫外线照射日过六天后，用分光光度计(Spectrophotometer)测定人工色素沉着的肤色后，对L*(明度)值与黑化前相差达到1的受试者或用皮肤科专家医师肉眼观察到黑化的受试者开始涂试样。

2-7-3)测定与肉眼评价

在没有空气的移动和光线照射，保持怛温怛湿条件(22±2℃，50±5％)的空间保持一定照明度。受试者最少15分钟的时间采取皮肤稳定以后实施测定和评价。

2-7-3-1)使用分光光度计(Spectrophotometer)实施仪器评价

人工色素沉着前、人工色素沉着后涂试样前、涂试样四周后和八周后，对每个部位分别三次反复(auto condition)测定试验部位的L*a*b*值。

2-7-3-2)肉眼评价

由两名皮肤科专家医师根据肤色评价基准表(Intensity score table)对试验部位的肤色进行肉眼评价。肤色评价基准表是根据肤色，从1分(亮、透)到10分(黑、暗)的数字显示肤色的亮度。各分数之间分数设定为0.5分。肉眼评价是在人工色素沉着前、涂试样前、涂试样四周后和八周后实施。

表10

利用肤色评价标准表(Intensity score table)实施肉眼评价(Visual assessment)

2-7-4)拍摄照片

在为拍摄照片而临时准备的照片室(Orion400strobo,Aurora light bank,Korea)，用数字照相机(Nikon D90digital camera,Japan)进行拍摄。对受试者的姿势、对象与相机之间的距离、角度、照度、暴露、光圈值等拍摄条件进行设定以后，由相同研究人员拍摄照片，获取一定质量的照片。

2-7-5)受试者最终评价问卷

使用试样八周以后，由研究负责人向受试人关于试样对皮肤的适宜性和化妆品的效果进行认询问，以五分为基准进行评价。

2-7-6)皮肤科专家医师的皮肤稳定性评价

由皮肤科专家医师对试样使用前、试样使用四周后和八周后的试样稳定性进行了评价。与试样的使用有关的表面症状(Physical signs:erythema,oedema,dryness,desquamation…)是用肉眼检查，对受试者的自觉症状(functional signs:prickling,tightness,local heat,…)进行诊断，在病例报告上记录之后判定与试样的相关性。

2-7-7)数据分析和结果解释

2-7-7-1)仪器测定结果

-使用分光光度计(Spectrophotometer)求肤色的明度值L*和ITA°。求出使用试样之前和使用试样之后的相差值(△L*，△ITA°)，对试样和对照试样进行统计显著性检验。

-使用色素皮肤分析仪(Mexameter)测定黑色素指数。求出使用试样之前和使用试样之后的相差值(△MI),对试样和对照试样进行统计显著性检验。

-试样和对照试样之间的肤色变化值显示出统计显著性差异时，解释为试料有美白效果。

2-7-7-2)肉眼评价结果

-用肉眼评价获取的结果是，求出使用试样前和使用试样之后的肉眼评价相差值，对试样和对照试样进行统计显著性检验。(△值)

-由两名研究人员在统计上显示出显著性差异时解释为试样有美白效果。

2-7-7-3)统计分析方法

统计分析程序是使用SPSS14.0。用夏皮罗一威尔克(Shapiro-wilk)test1对仪器测定结果与肉眼评价结果数据的正态性分别进行检验。

试样vs.对照试样

-符合正态性(p>0.05):Paired t-test(p<0.05)

-不符合正态性(p<0.05):Wilcoxon test(p<0.05)

3)试验结果

3-1)受试者的组成

招募25名符合本研究的基本选定条件的成人女性。试验第一天，根据皮肤科专家医师对受试者的选定和排除条件，选择25名适合受试者开始进行试验，但试验期间有两名受试者被淘汰而最终有23名(平均年龄为37.5岁)获取了有效数据。(表11)

表11

*Dropout:No.03:不遵守研究内容(D28,因登山，试验部位恶化)

No.17:根据研究负责人的判断排除(黑化不足)

表12

3-3)肤色亮度(L*)测定结果

对使用试样四周后和八周后的试样使用部位肤色亮度(L*)进行测定结果，比使用试样之前都变亮，使用试四周后和八周后试样之间显示出统计上的显著性差异，使用试样A部位的肤色亮度改善程度优于使用试样B的部位。(p<0.05).(表13，表14)

表13

使用试样前、后肤色相差值，△L*(Dx-D0)

[A]:[J-007],[B]：对照试样

△L*mean±S.D.使用试样前后L*的相差值，值越大，肤色比使用试样之前更亮。

p-值:重要的概率(Significant probability),配对(Paired)t-test(p<0.05:使用试样部位和使用对照试样部位显示出显著性差异。)

表14

△L*(Dx-D0),使用试样前后肤色相差值

[试样]：[J-007]

△L*(Dx-D0):值越大，肤色比使用前更亮

*由成对的显著差异t-体验(Significant difference by Paired t-test)，p-value<0.05

3-4)ITA°测定结果

使用试样四周和八周后对使用试样部位的肤色ITA°进行分析的结果，均比使用试样之前变亮，使用试样八周后，试样之间显示出显著性差异，使用试样B的部位ITA°增加量优于使用试样B的部位(p<0.05)。(表15，表16)

表15

使用试样之前、后(Dx-D0)肤色，△ITA°

[A]:[J-007],[B]:对照试样

△ITA°mean±S.D.使用试样前后ITA°的相差值，值越大，肤色比使用试样前更亮。

p-值:显着的概率,成对(Paired)t-test(p<0.05:使用试样部位和使用对照试样部位显示出显著性差异。)

表16

△ITA°(Dx-D0)，使用试样之前后出现的肤色相差值

[试样]：[J-007]

△ITA°(Dx-D0):值越大，肤色比使用前更亮

*经配对t检验差异显著(Significant difference by Paired t-test)，p-值<0.05

3-5)黑色素指数(Melanin index)测定结果

对使用试样四周和八周后的试样使用部位肤色的黑色素指数进行分析的结果，均比使用试样前变亮，但试样之间没有显示出显著性差异。(表17，表18)

表17

使用试样前后的(Dx-D0)黑色素指数

[A]:[J-007],[B]:对照试样

△MI mean±S.D.△MI:使用试样前后黑色素指数的相差值，减少量越大，肤色越亮。

p-值:显着的概率(Significant probability),成对(Paired)t-test(p<0.05:使用试样部位和使用对照试样部位显示出显著性差异。)

表18

△黑色素指数(Melanin index)(Dx-D0),试样使用前后出现的相差值

[试样]：[J-007]

△黑色素指数(Melanin index)(Dx-D0):减少量越大，肤色越亮。

3-6)专家的肉眼判定结果

由两名专家对使用试样四周和八周后的肤色进行肉眼评价结果，第一评价者评价出使用试样部位的肤色在试样之间没有出现显著性差异，而第二评价者评价出，从使用试样四周后开始，使用试样A的部位肤色比使用试样B的部位明显亮(p<0.05)。(表19，表20)

表19

使用试样前、后的肉眼判定值，△肉眼判定值(Dx-D0)

[A]:[J-007],[B]:对照试样

△临床评分(Clinical Scoring),mean±S.D.肉眼判定相差值，减少量越大，肤色越亮。

p-值:显着的概率,威尔科克森(Wilcoxon)test(p<0.05:组之间没有显著差异)。

表20

使用试样前、后的肉眼判定相差值，△肉眼判定值(第二评价者，Dx-D0)

试样:[J-007]

△临床评分(Clinical Scoring)：减少量越大，肤色越亮。

*威尔科克森(Wilcoxon)测试有显著性差异(Significant difference by Wilcoxon test)，p-值<0.05

3-7)受试者最终评价调查

由研究负责人在试验结束日对试样的皮肤适宜性和美白功效进行调查评价。对于回答‘非常好‘和’好‘的受试者的比率进行分析的结果，皮肤适宜性上试样A和试样B相同地均显示为61％，从美白功效上，试样A为61％，试样B为57％，评价结果试样A的美白功效优于试样B。(表21)

表21

3-8)皮肤安全性评价结果

涂试样四周后和八周后，由皮肤科专家医师对试验部位进行肉眼检查，调查受试者报告的刺激反应的发生时点、频率、强度、持续时间等后最终评价试样的安全性。

使用试样期间，有三名受试者反应使用试样后出现烧灼感(No.14:B site,No.19:A,Bsite,No.21:B site)。这些反应从非常弱到弱的程度，持续时间非常短，只有几秒到几分钟之间，反复使用试样且使用两周后没有复发症状而判定与试样的相关性非常小。

此外，没有接到报告或观察到有关研究中断或需要改变试样使用方法的现象，报告的反应被判定为不是存在试样安全性忧虑的特异反应。

根据皮肤科专家医师的诊断和观察结果，没有观察到与试样有相关性的皮肤有害现象，皮肤安全性被判定为“好”的水平。

3-9)结果综述

·开始参与试验的25名受试者中两名中途被淘汰，最终有23名(平均年龄为37.5岁)获得了有效数据。从照射紫外线第三开始过六天后，用分光光度计(Spectrophotometer)测定人工色素沉着的肤色，对L*(明度)值与人工黑化前相差1以上的受试者或者由皮肤科专家医师用肉眼观察到明显黑化的受试者开始涂试样。

·从开始涂试样日期过四周后和八周后，用仪器对人工黑化部位的肤色进行测定的结果，使用试样四周后和八周后涂试样的部位肤色(L*)与涂对照试样的部位相比显著地(p<0.05)变亮，使用试样八周后，使用试样部位的ITA°值比使用对照试样的部位显著地变亮。

由两名专家对使用试样四周和八周后的人工黑化部位的肤色进行肉眼评价结果，第一评价者评价出使用试样部位的肤色在试样之间没有出现显著性差异，而第二评价者评价出，从使用试样四周后开始，使用试样A的部位肤色比使用试样B的部位显著地变亮。

使用试样期间，由皮肤科专家医师隔四周对试样的皮肤安全性进行观察的结果，未观察到与试样有关的有害现象。

4)考察与结论

本试验是为了对郑旭哲先生(个人)委托的试样‘[J-007]’的美白效果与对照试样进行比较评价而进行。本试验中，从年龄21岁到51岁(平均年龄为37.5岁)之间的23名韩国女性受试者获取有效数据，对进行八周试验的结果进行了分析。

为评价试样的美白效果，在受试者前臂内侧照射紫外线，以人工手段诱发色素沉着以后，由受试者利用八周时间每天两次自行涂擦试样，同时对涂试样前、涂试样四周后和八周后的分光光度计(Spectrophotomenter)和色素皮肤分析仪(Meaxameter)的涂试样部位的肤色进行了测定。而且由两名专家(皮肤科专家医师)对使用试样前、使用试样四周和八周后的肤色变化进行了肉眼检查。皮肤科专家医师为评价试样的皮肤安全性而并行实施了肉眼检查。

分光光度计(Spectrophotomenter)CM2600d测定结果(L*)，使用试样四周后和八周后涂试样“[J-007]”的皮肤与对照试样相比出现显著性水平(p<0.05)，皮肤变亮。

由此判断，试样“[J-007]”对以紫外线照射手段诱发人工黑化部位使用八周以后可以有助于皮肤美白。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于，

从活着的金环胡蜂中只选工蜂放入乙醇溶液浸泡一定时间。

2.根据权利要求1所述的金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于，

所述乙醇溶液乙醇浓度在15%～50%之间。

3.根据权利要求1所述的金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于，

所述大胡蜂是在所述乙醇溶液中，以1L:15~100只的比率实施浸泡。

4.根据权利要求1所述的金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于， 在所述乙醇溶液中浸泡的大胡蜂是在阴凉处在室温下成熟6个月以上优选地成熟一年以上。

5.利用根据权利要求1至4中的某一项所述的方法提取的金环胡蜂毒提取物的功能性化妆料组合物。

Claims (2)

1.一种金环胡蜂毒的提取方法，其特征在于，包括以下一系列连续实施过程：在储藏容器中放入乙醇浓度达15%～50%的乙醇溶液的提前准备过程；取所述乙醇溶液1L，然后从活着的金环胡蜂中选择15～100只工蜂，放入所述储藏容器，盖上盖子密封，使金环胡蜂掉进所述乙醇溶液中，致使金环胡蜂的行动变得迟钝的金环胡蜂投放过程；

将此在阴凉处于室温下成熟6个月以上优选地成熟一年以上的成熟过程；

将成熟的液体分离的成熟液分离过程。

2.采用根据权利要求1所述的方法提取的金环胡蜂毒提取物的功能性化妆料组合物。