CN104365515B

CN104365515B - 一种软体部高黑色素含量长牡蛎的选育方法

Info

Publication number: CN104365515B
Application number: CN201410680301.3A
Authority: CN
Inventors: 王晓通; 于文超; 赵南南; 张子豪; 王娇; 武长路
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: CN104365515A

Abstract

本发明公开了一种软体部高黑色素含量长牡蛎（“乌”牡蛎）的选育方法，以及方法有效性的证明方案，它包括以下步骤：观察普通牡蛎的颜色，选择黑色壳的面积占总壳面积的比例为90%以上并且明度值V<0.20的牡蛎、牡蛎壳黑色素的提取、牡蛎软体部黑色素的提取、黑色素含量与软体部黑色素含量之间的相关性分析，申请人在实验过程中，发现长牡蛎贝壳壳色与外套膜中黑色素沉积量有显著正相关的现象，贝壳越黑则其软体部黑色素含量也就越多。本发明能准确快速的选育出软体部黑色素含量高的牡蛎，可提高牡蛎育种的效率，由于黑色素的保健价值已得到市场认可，故本方法得到的牡蛎新品种可增加养殖的附加值。

Description

一种软体部高黑色素含量长牡蛎的选育方法

技术领域：

本发明涉及一种选育方法，尤其涉及一种软体部高黑色素含量长牡蛎（“乌”牡蛎）的选育方法。

背景技术：

黑色素是一种生物多聚体，广泛分布于动植物体中。随着对天然黑色素的不断深入研究，人们发现，黑色素有广泛的生物活性，包括延缓衰老、调节免疫力、保护光照损伤、抗氧化，清除自由基、保护心血管功能等，高黑色素含量的天然食品已得到消费者的充分认可，市场前景广阔。

目前，有学者报道过不同外套膜色长牡蛎的选育，而对于左右壳都是黑色的牡蛎的选育没有报道，并且对于不同外套膜色长牡蛎的选育是通过肉眼观察外套膜颜色而进行的，没有报道贝壳颜色与外套膜颜色之间内在的相关性，这种方法需要撬开贝壳，受主观因素影响较大，费事费力、选育成本高、准确性较差。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种加速牡蛎的育种进程、提高牡蛎育种精确性、提高牡蛎的利用价值和经济利益的准确快速的软体部高黑色素含量长牡蛎的选育方法。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种软体部高黑色素含量长牡蛎的选育方法，其特征在于其包括以下步骤：

（1）观察挑选左右壳均为黑色的长牡蛎，测量牡蛎左右壳的表面积以及黑色壳部分的表面积，选出黑色壳的面积占总壳面积的比例为90%以上的长牡蛎；

（2）然后采用ND-2NCS明度尺测量上述牡蛎壳色的明度值，选取明度值V<0.20的长牡蛎；

（3）将黑色表面积比例为90%以上和壳色明度V<0.20的长牡蛎留作种贝，进行正常的育苗操作。

本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明通过实验证明，长牡蛎壳中黑色素的含量与其软体部中黑色素的含量有很大的相关性，壳色是评估牡蛎软体黑色素含量的间接指标。采用以壳色来判断软体部黑色素含量的方法，不但可以高效地选择出符合育种要求的“乌”牡蛎个体，加速了牡蛎的育种进程，也可以提高牡蛎的利用价值和养殖经济效益。这种新的指标不仅可以用在长牡蛎选育上，也可以尝试用在其他的海洋经济贝类动物育种上，将加快特种贝类的育种进展。本选育方法无需开壳从而可避免亲本浪费且省时省力，另外，使用黑色壳的面积占总壳面积的比例为90%以上和贝壳颜色明度值V<0.20的指标，可使得选育过程标准化，从而提高选育的准确性。

附图说明：

图1为ND-2NCS国际通用明度尺扫描件示意图；黑色方框内是牡蛎壳色选择的明度临界值；

图2为长牡蛎壳与软体部中黑色素含量的相关性分析示意图，其中，黑色方块表示30组牡蛎壳与软体部中黑色素含量的配对数据，R²指相关系数。

具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式作详细说明：

实施例：一种通过外壳颜色选择软体部含有大量黑色素长牡蛎的选育方法，以及方法有效性的证明方案，它包括以下步骤：

1.1选育方法：

（1）观察挑选左右壳均为黑色的牡蛎，测量牡蛎左右壳的表面积以及黑色壳部分的表面积，选出黑色壳的面积占总壳面积的比例为90%以上的牡蛎。

（2）采用ND-2NCS明度尺（lightnessmeter）测量牡蛎壳色的明度值，选取明度值V<0.20的牡蛎。（注：ND-2NCS明度尺是由瑞典出版的国际标准色卡，清楚表现由白色到黑色共18个标准明度级，即物体颜色越黑明度越低，越白明度越高，能有效的表现出物体黑色的程度，请见图1）。

（3）将黑色表面积比例和壳色明度均符合要求的长牡蛎留作种贝，进行正常的育苗操作。

1.2方法有效性的证明：

（1）将选取的牡蛎进行壳中黑色素的提取。

（2）将选取的牡蛎进行软体部中黑色素的提取。

（3）将壳中黑色素含量与软体部中黑色素含量进行相关性分析。

具体方法有效性的证明实验例如下：

1.实验材料：

长牡蛎：本实验所用活的长牡蛎，购买于烟台市环海路农贸市场，平均体重100g,总数30只。

1.1仪器设备：

循环水真空泵、电子密度天平、电热恒温水浴锅、电热恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、索氏提取器一套、研钵、烧杯、三角烧瓶、玻璃棒；

1.2实验试剂：

包括盐酸、乙醚、蒸馏水。盐酸溶液的配制：购买的盐酸为标准浓度12mol/l,本实验所需要的盐酸浓度为6mol/l。每次实验所需要的盐酸体积为600ml，用量筒量取300ml12mol/L的盐酸倒入装有300ml蒸馏水的烧杯中配制成6mol/l的盐酸。

2.实验方法：

2.1牡蛎壳中黑色素的提取：

2.1.1前期准备：将30只牡蛎全部清洗干净；

2.1.2工艺流程；

原料准备→粉碎→水解→水浴→抽滤→去脂→洗涤、过滤→干燥→称量；

2.1.3操作要点：

原料：选择壳上有黑色斑点的牡蛎作为原料；

粉末的制备：将牡蛎壳上的杂质洗去，将牡蛎壳粉碎研磨备用；

水解：称量牡蛎壳粉末30g置于1000ml的三角烧瓶中，先用6mol/l盐酸溶液200ml浸泡12h；

水浴：将浸泡过壳粉200ml盐酸溶液弃去，将残渣放入500ml圆底烧瓶中再加6mol/lHCl溶液400ml,装上冷凝管于100℃的水浴中加热1h；

抽滤：加热完毕后，将圆底烧瓶内的牡蛎壳用布氏漏斗抽滤，弃去滤液，保留滤渣；

去脂：将滤渣用滤纸包好，置于索氏脂肪提取器中，用乙醚在42℃左右的水浴中脱脂，待索氏管中乙醚呈现出澄清状态后，脱脂结束，再将滤纸包取出，在抽滤装置上用蒸馏水反复洗涤多次；

干燥称重：最后在80℃恒温干燥箱中烘干，取出黑色素，称重；

计算：黑色素的含量=黑色素重量(g)/样本重量(g)×100%。

2.1.4具体实验步骤：

原料的处理：

用牡蛎刀将鲜活的牡蛎撬开，把牡蛎肉剥离下来，作为其他实验备用。将牡蛎壳上的杂质以及牡蛎肉清理干净，清洗干净后晒干，以方便研磨和提取。

粉碎：

先用锤子将牡蛎壳敲成为碎片，再用研钵研磨成精细的粉状，减小与盐酸混合时的损失和方便提取。

水解：

称量牡蛎壳粉末30g置于1000ml的三角烧瓶中，将200ml6mol/l的盐酸缓慢倒入烧瓶中，边倒边用玻璃棒搅拌，以防盐酸与碳酸钙发生反应后溶液溢出，减小损失。牡蛎壳中含有大量的碳酸钙和少量的壳质素，与盐酸发生的化学反应产生大量气体二氧化碳，化学方程式如下：

2HCl+CaCO₃=CaCl₂+H₂O+CO₂，

天然黑色素在体内与蛋白质、多糖结合紧密,不易分离,但是黑色素不溶于酸性溶液，酸性溶液的水解作用可以去除与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物以及脂类物质，试验结果表明,使用浓盐酸水解效果优于其他酸,所以本试验用盐酸进行水解将黑色素分离出来。

水浴：

将浸泡过壳粉200ml盐酸溶液弃去，将残渣放入500ml圆底烧瓶中再加6mol/lHCl溶液400ml,装上冷凝管于100℃的水浴中加热1h。水浴是为了反应受热均匀，防止溶液沸腾，因为盐酸属于易挥发的液体，所以使用冷凝管是避免反应物损耗和充分利用原料。

抽滤：

加热完毕后，待冷却后，将圆底烧瓶内的牡蛎壳用布氏漏斗抽滤，弃去滤液，保留滤渣。得到的是黑色素的粗制品。

脱脂：

将滤渣用滤纸包好，置于索氏脂肪提取器中，用乙醚在42℃左右的水浴中脱脂，待索氏管中乙醚呈现出澄清状态后，脱脂结束，再将滤纸包取出，在抽滤装置上用蒸馏水反复洗涤多次。

干燥称重：

最后在80℃恒温干燥箱中烘干，取出黑色素，称重。

计算：

黑色素的含量=黑色素重量(g)/样本重量(g)×100%。

2.2牡蛎软体部黑色素的提取：

2.2.1原料：

采集2.1.1中的牡蛎软体部作为提取色素的原料。

2.2.2组织匀浆的制备：用专用器材在外套膜处将牡蛎撬开，用剪刀剪取软体部边缘颜色较深的部分，然后放在碾钵中捣碎；

2.2.3水解：称量牡蛎软体部大约10g置于的、三角烧瓶中，先用6mol/l盐酸溶液200ml浸泡12h；

2.2.4水浴：将浸泡过牡蛎软体部的200ml盐酸溶液弃去，将残渣放入500ml圆底烧瓶中再加6mol/lHCl溶液400ml,装上冷凝管于100℃的水浴中加热1h；

2.2.5抽滤：加热完毕后，将圆底烧瓶内的牡蛎软体部用布氏漏斗抽滤，弃去滤液，保留滤渣；

2.2.6去脂：将滤渣用滤纸包好，置于索氏脂肪提取器中，用乙醚在42℃左右的水浴中脱脂，待索氏管中乙醚呈现出澄清状态后，脱脂结束，再将滤纸包取出，在抽滤装置上用蒸馏水反复洗涤多次；

2.2.7干燥称重：最后在80℃恒温干燥箱中烘干，取出黑色素，称重。

2.2.8计算：黑色素的含量=黑色素重量(g)/样本重量(g)×100%。

2.3数据计算整理：

将牡蛎壳黑色素含量和牡蛎软体部黑色素含量做相关性分析。

3.结果与分析：

3.1每只牡蛎外壳和软体部黑色素含量数据：

表1牡蛎外壳与软体部中黑色素的含量

3.2数据分析：

由excel软件分析显示，长牡蛎外壳黑色素的含量与软体部黑色素的含量呈正相关，相关系数为0.9725。

4.结论与讨论：

4.1由表1和图2可看出，牡蛎壳中黑色素含量与软体部黑色素含量之间存在很高的正相关，因此根据牡蛎壳色来选择软体部高黑色素含量牡蛎的方法是有效的。

4.2本实验虽然只是选择长牡蛎这一种贝类来验证壳色与软体部黑色素含量的相关性，但这种新的方法可能也适合其他贝类育种，可以提高海洋经济贝类的育种效率。

Claims

1.一种软体部高黑色素含量长牡蛎的选育方法，其特征在于其包括以下步骤：

A、选育方法：

（3）将黑色表面积比例为90%以上和壳色明度V<0.20的长牡蛎留作种贝，进行正常的育苗操作；

B、方法有效性的证明：

1.将牡蛎进行壳中黑色素的提取：

原料的处理：

将平均体重100g的30只壳上有黑色斑点的牡蛎全部清洗干净；用牡蛎刀将鲜活的牡蛎撬开，把牡蛎肉剥离下来，作为其他实验备用；将牡蛎壳上的杂质以及牡蛎肉清理干净，清洗干净后晒干；

粉碎：

先用锤子将牡蛎壳敲成为碎片，再用研钵研磨成精细的粉状；

水解：

称量牡蛎壳粉末30g置于1000ml的三角烧瓶中，将200ml6mol/l的盐酸缓慢倒入烧瓶中，边倒边用玻璃棒搅拌，浸泡12h；

水浴：

将浸泡过壳粉200ml盐酸溶液弃去，将残渣放入500ml圆底烧瓶中再加6mol/lHCl溶液400ml,装上冷凝管于100℃的水浴中加热1h；

抽滤：

加热完毕后，待冷却后，将圆底烧瓶内的牡蛎壳用布氏漏斗抽滤，弃去滤液，保留滤渣；

脱脂：

将滤渣用滤纸包好，置于索氏脂肪提取器中，用乙醚在42℃左右的水浴中脱脂，待索氏管中乙醚呈现出澄清状态后，脱脂结束，再将滤纸包取出，在抽滤装置上用蒸馏水反复洗涤；

干燥称重：

最后在80℃恒温干燥箱中烘干，取出黑色素，称重；

计算：

黑色素的含量=黑色素重量(g)/样本重量(g)×100%；

2.将牡蛎进行软体部中黑色素的提取：

原料的处理：

将平均体重100g的30只壳上有黑色斑点的牡蛎全部清洗干净；(2)组织匀浆的制备：用专用器材在外套膜处将牡蛎撬开，用剪刀剪取软体部边缘颜色较深的部分，然后放在碾钵中捣碎；

(3)水解：称量牡蛎软体部大约10g置于三角烧瓶中，先用6mol/l盐酸溶液200ml浸泡12h；

(4)水浴：将浸泡过牡蛎软体部的200ml盐酸溶液弃去，将残渣放入500ml圆底烧瓶中再加6mol/lHCl溶液400ml,装上冷凝管于100℃的水浴中加热1h；

(5)抽滤：加热完毕后，将圆底烧瓶内的牡蛎软体部用布氏漏斗抽滤，弃去滤液，保留滤渣；

(6)去脂：将滤渣用滤纸包好，置于索氏脂肪提取器中，用乙醚在42℃左右的水浴中脱脂，待索氏管中乙醚呈现出澄清状态后，脱脂结束，再将滤纸包取出，在抽滤装置上用蒸馏水反复洗涤；

(7)干燥称重：最后在80℃恒温干燥箱中烘干，取出黑色素，称重;

(8)计算：黑色素的含量=黑色素重量(g)/样本重量(g)×100%;

3.将壳中黑色素含量与软体部中黑色素含量进行相关性分析:

(1)数据计算整理：

每只牡蛎外壳和软体部黑色素含量数据：

表1牡蛎外壳与软体部中黑色素的含量

(2)数据分析：

由excel软件分析显示，长牡蛎外壳黑色素的含量与软体部黑色素的含量呈正相关，相关系数为0.9725；

4.结论与讨论：

牡蛎壳中黑色素含量与软体部黑色素含量之间存在很高的正相关，因此根据牡蛎壳色来选择软体部高黑色素含量牡蛎的方法是有效的，可以提高海洋经济贝类的育种效率。