CN104374862A - 丹参茎叶的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹参茎叶的质量控制方法，包括步骤:A、鲜茎叶外观鉴定，B、鉴别：鲜丹参茎叶干燥处理，对丹参茎叶的干品进行粉碎得到粉末状丹参茎叶样品，醇提取后浓缩，采用薄层色谱展开，在紫外灯下检视，与标准品对照，对样品进行鉴别；C、水分和灰分测定：对丹参茎叶的干品进行水分和灰分测定；D、浸出物测定：采用冷浸方法对丹参茎叶进行浸泡，得水溶性浸出物，测出水溶性浸出物的含量；E、活性成分测定：对丹参茎叶的干品进行提取处理，检测提取物中活性成分的含量；F、将测定结果与质量标准进行对比，分析判断该样品是否达到质量要求。本发明解决了目前丹参茎叶尚无系统控制产品质量的标准难题，并能保证药材质量的稳定、均一。

Description

丹参茎叶的质量控制方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种药物质量控制方法，尤其涉及一种丹参茎叶的质量控制方法。

背景技术

丹参茎叶为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的地上茎及叶部位，文献报道，其主要成份含黄酮、丹酚酸B等水溶性成份，但不含有丹参酮等脂溶性成分，丹参茎叶具有抗缺氧、抗氧化，可降低胆固醇、高血压,预防脑血栓及冠心病等作用，丹参茎叶重量占总植株重量为2/3，但在药材采收时多作杂质弃去，近年来，人们逐渐重视丹参茎叶的利用开发，但尚未建立完整的丹参茎叶质量标准以控制其质量，仅散见其成份分离及部份定性及定量研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种能对丹参茎叶质量进行控制的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种丹参茎叶的质量控制方法，包括以下步骤:

A、鲜茎叶外观鉴定：采集鲜茎叶样品，根据丹参茎叶外观形状特性进行初步判断样品是否为丹参茎叶；

B、鉴别：将鲜丹参茎叶进行干燥处理，然后对丹参茎叶的干品进行粉碎得到粉末状丹参茎叶样品，在醇提取后浓缩，采用薄层色谱展开，在紫外灯下检视，并与标准品对照，对样品进行鉴别；

C、水分和灰分测定：对丹参茎叶样品进行水分和灰分测定；

D、浸出物测定：采用冷浸的方法对丹参茎叶样品进行浸泡，得到水溶性浸出物，测量出水溶性浸出物的含量；

E、活性成分测定：对丹参茎叶样品进行提取处理，检测提取物中活性成分的含量；

F、将上述测定结果与质量标准进行对比，分析判断该样品是否达到质量要求。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤B中，所述鉴别包括以下子步骤：

B1、制备硅胶G薄层板和硅胶GF254薄层板；

B2、取粉末状丹参茎叶样品加入乙醚振摇，放置后滤过，滤液挥发完的残渣加乙酸乙酯溶解，作为脱脂供试品溶液；

取粉末状丹参茎叶样品加入乙酸乙酯振摇，超声处理并过滤，取滤液作为供试品溶液；

另取丹参对照药材，加入乙酸乙酯振摇，超声处理并过滤，取滤液制成对照药材溶液；

再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成对照品溶液；

分别吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，展开后取出晾干；

B3、取粉末状丹参茎叶样品加75％甲醇加热回流，滤过，滤液浓缩，作为供试品溶液；

另取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成对照品溶液，作为对照品溶液；

分别吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂进行展开，取出晾干，置紫外光灯下检视。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤C中，所述水分测定步骤为：取粉末状丹参茎叶样品平铺于干燥至恒重的容器中，精密称定，敞口在100～105℃干燥4-6小时，封闭容器移置干燥器中，冷却，精密称定重量，再在上述温度下干燥0.5-2小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止；根据减失的重量，计算供试品中含有水分的百分数。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤C中，所述灰分测定步骤为：样品粉碎，过筛混合均匀后，取筛下物，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，缓缓炽热，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重；根据残渣重量，计算供试品中含总灰分的百分数。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤D中，所述冷浸的步骤为：取样品称定重量，置容器中精密加入水，封闭后冷浸，前4-8小时内时时振摇，再静置10-20小时，滤过后精密量取滤液，置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后，再于100-110℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却20-50分钟,迅速精密称定重量，以干燥品计算样品中含水溶性浸出物的重量百分含量。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选步骤E具体为：

E1、取粉末状丹参茎叶样品加入提取剂，提取得滤液，即为供试品溶液；

E2、取丹酚酸B加提取剂制成对照品溶液，作为丹酚酸B对照品溶液；

取迷迭香酸加提取剂制成对照品溶液，作为迷迭香酸对照品溶液；

E3、将供试品溶液、迷迭香酸对照品溶液和丹酚酸B对照品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温；

E4、分析高效液相色谱的谱图，分析得到活性成分含量。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在所述步骤E1中，所述的提取为加热回流提取，具体步骤为：取粉末状丹参茎叶样品称定重量，加入提取剂，称定重量，加热回流40min-1.5小时，冷却再称定重量，用提取剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在所述步骤E1中，所述的提取为超声提取，具体步骤为：

取过筛后的粉末状丹参茎叶样品，精密称定，置密封容器中，精密加入75％甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在所述步骤E1中，所述提取剂为水、50％甲醇或75％甲醇。

本发明中从外观到活性成分、从鲜茎叶到干品进行了全面鉴定分析，建立了丹参茎叶的质量标准。本发明对丹参茎叶质量标准进行了明确，建立了其定性和定量测定项目，并按照相关技术要求和指导原则建立了丹参茎叶的质量标准，此标准的建立，解决了目前丹参茎叶尚无系统控制产品质量的标准难题，并能保证药材质量的稳定、均一。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为硅胶G薄层板上展开谱图；

图2为硅胶G薄层板上展开谱图在紫外365nm处检视结果；

图3为硅胶GF254薄层板上展开谱图在紫外254nm处检视结果。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。

一种丹参茎叶的质量控制方法，包括以下步骤:

A、鲜茎叶外观鉴定：根据丹参茎叶外观形状特性进行初步判断样品是否为丹参的茎叶；

B、鉴别：参照《中国药典》2010版一部丹参项下相关标准进行薄层色谱鉴别。

将鲜丹参茎叶进行干燥处理，然后对丹参茎叶的干品进行粉碎得到粉末状丹参茎叶样品，醇提取后浓缩，采用薄层色谱展开，在紫外灯下检视，并与标准品对照，对样品进行鉴别；

C、水分和灰分测定：对丹参茎叶的干品进行水分和灰分测定；其中水分不大于12％为合格，总灰分不大于10％为合格。

D、浸出物测定：采用冷浸的方法对丹参茎叶进行浸泡，得到水溶性浸出物，测量出水溶性浸出物的含量；水溶性浸出物的含量不少于10％为合格。

E、活性成分测定：对丹参茎叶的干品进行提取处理，检测提取物中活性成分的含量；以干燥品计，含迷迭香酸不低于0.2％，含丹酚酸B不低于0.045％为合格。

F、将上述测定结果与质量标准进行对比，分析判断该样品是否达到质量要求。

其中，步骤A首先对新鲜样品是否是鲜丹参茎叶进行判断。

丹参茎叶是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的地上茎及叶部位，在9-12月份均可采收。

丹参茎叶的性状：茎直立，四棱形，具多级分枝，被长柔毛。叶对生，为奇数羽状复叶；叶片阔卵形或类圆形，边缘有锯齿；小叶3或5，较小，长3.3～6.5cm，宽3～4.5cm，总叶柄长4.5～11cm。轮伞花序组成顶生或腋生的假总状花序；花萼钟状，紫色；花冠蓝紫色，唇形。

依据上述性状特点对样品进行外观鉴定，初步判断样品是否为丹参茎叶。

在初步鉴定后，要对该样品进一步进行鉴别。该鉴别采用薄层色谱法，通过与标准品对照，得出鉴别结论。

优选在步骤B中，所述鉴别包括以下子步骤：

B1、制备硅胶G薄层板和硅胶GF254薄层板；

B2、取粉末状丹参茎叶样品加入乙醚振摇，放置后滤过，滤液挥发完的残渣加乙酸乙酯溶解，作为脱脂供试品溶液；

取粉末状丹参茎叶样品加入乙酸乙酯振摇，超声处理并过滤，取滤液作为供试品溶液；

另取丹参对照药材，加入乙酸乙酯振摇，超声处理并过滤，取滤液制成对照药材溶液；

再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成对照品溶液；

分别吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，展开后取出晾干；

B3、取粉末状丹参茎叶样品加75％甲醇加热回流，滤过，滤液浓缩，作为供试品溶液；

另取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成对照品溶液，作为对照品溶液；

分别吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂进行展开，取出晾干，置紫外光灯下检视。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤C中，所述水分测定步骤为：取粉末状丹参茎叶样品平铺于干燥至恒重的容器中，精密称定，敞口在100～105℃干燥4-6小时，封闭容器移置干燥器中，冷却，精密称定重量，再在上述温度下干燥0.5-2小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止；根据减失的重量，计算供试品中含有水分的百分数。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤C中，所述灰分测定步骤为：样品粉碎，过筛混合均匀后，取筛下物，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，缓缓炽热，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重；根据残渣重量，计算供试品中含总灰分的百分数。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在步骤D中，所述冷浸的步骤为：取样品称定重量，置容器中精密加入水，封闭后冷浸，前4-8小时内时时振摇，再静置10-20小时，滤过后密量取滤液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，再于100-110℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却20-50分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算样品中含水溶性浸出物的重量百分含量。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选步骤E具体为：

E1、取粉末状丹参茎叶样品加入提取剂，提取得滤液，即为供试品溶液；

E2、取丹酚酸B加提取剂制成对照品溶液，作为丹酚酸B对照品溶液；

取迷迭香酸加提取剂制成对照品溶液，作为迷迭香酸对照品溶液；

E3、将供试品溶液、迷迭香酸对照品溶液和丹酚酸B对照品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温；

E4、分析高效液相色谱的谱图，分析得到活性成分含量。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在所述步骤E1中，所述的提取为加热回流提取，具体步骤为：取粉末状丹参茎叶样品称定重量，加入提取剂，称定重量，加热回流40min-1.5小时，冷却再称定重量，用提取剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在所述步骤E1中，所述的提取为超声提取，具体步骤为：

取过筛后的粉末状丹参茎叶样品，精密称定，置密封容器中，精密加入75％甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

优选地，所述的丹参茎叶的质量控制方法中，优选在所述步骤E1中，所述提取剂为水、50％甲醇或75％甲醇。

以下通过具体实施例对本发明进行详细说明：

实施例

A、鲜茎叶外观鉴定：任意选取多片样品茎叶，对照丹参茎叶的性状，进行判别，经对比，该样品中符合茎直立，四棱形，具多级分枝，被长柔毛。叶对生，为奇数羽状复叶；叶片阔卵形或类圆形，边缘有锯齿；小叶长3.4cm，宽4cm，总叶柄长5cm。因此，初步判断该鲜茎叶为丹参茎叶。

B、鉴别：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹参酮IIA对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140717；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型(大连伊力特)。

实验步骤：

铺制硅胶G薄层板：取一份硅胶G粉和3份CMC-Na溶液在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面气泡后，取适量均匀涂布在玻璃板上，置水平台上于室内晾干。使用前置于烘箱中110烘30min，冷却备用。

铺制硅胶GF254：与1步骤相同。

取粉末状丹参茎叶样品lg，精密称定1.0112g，加乙醚5ml,振摇，放置1小时，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为脱脂供试品溶液。取丹参茎叶粉末lg，精密称定(1.0431g)，加乙酸乙酯lml，超声，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取丹参对照药材lg(实际1.0969g)，加乙酸乙酯lml，超声，滤过，取续滤液，制成对照药材溶液。再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干。

取粉末状丹参茎叶样品0.2g，加75％甲醇25mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至lml，作为供试品溶液。另取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成每lml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5uL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2:3:4:0.5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

如图1所示，为硅胶G薄层板上展开谱图，供试品色谱中，标号1为对照品溶液、标号2为对照药材溶液、标号3为脱脂供试品溶液、标号4为供试品溶液，在与对照药材色谱相应的位置上，不显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，不显相同的暗红色斑点，说明样品中不含有脂溶性成分。

图2为硅胶G薄层板上展开谱图在紫外365nm处检视结果，标号1为对照品，标号2为对照药材，标号3为丹参茎叶样品。图中显示在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

图3为硅胶GF254薄层板上展开谱图在紫外254nm处检视结果，标号1、2为对照品，标号3、4为丹参茎叶样品。图中显示在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结论：该样品为丹参茎叶。

C、水分和灰分测定：对丹参茎叶的干品进行水分和灰分测定；

所述水分测定步骤为：取粉末状丹参茎叶样品平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松样品不超过10mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥4-6小时，优选5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥0.5-2小时，优选1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含有水分的百分数。本样品含水量为8％，符合标准要求。

所述灰分测定步骤为：取样品粉碎，使能通过二号筛，混合均匀后，取供试品2～3g(如须测定酸不溶性灰分，可取供试品3～5g)，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(准确至0.01g)，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中含总灰分的百分数。本样品的总灰分为10％，符合标准要求。

D、浸出物测定：采用冷浸的方法对丹参茎叶进行浸泡，得到水溶性浸出物，测量出水溶性浸出物的含量；

取供试品约4g，称定重量(准确至0.01g)，置250～300ml的锥形瓶中，精密加入水100ml，塞紧，冷浸，前4-8小时内时时振摇，优选6小时，再静置10-20小时，优选18小时，用干燥滤器迅速滤过，精密量取滤液20ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后，于100-110℃下，优选105℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟,迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中含水溶性浸出物的百分数。本实施例中，水溶性浸出物含量为18％，符合标准要求。

E、活性成分测定：对丹参茎叶的干品进行提取处理，检测提取物中活性成分的含量；

活性成分丹参酮IIA考察

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹参酮IIA对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140717；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

实验步骤：

1、对照品溶液的制备

取丹参酮IIA对照品适量，精密称定为1.70mg置于25ml棕色量瓶中，在取隐丹参酮对照品适量，精密称定2.64mg，置于同一棕色量瓶中，加入甲醇定容。(丹参酮IIA对照品0.068mg/ml隐丹参酮对照品0.1056mg/ml)

2、供试品溶液的制备

1)无花丹参茎叶

取无花粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约0.3g，精密称定0.3039g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)有花丹参茎叶

取无花粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约0.3g，精密称定0.3040g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：以甲醇-水(75：25)为流动相；检测波长为270nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实验结果

实验结论：丹参茎叶中不含丹参酮IIA。

活性成分丹酚酸B的考察

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

实验步骤：

1、对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定为3.28mg置于25ml棕色量瓶中，在取原儿茶醛对照品适量，精密称定1.47mg，置于同一棕色量瓶中，加入75％甲醇定容。(丹酚酸B对照品0.1312mg/ml原儿茶醛对照品0.0588mg/ml)

2、供试品溶液的制备

1)无花丹参茎叶

取无花粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0020g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)有花丹参茎叶

取有花粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2g，精密称定2.0017，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10：1:59)为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实验结果

实验结论：丹参茎叶中含有丹酚酸B。

提取方法考察

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

实验步骤：

1对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定为12.37mg置于100ml棕色量瓶中，加入75％甲醇定容(丹酚酸B对照品0.1237mg/ml)。

2供试品溶液的制备

1)超声提取

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约5.0g，精密称定5.0017g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)回流提取

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约5.0g，精密称定5.0012g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10：1:59)为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

迷迭香酸测定结果

丹酚酸B测定结果

实验结论

从实验结果迷迭香酸K值和丹酚酸B的百分含量可以得出回流提取比超声提取更好，最佳提取方式为回流提取。

溶媒(提取剂)考察

提取剂可以选自：水、50％甲醇、75％甲醇。

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

实验步骤：

1、对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定为12.37mg置于100ml棕色量瓶中，加入75％甲醇定容(丹酚酸B对照品0.1237mg/ml)。

2、供试品溶液的制备

1)水提

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约5.0g，精密称定5.0005g，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)50％甲醇提取

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约5.0g，精密称定5.0008g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)75％甲醇提取

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约5.0g，精密称定5.0013g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10：1:59)为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

迷迭香酸测量结果

丹酚酸B测量结果

实验结论：从实验结果迷迭香酸K值的比较和丹酚酸B的百分含量比较可以得出75％甲醇提取出的迷迭香酸和丹酚酸B的含量最高，故选75％甲醇溶液为最佳提取溶媒。

溶媒用量考察

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

实验步骤：

1、对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定为12.37mg置于100ml棕色量瓶中，加入75％甲醇定容。(丹酚酸B对照品0.1237mg/ml)

2、供试品溶液的制备

1)用量25ml

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0018g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)用量50ml

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0018g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得

色谱条件：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10：1:59)为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

迷迭香酸测定结果

丹酚酸B测定结果

实验结论：从实验结果迷迭香酸K值的比较和丹酚酸B的百分含量比较可以得出50ml甲醇提取出的迷迭香酸和丹酚酸B的含量最高，故选50ml甲醇溶液为最佳溶媒用量。

提取时间考察

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

实验步骤：

1、对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定为4.75mg，置于50ml棕色量瓶中，再取迷迭香酸对照品适量，精密称定1.54mg，置于同一棕色量瓶中，加入75％甲醇定容。(丹酚酸B对照品0.0950mg/ml迷迭香酸对照品0.0308mg/ml)

2、供试品溶液的制备

1)提取0.5h

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0008g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流0.5小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)提取1h

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0009g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)提取1.5h

取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0006g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10：1:59)为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

迷迭香酸测定结果

丹酚酸B测定结果

实验结论：从实验结果得迷迭香酸的百分含量随提取时间增加而增大；丹酚酸B的百分含量随提取时间增加而减小。综合实验结果选择最佳提取时间为1h。

丹参茎叶中丹酚酸B及迷跌香酸含量测定方法学实验考察

实验材料：丹参茎叶样品采自中江石泉乡，批号20140703，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号20140716；迷迭香酸对照品：购自中国食品药品检定研究所，批号201408320；超声波清洗器：KQ-100型；电子天平：BS-6KH型；分析电子天平：FA2004型；HPLC：P2302II型。

色谱条件：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10：1:59)为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温。

对照品溶液的制备

混合对照品：取丹酚酸B对照品适量，精密称定为6.34mg，置于100ml棕色量瓶中，再取迷迭香酸对照品适量，精密称定9.23mg，置于同一棕色量瓶中，加入75％甲醇定容。(丹酚酸B对照品0.0634mg/ml迷迭香酸对照品0.0923mg/ml)

迷迭香酸对照品:取迷迭香酸对照品适量，精密称定11.98mg，置于25ml棕色量瓶中，加入75％甲醇定容。(迷迭香酸对照品0.4792mg/ml)

丹酚酸B对照品：取丹酚酸B对照品适量，精密称定为12.37mg置于100ml棕色量瓶中，加入75％甲醇定容。(丹酚酸B对照品0.1237mg/ml)

线性关系考察实验

精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B混合对照品溶液2、4、8、10、14、20μl分别进样，测定峰面积，以峰面积Y对进样量X进行线性回归得：迷迭香酸线性回归方程y＝181.44X-10.493，r＝0.99995；丹酚酸B线性回归方程y＝59.180X+18.303，r＝0.9993。结果表明，迷迭香酸、丹酚酸B分别在0.1846-1.18460μg；0.1268-1.2680μg范围内与峰面积成良好线性关系。

1.迷迭香酸

2.丹酚酸B

精密度实验

精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B混合对照品溶液10μl，在以上色谱条件下，重复进样6次，记录峰面积，迷迭香酸、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.7991％和1.5413％。实验结果表明仪器精密度良好。

1.迷迭香酸

2.丹酚酸B

稳定性实验

供试品的制备：取粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)约2.0g，精密称定2.0011g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

精密吸取制备好的供试品溶液10μl，在以上色谱条件下，分别于0、1、2、4、6、8h进样，测定峰面积，迷迭香酸、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.5057％和1.9486％。结果表明供试品溶液8h内稳定。

1.迷迭香酸

2.丹酚酸B

重复性实验

供试品的制备：取6份粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)每份约2.0g，按照稳定性实验供试品的制备方法制备，平行制备6份供试品溶液。在以上色谱条件下，测定迷迭香酸、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.7538％和1.9321％。结果表明供试品溶液重复性良好。

1.取样量

1.迷迭香酸

2.丹酚酸B

加样回收实验

精密移取重复性实验样品12.5ml(约含迷迭香酸1.9075mg，丹酚酸B0.2825mg)，加迷迭香酸对照品(0.4792mg/ml)4ml，丹酚酸B对照品(0.1237mg/ml)2.3ml于25ml棕色容量瓶中，加75％甲醇定容至刻度。按照上述色谱条件测定其含量，计算加样回收率(见下表)结果表明本方法回收率良好。

加样回收率实验结果(n＝6)

丹参茎叶中迷迭香酸和丹酚酸B的含量测定：

分别取7、8、9三个月的粉末状丹参茎叶样品(过三号筛)每份约2.0g，按照稳定性实验供试品的制备方法制备，平行制备3份供试品溶液。按照上述色谱条件测定其含量，实验结果如下表所示。

丹参茎叶中迷迭香酸和丹酚酸B的含量的测定结果

Claims (9)

1.一种丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤:

A、鲜茎叶外观鉴定：采集鲜茎叶样品，根据丹参茎叶外观形状特性初步判断样品是否为丹参茎叶；

B、鉴别：将鲜丹参茎叶进行干燥处理，然后对丹参茎叶的干品进行粉碎得到粉末状丹参茎叶样品，在醇提取后浓缩，采用薄层色谱展开，在紫外灯下检视，并与标准品对照对样品进行鉴别；

C、水分和灰分测定：对丹参茎叶样品进行水分和灰分测定；

D、浸出物测定：采用冷浸的方法对丹参茎叶样品进行浸泡，得到水溶性浸出物，测量出水溶性浸出物的含量；

E、活性成分测定：对丹参茎叶样品进行提取处理，检测提取物中活性成分的含量；

F、将上述测定结果与质量标准进行对比，分析判断该样品是否达到质量要求。

2.根据权利要求1所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在步骤B中，所述鉴别包括以下子步骤：

B1、制备硅胶G薄层板和硅胶GF254薄层板；

B2、取粉末状丹参茎叶样品加入乙醚振摇，放置后滤过，滤液挥发完的残渣加乙酸乙酯溶解，作为脱脂供试品溶液；

取粉末状丹参茎叶样品加入乙酸乙酯振摇，超声处理并过滤，取滤液作为供试品溶液；

另取丹参对照药材，加入乙酸乙酯振摇，超声处理并过滤，取滤液制成对照药材溶液；

再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成对照品溶液；

分别吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，展开后取出晾干；

B3、取粉末状丹参茎叶样品加75％甲醇加热回流，滤过，滤液浓缩，作为供试品溶液；

另取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成对照品溶液，作为对照品溶液；分别吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂进行展开，取出晾干，置紫外光灯下检视。

3.根据权利要求1所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在步骤C中，所述水分测定步骤为：取粉末状丹参茎叶样品平铺于干燥至恒重的容器中，精密称定，敞口在100～105℃干燥4-6小时，封闭容器移置干燥器中，冷却，精密称定重量，再在上述温度下干燥0.5-2小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止；根据减失的重量，计算供试品中含有水分的百分数。

4.根据权利要求1所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在步骤C中，所述灰分测定步骤为：样品粉碎，过筛混合均匀后，取筛下物，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，缓缓炽热，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重；根据残渣重量，计算供试品中含总灰分的百分数。

5.根据权利要求1所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在步骤D中，所述冷浸的步骤为：取样品称定重量，置容器中精密加入水，封闭后冷浸，前4-8小时内时时振摇，再静置10-20小时，滤过后精密量取滤液，置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后，再于100-110℃下干燥3小时，移置干燥器中，冷却20-50分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算样品中含水溶性浸出物的重量百分含量。

6.根据权利要求1所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，步骤E具体为：

E1、取粉末状丹参茎叶样品加入提取剂，提取得滤液，即为供试品溶液；

E2、取丹酚酸B加提取剂制成对照品溶液，作为丹酚酸B对照品溶液；取迷迭香酸加提取剂制成对照品溶液，作为迷迭香酸对照品溶液；

E3、将供试品溶液、迷迭香酸对照品溶液和丹酚酸B对照品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；检测波长为286nm；流速为1ml/min；柱温为室温；

E4、分析高效液相色谱的谱图，分析得到活性成分含量。

7.根据权利要求6所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在所述步骤E1中，所述的提取为加热回流提取，具体步骤为：取粉末状丹参茎叶样品称定重量，加入提取剂，称定重量，加热回流40min-1.5小时，冷却再称定重量，用提取剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

8.根据权利要求6所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在所述步骤E1中，所述的提取为超声提取，具体步骤为：

取过筛后的粉末状丹参茎叶样品，精密称定，置密封容器中，精密加入75％甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

9.根据权利要求6所述的丹参茎叶的质量控制方法，其特征在于，在所述步骤E1中，所述提取剂为水、50％甲醇或75％甲醇。