CN104357060B - 香莓源抗氧化剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香莓源抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：1)、将香莓地上部分制备成香莓粉末；2)、在香莓粉末中加入50％-70％的乙醇溶液进行回流提取，提取液减压真空浓缩，得乙醇浸膏；3)采用液-液分配法对香莓的乙醇浸膏进行萃取分离；4)、取步骤3)所得的乙酸乙酯浸膏，溶于纯甲醇中，拌于100-200目硅胶H，烘干、研磨得到吸附样品的硅胶粉末；5)、采用干法上样，将硅胶粉末铺于硅胶柱上，以二氯甲烷-甲醇为流动相以100:0-100:4的体积比进行梯度洗脱，合并相似组分后浓缩，从而分别获得组分F1-F19；将组分F3-16合并后真空干燥，得抗氧化活性强的香莓源抗氧化剂。
Description
技术领域
本发明属于天然抗氧化活性物质的制备方法，特别涉及一种香莓源抗氧化物质的制备方法。
背景技术
生物体的内环境无时无刻不在生成自由基，自由基在生物体内很容易与蛋白质、不饱和脂肪酸反应，引发氧化修饰作用，成为机体衰老及与衰老相关疾病的主要诱因。同时，随着年龄的增长，机体的抗氧化防御能力却在逐渐减弱，与衰老相关的疾病如肿瘤、心血管疾病、糖尿病、白内障、老年性痴呆等发病机会大大的增加。所以，自由基与衰老相关疾病发生的分子机制之间的关系，成为了研究的新热点。为了最大限度地降低自由基对机体的损害，人们开始寻求抗氧化剂，但人工合成的抗氧化剂具有致癌性等很大的毒副作用。植物体富含黄酮类化合物等活性成分，具有很强的抗氧化活性，是天然、安全的抗氧化剂来源物。为此，植物抗氧化剂的开发与应用成为人们关注的研究领域。
香莓(Rubuspungensvar.oldhamii)作为悬钩子属植物中的一类，该属植物含有多种化学成分，包括黄酮、挥发油、萜类、鞣质、酚类等多种成分，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性，药用价值很高。而香莓同样含有一些活性成分，如《香莓植物提取物及其制备方法和其用于食品保鲜》(专利201410029388.8)发现香莓植物提取物具有一定的抗氧化效果和防腐保鲜作用，因此香莓必然有很大的利用价值，是植物源抗氧化剂的良好来源。
寻找活性高的植物源抗氧化活性成分是植物源抗氧化剂研发的重要内容之一。香莓资源分布广、蕴藏量大、利用率低。从香莓中提取分离抗氧化成分并开发成香莓源的源抗氧化剂，不仅拓宽了天然植物源食品防腐剂的来源；还能够有效开发利用香莓这一野生植物资源，为今后的深入研究与应用提供理论依据，也将进一步带动食品产业与种植产业，促进经济的可持续性发展。但是目前还未见生产香莓抗氧化剂的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种香莓源抗氧化剂的制备方法，用香莓作原料，以DPPH(二苯基苦基苯肼)自由基清除率为指标，制备抗氧化活性强的香莓源抗氧化剂，该方法工艺简单，成本低，对环境污染小，适合大规模生产。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种香莓源抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：
1)、采集香莓地上部分(茎、叶)，除杂洗净，干燥至含水率≤5％，粉碎，得到香莓粉末；
备注说明：一般粉碎至过60目；干燥例如可采用风干的方式；
2)、在香莓粉末中加入体积浓度为50％-70％的乙醇溶液进行回流提取，提取料液比1g:10-20ml，提取时间1-2h，提取温度70-90℃，提取次数为2-3次；所得的提取液减压合并后真空浓缩，得到乙醇浸膏；
3)采用液-液分配法对香莓的乙醇浸膏进行萃取分离：
将步骤2)所得的乙醇浸膏用水悬浮后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇这4种溶剂萃取，并分别减压浓缩回收各自对应的溶剂，从而分别得石油醚浸膏、氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
所述乙醇浸膏与水的重量比为1：80-120(较佳1：100)；
4)、取乙酸乙酯浸膏，溶于纯甲醇中，拌于100-200目硅胶H，烘干(于40-50℃烘干至恒重)﹑研磨(至能过200目的筛)得到吸附样品的硅胶粉末；
乙酸乙酯浸膏：纯甲醇：100-200目硅胶H的用量比为1g：0.8-1.2ml：1.8-2.2g(较佳为1g：1ml：2g)；
5)、采用干法上样，将步骤4)所得的硅胶粉末铺于硅胶柱(所用硅胶为200-300目)上，以二氯甲烷-甲醇为流动相以100:0-100:4的体积比进行梯度洗脱，用薄层色谱(所用硅胶板为GF254)检测洗脱进程，合并相似组分后浓缩，从而分别获得组分F1-F19；
将组分F3-16(为经抗氧化活性检测所得的具有抗氧化活性的组分)合并后真空干燥，得香莓源抗氧化剂。
备注说明：一般1kg香莓地上部分，配用的硅胶柱为柱体积为8×80cm，内装200-300目的硅胶550g。
作为本发明的香莓源抗氧化剂的制备方法的改进：
步骤5)的梯度洗脱为：
| 时间 | 二氯甲烷:甲醇(体积比) | 洗脱流速 |
| 0～12h | 100:0 | 25mL/min |
| ＞12～24h | 100:1 | 25mL/min |
| ＞24～48h | 100:2 | 25mL/min |
| ＞48～60h | 100:4 | 25mL/min |
作为本发明的香莓源抗氧化剂的制备方法的进一步改进：
所述步骤5)的真空干燥为：于40-50℃真空干燥至恒重。
作为本发明的香莓源抗氧化剂的制备方法的进一步改进：
步骤3)中，石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的萃取次数均分别为4次(即，每一种溶剂萃取4次后再进行下一种溶剂的萃取)。
备注说明：每种溶剂每次萃取时：用量为22000-29000ml，时间为30-40分钟。
在本发明中，首先测定不同溶剂萃取浸膏清除DPPH自由基的能力，确定乙酸乙酯相浸膏为抗氧化成分所在部位。
在本发明的步骤5)中，每100mL洗脱剂接一瓶，用薄层色谱(所用硅胶板为GF254)检测洗脱进程，合并相似组分后浓缩(真空浓缩至原体积的1/50)，从而分别得到组分F1-F19，将其分别进行抗氧化活性检测，从而得知抗氧化活性的组分为F3-16。
本发明具有的优势是：
本发明由于采用了上述技术方案，制得的抗氧化剂活性强，其对DPPH自由基清除活性(IC50值为11.34μg/mL)与Vc(维生素C)(IC50值11.30μg/mL)接近，高于化学合成的抗氧化剂BHA(丁基羟基茴香醚)(IC50值14.90μg/mL)。其制备过程简单，环境污染小，高效经济实用。可以为其它材料中抗氧化活性物质的制备提供良好的方法。
综上所述，此方法制得的香莓源抗氧化剂具有很强的抗氧化能力，是一种理想的天然抗氧化物，可广泛用于食品、药品、化妆品及化工行业，开发这种有应用前景的抗氧化物对开发香莓资源具有重要意义。
本发明的抗氧化剂的使用方法和用量等同于Vc的用法和用量。
综上所述，本发明将香莓中的抗氧化活性物质，提取纯化并加以利用，可以生产出香莓源抗氧化剂，用于抗氧化、抗衰老功能的保健品原料，或用于食品保鲜。因此，利用香莓生产抗氧化剂，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为实施例2所得的具有抗氧化活性的组分(F3-16)及其对DPPH自由基清除能力。
注：不同字母表示样品间在P＜0.05差异显著。
图2为香莓抗氧化剂清除DPPH自由基能力实验结果图。
具体实施方式
实施例1、一种香莓源抗氧化剂的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、采集1kg香莓地上部分(茎、叶)，除杂洗净，干燥(含水率≤5％)，粉碎，过60目筛，得到香莓粉末516g；
2)、在上述香莓粉末中加入50％(体积％)的乙醇溶液5160ml，进行回流提取，即，提取料液比1g:10ml，提取时间1h，提取温度70℃，共提取3次，3次的提取液合并后减压(0.09MPa)真空浓缩后得到乙醇浸膏64.7g；
3)、采用液-液分配法对香莓浸膏进行萃取分离：
将步骤2)所得乙醇浸膏用6470g水悬浮后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各溶剂分别萃取4次，相同的有机相合并后并分别减压(0.09MPa)浓缩回收溶剂，得各浸膏；具体为：得石油醚相浸膏5.8g、氯仿相浸膏8.6g、乙酸乙酯相浸膏14.3g、正丁醇相浸膏11.8g。
备注说明：上述萃取时，
每次石油醚的用量为22000ml；每次萃取时间为30分钟；
每次氯仿的用量为22000ml；每次萃取时间为30分钟；
每次乙酸乙酯的用量为22000ml；每次萃取时间为30分钟；
每次正丁醇的用量为22000ml；每次萃取时间为30分钟。
即，4次石油醚萃取，石油醚的总用量为88000ml；萃取时间总计120分钟；其余类同。
4)、测定不同溶剂萃取浸膏清除DPPH自由基的能力，确定乙酸乙酯相浸膏为抗氧化成分所在部位；
备注说明：清除DPPH自由基的能力的测定方法参照文献(D,GruzJ,StrnadM,etal.AntioxidantandantimicrobialpropertiesofTeucriumarduiniL.(Lamiaceae)flowerandleafinfusions(TeucriumarduiniL.antioxidantcapacity)[J].Foodandchemicaltoxicology,2010.48(1):113-119.)。
5)、根据步骤4)抗氧化能力测定结果，取步骤3)所得的全部乙酸乙酯浸膏，溶于14.3ml纯甲醇中，拌于适量(28.6g)硅胶H，烘干(于45℃烘干至恒重)、研磨(至能过200目的筛)得到吸附样品的硅胶粉末42.5g；
6)、采用干法上样，将步骤5)的硅胶粉末铺于硅胶柱(柱体积为8×80cm，内装200-300目的硅胶550g)上，以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱，体积比为100:0-100:4进行梯度洗脱纯化，具体如下：
| 时间 | 二氯甲烷:甲醇 | 洗脱流速 |
| 0～12h | 100:0 | 25mL/min |
| ＞12～24h | 100:1 | 25mL/min |
| ＞24～48h | 100:2 | 25mL/min |
| ＞48～60h | 100:4 | 25mL/min |
备注说明：上述洗脱的流速为25mL/min。
每100mL洗脱剂接一瓶，用薄层色谱检测洗脱进程，合并相似组分(即，第1～32瓶进行合并，第33～48瓶进行合并，第49～62瓶进行合并，第63～69瓶进行合并，第70～82瓶进行合并，第83～95瓶进行合并，第96～114瓶进行合并，第115～122瓶进行合并，第123～132瓶进行合并，第133～147瓶进行合并，第148～155瓶进行合并，第156～166瓶进行合并，第167～172瓶进行合并，第173～186瓶进行合并，第187～196瓶进行合并，第197～205瓶进行合并，第206～219瓶进行合并，第220～232瓶进行合并，第233～245瓶进行合并)，浓缩(于45℃，减压(0.09Mpa)浓缩至原体积的1/50)得到F1-F19，将其分别进行抗氧化活性检测，得知组分F3-16具备抗氧化活性；因此，合并这些抗氧化组分(即，组分F3-16)，并真空干燥(于45℃真空干燥至恒重)即得到抗氧化剂，为淡黄色粉末，质量为5.84g。
实施例2、一种香莓源抗氧化剂的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、采集1kg香莓地上部分(茎、叶)，除杂洗净，干燥(含水率≤5％)，粉碎，过60目筛，得到香莓粉末568g；
2)、在香莓粉末中加入60％的乙醇溶液8520ml，进行回流提取，提取料液比1:15，提取时间1.5h，提取温度80℃，共提取3次，3次的提取液合并后减压(0.09MPa)真空浓缩后得到浸膏得到72.3；
3)、采用液-液分配法对香莓浸膏进行萃取分离,将提取所得乙醇浸膏用7230g水悬浮后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各溶剂萃取4次，相同的有机相合并后并分别减压浓缩回收溶剂，得各浸膏；具体为：得石油醚相浸膏6.5g、氯仿相浸膏9.4g、乙酸乙酯相浸膏15.1g、正丁醇相浸膏12.6g。
备注说明：上述萃取时，
每次石油醚的用量为29000ml；每次萃取时间为40分钟；
每次氯仿的用量为29000ml；每次萃取时间为40分钟；
每次乙酸乙酯的用量为29000ml；每次萃取时间为40分钟；
每次正丁醇的用量为29000ml；每次萃取时间为40分钟。
4)、测定不同溶剂萃取浸膏清除DPPH自由基的能力，确定乙酸乙酯相浸膏为抗氧化成分所在部位；
5)、根据步骤4)抗氧化能力测定结果，取步骤3)中的所得的全部乙酸乙酯浸膏，溶于15.1ml纯甲醇中，拌于适量(30.2g)硅胶H，烘干(于45℃烘干至恒重)、研磨(至能过200目的筛)得到吸附样品的硅胶粉末43.6g；
6)、采用干法上样，将步骤5)的硅胶粉末铺于硅胶柱(柱体积为8×80cm，内装200-300目的硅胶550g)上，以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱，体积比为100:0-100:4进行梯度洗脱纯化，具体如下：
| 时间 | 二氯甲烷:甲醇 | 洗脱流速 |
| 0～12h | 100:0 | 25mL/min |
| ＞12～24h | 100:1 | 25mL/min |
| ＞24～48h | 100:2 | 25mL/min |
| ＞48～60h | 100:4 | 25mL/min |
备注说明：上述洗脱的流速为25mL/min。
每100mL洗脱剂接一瓶，用薄层色谱检测洗脱进程，合并相似组分(即，第1～32瓶进行合并，第33～48瓶进行合并，第49～62瓶进行合并，第63～69瓶进行合并，第70～82瓶进行合并，第83～95瓶进行合并，第96～114瓶进行合并，第115～122瓶进行合并，第123～132瓶进行合并，第133～147瓶进行合并，第148～155瓶进行合并，第156～166瓶进行合并，第167～172瓶进行合并，第173～186瓶进行合并，第187～196瓶进行合并，第197～205瓶进行合并，第206～219瓶进行合并，第220～232瓶进行合并，第233～245瓶进行合并)，浓缩(于45℃，减压(0.09Mpa)浓缩至原体积的1/50)得到F1-F19部分，将其分别进行抗氧化活性检测，得知组分F3-16具备抗氧化活性(如图1所示)；因此，合并这些抗氧化组分(即，组分F3-16)，并真空干燥(于45℃真空干燥至恒重)即得到抗氧化剂，为淡黄色粉末，质量为6.21g。
实施例3、一种香莓源抗氧化剂的制备方法，依次进行以下步骤：
1)采集1kg香莓地上部分(茎、叶)，除杂洗净，干燥(含水率≤5％)，粉碎，过60目筛，得到香莓粉末533g；
2)在香莓粉末中加入70％的乙醇溶液10660ml，进行回流提取，提取料液比1:20，提取时间2h，提取温度90℃，提取3次，共提取3次，3次的提取液合并后减压(0.09MPa)真空浓缩后得到浸膏68.5g；
3)采用液-液分配法对香莓浸膏进行萃取分离,将提取所得乙醇浸膏用6850mL水悬浮后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各溶剂萃取4次，相同的有机相合并后并分别减压浓缩回收溶剂，得各浸膏；具体为：得，石油醚相浸膏6.1g、氯仿相浸膏9.2g、乙酸乙酯相浸膏14.8g、正丁醇相浸膏12.1g。
备注说明：上述萃取时，
每次石油醚的用量为27000ml；每次萃取时间为35分钟；
每次氯仿的用量为27000ml；每次萃取时间为35分钟；
每次乙酸乙酯的用量为27000ml；每次萃取时间为35分钟；
每次正丁醇的用量为27000ml；每次萃取时间为35分钟。
(4)测定不同溶剂萃取浸膏清除DPPH自由基的能力，确定乙酸乙酯相浸膏为抗氧化成分所在部位；
5)根据步骤4)抗氧化能力测定结果，取步骤3)中的所得的全部乙酸乙酯浸膏，溶于14.8ml纯甲醇中，拌于适量(29.6g)硅胶H，烘干(于45℃烘干至恒重)、研磨(至能过200目的筛)得到吸附样品的硅胶粉末42.8g；
6)采用干法上样，将步骤5)的硅胶粉末铺于硅胶柱(柱体积为8×80cm，内装200-300目的硅胶550g)上，以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱，体积比为100:0-100:4进行梯度洗脱纯化，具体如下：
| 时间 | 二氯甲烷:甲醇 | 洗脱流速 |
| 0～12h | 100:0 | 25mL/min |
| ＞12～24h | 100:1 | 25mL/min |
| ＞24～48h | 100:2 | 25mL/min |
| ＞48～60h | 100:4 | 25mL/min |
备注说明：上述洗脱的流速为25mL/min。
每100mL洗脱剂接一瓶，用薄层色谱检测洗脱进程，合并相似组分(即，第1～32瓶进行合并，第33～48瓶进行合并，第49～62瓶进行合并，第63～69瓶进行合并，第70～82瓶进行合并，第83～95瓶进行合并，第96～114瓶进行合并，第115～122瓶进行合并，第123～132瓶进行合并，第133～147瓶进行合并，第148～155瓶进行合并，第156～166瓶进行合并，第167～172瓶进行合并，第173～186瓶进行合并，第187～196瓶进行合并，第197～205瓶进行合并，第206～219瓶进行合并，第220～232瓶进行合并，第233～245瓶进行合并)，浓缩(于45℃，减压(0.09Mpa)浓缩至原体积的1/50)得到F1-F19部分，将其分别进行抗氧化活性检测，得知组分F3-16具备抗氧化活性；因此，合并这些抗氧化组分(即，组分F3-16)，并真空干燥(于45℃真空干燥至恒重)即得到抗氧化剂，为淡黄色粉末，质量为6.05g。
实验1、将上述实施例1～3所得的香莓源抗氧化剂(简称抗氧化剂)进行DPPH·清除率％的检测，测定方法参照文献(D,GruzJ,StrnadM,etal.AntioxidantandantimicrobialpropertiesofTeucriumarduiniL.(Lamiaceae)flowerandleafinfusions(TeucriumarduiniL.antioxidantcapacity)[J].Foodandchemicaltoxicology,2010.48(1):113-119.)
测定方法：将抗氧化剂、阳性对照(Vc、BHA)用水分别配制成浓度为10、20、40、80、160ug/ml的待测液；
Ac：2ml水+2ml浓度为0.2mmol/mlDPPH溶液；
Ai：2ml待测液+2ml浓度为0.2mmol/mlDPPH溶液；
Aj：2ml待测液+2ml水。
将试剂放入黑暗环境中30min，在517nm处测OD值。
E(DPPH·)(％)＝(1-(Ai-Aj)/Ac)×100％
所得结果如表1所述。
根据表1，我们得知：实施例1～实施例3所得的抗氧化剂对DPPH自由基清除能力优于BHA、与Vc的清除能力相当。
表1、香莓抗氧化剂、Vc和BHA清除DPPH自由基能力的IC50值比较
| 样品 | IC50(μg/mL) |
| 香莓源抗氧化剂(实施例1) | 11.34 |
| 香莓源抗氧化剂(实施例2) | 11.33 |
| 香莓源抗氧化剂(实施例3) | 11.32 |
| Vc | 11.30 |
| BHA | 14.90 |
对比例1、
取消实施例1的步骤3)中的“依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取”，改成直接用乙酸乙酯进行萃取。即，步骤3)为：
3)、采用液-液分配法对香莓浸膏进行萃取分离,将提取所得乙醇浸膏用6470g水悬浮后用乙酸乙酯萃取，萃取4次(每次乙酸乙酯的用量为22000ml；每次萃取时间为30分钟；)，有机相合并后减压浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯相浸膏78.6g。
其余等同于实施例1。
对比例2-1、将实施例1步骤6中的流动相由“二氯甲烷-甲醇为流动相”改成“氯仿-甲醇为流动相”，其余等同于实施例1。
对比例2-2、将实施例1步骤6中的“二氯甲烷-甲醇流动相”表中二氯甲烷：甲醇的数据改成以下内容：0～12h，100:1；＞12～24h，100:2；＞24～48h，100:4；＞48～60h，100:8；其余等同于实施例1。
对比例3、将实施例1步骤6中的“合并F3-16”改成“合并F1-F19全部组分”。其余同实施例1。
对比实验、将上述所有对比例所得的抗氧化剂按照上述实验所述方法进行检测，所得结果如下：
表2各对比例所得的香莓抗氧化剂清除DPPH自由基能力的IC50值比较
| 样品 | IC50(μg/mL) |
| 实施例1 | 11.34 |
| 对比例1 | 28.85 |
| 对比例2-1 | 60.56 |
| 对比例2-2 | 56.64 |
| 对比例3 | 45.42 |
由表2可以看出，对比例1、2-1、2-2、3所得香莓抗氧化剂的抗氧化能力均不如实施例1强。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.香莓源抗氧化剂的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1)、采集香莓地上部分，除杂洗净，干燥至含水率≤5％，粉碎，得到香莓粉末；
2)、在香莓粉末中加入体积浓度为50％-70％的乙醇溶液进行回流提取，提取料液比1g:10-20ml，提取时间1-2h，提取温度70-90℃，提取次数为2-3次；所得的提取液合并后减压真空浓缩，得到乙醇浸膏；
3)、采用液-液分配法对香莓的乙醇浸膏进行萃取分离：
将步骤2)所得的乙醇浸膏用水悬浮后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇这4种溶剂萃取，并分别减压浓缩回收各自对应的溶剂，从而分别得石油醚浸膏、氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
所述乙醇浸膏与水的重量比为1：80-120；
4)、取乙酸乙酯浸膏，溶于纯甲醇中，拌于100-200目硅胶H，烘干、研磨得到吸附样品的硅胶粉末；
乙酸乙酯浸膏：纯甲醇：100-200目硅胶H的用量比为1g：0.8-1.2ml：1.8-2.2g；
5)、采用干法上样，将步骤4)所得的硅胶粉末铺于硅胶柱上，以二氯甲烷-甲醇为流动相以100:0-100:4的体积比进行梯度洗脱，用薄层色谱检测洗脱进程，合并相似组分后浓缩，从而分别获得组分F1-F19；将组分F1-F19分别进行抗氧化活性检测后，获得具有抗氧化活性的组分F3-16；将其合并后真空干燥，得香莓源抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的香莓源抗氧化剂的制备方法，其特征是：
所述步骤5)的梯度洗脱为：
。
3.根据权利要求1或2所述的香莓源抗氧化剂的制备方法，其特征是：
所述步骤5)的真空干燥为：于40-50℃真空干燥至恒重。
4.根据权利要求3所述的香莓源抗氧化剂的制备方法，其特征是：
所述步骤3)中，石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的萃取次数均分别为4次。
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