CN104356406B - 一种明胶‑多糖接枝物包覆多酚类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种明胶‑多糖接枝物包覆多酚类物质的方法。反应步骤如下：混合明胶与多糖溶液，调节溶液pH值为8.5～11.5，然后将混合溶液放置于微波反应器内维持在80～95℃下进行间歇式加热10～60min，冷却后即可得到接枝度大于20％明胶‑多糖接枝物。本发明方法工艺简单，易于控制，可操作性强，适于工业化生产，克服了传统干热法仪器设备过多、反应步骤繁琐、反应时间长、反应过程传质不均匀的不足。利用本发明制备的明胶‑多糖接枝物可以直接与茶多酚混合得到均匀分散的纳米悬浮液，实现茶多酚的纳米化包覆。

Description

一种明胶-多糖接枝物包覆多酚类物质的方法

技术领域

本发明涉及一种明胶-多糖接枝物的包覆多酚类物质的方法，属于高分子化学、生物材料、功能食品技术领域。

背景技术

明胶是一种从动物的结缔或表皮组织中的胶原部分水解出来的蛋白质。由于它的可生物降解性，低免疫原性，在食品、日化、生物医药等领域应用很广。通过多糖对明胶或者明胶材料进行改性，在明胶的水溶性、抗菌性、抗酶解性、抗蛋白吸附性质等方面有明显的改善，大大拓宽了明胶的使用范围。

利用Maillard反应制备明胶-多糖接枝物的原理是明胶分子上的自由氨基与多糖的还原性羟基在加热条件下发生反应。利用Maillard反应制备的明胶-多糖接枝共聚物可以制备得到负载多酚类纳米粒子，可以用于炎症、癌症等疾病治疗。然而，目前为止人们对明胶与多糖的Maillard反应研究较少，工艺条件、功能性质开发还有待深入。传统制备明胶-多糖接枝物Maillard反应的条件为干热法(即固相反应)，操作步骤先后涉及冷冻干燥、固相加热等多个步骤；专利文献1(201210375599.8)和专利文献2(201010504424.3)的实施例均在详细步骤的操作记载，如专利文献1的实施例1中“将溶液冷冻干燥。将冷冻干燥后的固体置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中，保持相对湿度为79％，置于60℃下进行Maillard反应12-36h得到反应产物碱法明胶-葡聚糖共价结合物。”专利文献2中的实施例部分也有同样的制备步骤。其中，冷冻干燥、固相加热过程对设备要求比较严格，冷冻干燥需要高真空条件，固相加热反应过程需要严格控制温度和湿度，所需时间较长(通常需要数天以上)，容易导致团聚、加热传质不均匀、副反应较多，影响产品的质量，不利于工业生产。

由于现有技术中，微波是指波长1mm～0.1m范围内的电磁波，频率范围是300MHz～3000GHz。微波可以用来加热，微波炉在民用、工业用上已得到了很好的普及。微波在化学反应中主要用于极性分子溶剂吸收微波能而被快速加热，而非极性分子溶剂几乎不吸收微波能，升温很小。水、醇类、羧酸类等极性溶剂都在微波作用下被迅速加热，具有反应速度快的特点。目前该方法已用于大豆蛋白-糖的Maillard反应。如

[专利文献3]：发明名称一种大豆蛋白-糖接枝改性的方法专利号200410041342.4。该文献虽然报道了通过微波Maillard反应可以制备大豆蛋白-糖接枝物，但专利文献3报道也表明反应后外观色泽的变化和反应接枝度的情况，具体描述了当接枝度大于20％，大豆蛋白-糖接枝反应产物均出现明显的颜色变化(褐变反应)，褐变产物属于是Maillard高级反应阶段产物(类黑素)。由于类黑素对健康是不利的，因此，并不利于其实际的接枝物的功能应用。也导致本领域技术人员认为微波这一技术并不利于生产有一定接枝度的蛋白-糖接枝物，无法进行后续的工业化应用。

发明内容

由于现有技术对制备明胶-多糖接枝物的诸多条件的限制，使得本领域技术人员需要进一步研发更便捷的明胶-多糖接枝物制备技术，使得其可以更高效生产包覆多酚类物质；所制得的明胶-多糖接枝物不但可有效的保证明胶-多糖接枝物的接枝度从而后续包覆的同时，可以操作更方便反应时间短。本发明提供一种的简单、高效、安全、环保的明胶-多糖接枝物包覆多酚类物质的方法。

本发明技术方案的制备步骤为：

(1)将明胶与多糖制得的混合水溶液调节pH值为8.5～11.5后，所得的混合水溶液直接进行微波辐射加热10min～60min，从而得到接枝度大于20％的明胶-多糖接枝物溶液；所述的微波辐射加热的温度控制在80～95℃，加热方式为间歇式加热；明胶与多糖的质量比在1:5～5:1之间；所述的多糖的数均分子量在1K～100K之间；

(2)将多酚类物质的溶液直接加入到所述的明胶-多糖接枝物溶液中，调节反应体系pH值为4～6；多酚类物质与明胶-多糖接枝物质量比为0.01:1～10:1之间。

所述的明胶采用碱法明胶或酸法明胶，所述的多糖采用葡聚糖、半乳甘露聚糖、普鲁兰多糖。

本发明优选所述(1)步中所得的混合水溶液直接进行微波辐射加热20min～60min，从而得到接枝度为20-40％的明胶-多糖接枝物溶液。

发明人通过研究发现是所述(1)步中调节pH值为9～10时，有较佳的接枝度的效果，特别是控制pH值为9.5～10可控制到最佳的接枝度的效果。

本发明的反应条件及设备简单，时间大大缩短在一个小时内完成，反应产物不表现明显的褐色反应，水溶性好。特别是通过控制反应时间和pH值，可以明显调节蛋白质－多糖接枝物的接枝度，部分接枝度可以达到37％。由于本发明未引入其他有毒物质，反应后也没有出现团聚现象，本发明的Maillard反应产物不需要进一步分离，可以直接应用于生物医药和食品等领域的功能材料开发。

图1为碱法明胶与葡聚糖在不同pH条件下的接枝度结果。专利文献3的研究表明，大豆蛋白与糖的微波Maillard反应，反应产物外观呈现黄色，需要超滤或离心分离。一般来说，Maillard反应程度随着pH的增加而提高，另一方面，pH的提高会引发副产物的急剧增加。因此，专利文献3的pH控制在6～8的范围内。但是，发明人通过进一步的研究意外的发现，在本发明中明胶与多糖的Maillard反应需要控制pH值8.5～11.5的范围内不但可以获得很好的接枝度，与此同时我们发现明胶-多糖接枝物的产物外观不呈现明显的黄色，未出现沉淀也无需分离。当pH>9.5时，接枝度随着pH的增加有所下降，pH为11.5时接枝度仍然在20％以上。发明人通过研究同时也发现，当pH值为12得到的微波反应产物呈现明显的黄色。由于微波反应对化学反应作用的机理研究是十分复杂与现有技术中采用的固相反应也完全不同，除了热效应之外，还存在非热效应。通过与普通水浴加热对比，微波辐射加热能够大大提高反应速度，说明微波辐射对反应的促进机理主要来自于非热效应，能够改变某些蛋白质或糖分子的结构，促使反应活性部位改变，反应活化能发生改变。本发明在较高pH值、较长时间40min下仍能够获得较高接枝度(>20％)且无明显褐变现象的Maillard反应产物，发明人认为可能是微波辐射对明胶与多糖的接枝反应的作用机理不同于大豆蛋白与糖接枝反应的作用机理。对于线状高分子明胶，微波辐射下较高pH主要促使明胶快速与多糖发生Maillard初级阶段反应。而对于球状高分子大豆蛋白，微波辐射下较高pH反而更容易促使其他副反应的发生。

所述的明胶-多糖接枝物可用于直接包埋多酚类物质。所述多酚类物质采用姜黄素、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、茶多酚、白藜芦醇、单宁。通过直接混合接枝物与多酚溶液和调节pH的方法，便可以形成纳米粒子，此时多酚类物质在纳米粒子中的包封率可以达到98％。该纳米粒子具有以蛋白质和多酚为核(主要成分为明胶)、多糖为壳的结构，即蛋白质分子主要位于纳米粒子的内部，而亲水性的多糖位于纳米粒子的外部，起着稳定界面的作用。利用本发明获得的负载姜黄素的纳米粒子，提高了姜黄素的水溶性，具有很好的单分散性，用动态光散射测定流体力学直径大约在70～500nm之间(图2)。对比专利文献1，通过微波Maillard反应获得的接枝物用于包埋多酚类物质，可以达到固相反应获得接枝物同样的包封效果和分散效果，但是固相Maillard反应对反应设备要求较高、反应工艺较为繁琐、反应时间尤为冗长。

本发明较现有技术相比，具有以下优点及有益效果：本发明采用微波加热法，制备了明胶-多糖接枝物。本发明方法设备工艺简化，反应时间大大缩短，避免使用对人体和环境有害的化学试剂，绿色环保，安全无毒，产物无需分离。主要通过控制反应pH和反应时间实现对接枝度的调控，并避免生成类黑素一类的褐变物质。本发明方法工艺简单，易于控制，可操作性强，适于工业化生产，克服了传统干热法仪器设备过多、反应步骤繁琐、反应时间长、反应过程传质不均匀的不足。利用本发明制备的明胶-多糖接枝物可以直接与多酚类物质混合得到均匀分散的纳米悬浮液，实现多酚类物质的纳米化包覆。本发明制备的接枝物在开发多酚纳米粒子、提高多酚水溶性方面有重要的应用价值。

附图说明

图1.明胶-葡聚糖接枝物的接枝度与pH/反应时间关系图

图2.负载姜黄素的明胶-葡聚糖纳米粒子的粒径分布图

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1.

碱法明胶-葡聚糖接枝物的制备

分别将酸法明胶、碱法明胶与不同分子量的葡聚糖进行Maillard反应合成碱法明胶-葡聚糖共价结合物，方法如下：将碱法明胶溶于去离子水中，配成5mg/mL的蛋白质溶液后分别加入分子量为10K、40K、70K和500K的葡聚糖到上述溶液中配制成不同分子量的葡聚糖和碱法明胶的混合溶液。搅拌混合后调节溶液的pH值为9-10，然后将混合溶液置于微波反应器内，微波炉功率设置为300W，间歇加热3min；然后冰浴3min，加热总时间为40min。反应得到产物碱法明胶-葡聚糖接枝物，溶液外观澄清，不呈现明显黄色。

表1.不同分子量的葡聚糖与酸法明胶、碱法明胶形成的接枝度分析结果

葡聚糖数均分子量	酸法明胶	碱法明胶
			10K	27.6％	30.6％
40K	31.4％	31.2％

70K	34.0％	34.5％
			500K	37.6％	31.1％

实施例2.

其他明胶-多糖接枝物的制备

采用上述类似方法制备其他明胶-多糖接枝物，其接枝度结果如表2所示。

表2.不同种类多糖与酸法明胶、碱法明胶形成的接枝度分析结果

多糖种类	酸法明胶	碱法明胶
			普鲁兰多糖	33.7％	31.9％
葡聚糖	30.5％	32.3％
			半乳甘露聚糖	30.6％	29.4％

实施例3.

负载姜黄素的纳米粒子制备

采用实施例1的方法制备碱法明胶-葡聚糖接枝物，pH为9.5，微波反应温度为90℃，反应时间为40min，葡聚糖分子量为70KDa，明胶与葡聚糖质量比为1:1。配制10mg/mL的姜黄素溶液。将接枝共聚物溶液稀释至1mg/mL，在搅拌下将姜黄素溶液逐滴滴入，使得姜黄素和接枝共聚物的终浓度比为0.2:1.0，然后调节溶液pH值为4～6，即得到包封率为98％的姜黄素纳米粒子。光散射分析结果表明所制备的纳米粒子粒径为180nm，分散性指数为0.08。

实施例4.

其他多酚类纳米粒子的制备

采用上述类似方法包封其他多酚类活性物质，制备得到不同的多酚类纳米粒子，其光散射分析及包封率和负载量结果如表3所示。

表3.碱法明胶-葡聚糖接枝物负载多酚类活性物质的纳米粒子的粒径分布及包封率和负载量

表4.酸法明胶-葡聚糖接枝物负载多酚类活性物质的纳米粒子的粒径分布及包封率和负载量

Claims (6)

1.一种明胶-多糖接枝物包覆多酚类物质的方法，其特征在于，制备步骤为：

(1)将明胶与多糖制得的混合水溶液调节pH值为8.5～11.5后，所得的混合水溶液直接进行微波辐射加热10min～60min，从而得到接枝度大于20％的明胶-多糖接枝物溶液；所述的微波辐射加热的温度控制在80～95℃，加热方式为间歇式加热；明胶与多糖的质量比在1:5～5:1之间；所述的多糖的数均分子量在1K～100K之间；

(2)将多酚类物质的溶液直接加入到所述的明胶-多糖接枝物溶液中，调节反应体系pH值为4～6；多酚类物质与明胶-多糖接枝物质量比为0.01:1～10:1之间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多酚类物质为茶多酚、EGCG、姜黄素、单宁或白藜芦醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多糖采用葡聚糖、半乳甘露聚糖和普鲁兰多糖。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(1)步中所得的混合水溶液直接进行微波辐射加热20min～60min，从而得到接枝度为20～40％的明胶-多糖接枝物溶液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述(1)步中调节pH值为9～10。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述(1)步中调节pH值为9.5～10。