CN104350051A - 用于糖尿病的异*唑治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从胰腺β细胞诱导合成和分泌胰岛素的化合物和方法。所述方法可以在体外、离体(例如在来自成体哺乳动物组织的分离物中)或体内发生。本文描述的化合物和方法发现可用于治疗糖尿病。

Description

用于糖尿病的异*唑治疗剂
发明背景
本申请要求2011年11月23日提交的美国临时申请系列号61/563,419和2011年12月2日提交的61/566,056的优先权权益，两个申请的全部内容通过引用并入本文。
本发明在政府支持下在国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)颁发的NIH P60 DK079626，R37 DK34128和R01 DK55310下进行。政府在本发明中具有某些权利。
1.技术领域
本发明一般地涉及细胞生物学、发育生物学和医药领域。更特别地，其涉及与刺激胰岛素产生和治疗糖尿病相关的方法和组合物。
2.背景技术
美国几乎三分之一的成年群体因异常葡萄糖耐量或异常的高空腹葡萄糖而存在2型糖尿病的风险(Genuth等，2003)。2型糖尿病以惊人的速率增加，并且现在不仅在成人中还在长期超重的儿童中发现。当循环中葡萄糖和其他营养物的浓度上升时，胰腺β细胞通过分泌胰岛素在葡萄糖稳态中起独特的作用(Newgard和McGarry，1995)。胰岛素促进了大多数组织的适当营养物利用和储存。β细胞容易受到来自持续营养过剩之分泌压力的伤害。在2型糖尿病的形成期间，胰腺β细胞逐渐变得不能产生和分泌足够的胰岛素以防止高血糖(Genuth等，2003；Muoio和Newgard，2008；Rutter和Parton，2008)。维持血糖正常的鉴别策略对限制糖尿病及其破坏性结果来说是必要的(Halban等，2010；Borowiak和Melton，2009)。
除了胰岛素分泌以外，营养物还在生物合成途径中于许多步骤调节胰岛素的产生，包括前激素原的切割、翻译和转录(Redmon等，1994；Xu等，1998；Wicksteed等，2007；Steiner等，2009；Goodge和Hutton，2000)。补充分泌的胰岛素的即时事件包括预先存在之mRNA的翻译和激素加工。在更长的时间尺度上，新胰岛素基因转录维持用于按需求翻译的mRNA储库(pool)。
通过以组织限制性方式表达之葡萄糖敏感的一组转录因子的协作来调节胰岛素基因转录(Ohneda等，2000；Aramata等，2005)。在这些当中最重要的是，已显示碱性-环-螺旋(basic-loop-helix)(bHLH)因子BETA2(也称为NeuroD1)、同源结构域因子PDX-1和碱性亮氨酸拉链因子MafA协同地活化胰岛素基因启动子并且对于葡萄糖刺激的胰岛素基因转录来说是必要的。PDX-1和BETA2的突变已与年轻的成年发病型糖尿病(maturity onset diabetes of young，MODY)相联系，并且分别分类为MODY4和MODY6基因(Habener和Stoffers，1998；Vaxillaire和Froguel，2008)。
在中枢和外周神经系统中对于神经元祖细胞分化的神经元发育期间需要BETA2(Kageyama等，1997；Chae等，2004)。BETA2还在其他器官(包括肺、肠和胰腺)神经内分泌细胞的发育中起到重要的作用。在成体中，BETA2的主要功能在胰腺β细胞中，尽管在脑的海马CA1区的持续神经发生也需要它。在神经元和胰腺发育期间，bHLH蛋白的神经元素(neurogenin，Ngn)家族是BETA2的直接转录调节因子(Huang等，2000；Sommer等，1996)。虽然Ngn1和2只在神经元谱系(neuronal lineage)中作用，但是Ngn3是诱导BETA2在胰腺β细胞中表达的家族成员。一些研究已经报道了一种或更多种这些因子的表达帮助促进胰腺内分泌细胞从多种干细胞群的分化(Borowiak和Melton，2009；Gasa等，2004)。然而，未了解在胰腺发育中起到的准确作用。
发明内容
因此，根据本发明，提供了诱导从胰岛β细胞产生和/或分泌胰岛素的方法，其包括使所述细胞与式(I)化合物：
或其可药用盐相接触，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基(thiophenyl)或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(alkanediyl)(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、芳基(C≤12)或芳烷基(C≤15)；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
在特别的组合中，R1为式(A)的取代基，G还可为S，且R4、R5或R6还可为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R2可为氢。
在任一上述实施方案中，R3可为-NR11R12，包含其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基，且特别地其中R12或R13为环丙基。
所述方法还可使用式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
其中G为S，R4、R5或R6可特别地为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R11可为氢。
在任一上述实施方案中，R12可为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
所述化合物的特别实例是：
或其可药用盐。
在任一上述实施方案中，所述细胞位于动物对象中。
在任一上述实施方案中，离体进行所述细胞的接触。
在另一个实施方案中，提供了治疗对象中糖尿病的方法，其包括向所述对象施用式(I)化合物：
或其可药用盐，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、芳基(C≤12)或芳烷基(C≤15)；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
在特别的组合中，R1为式(A)的取代基，G还可为S，且R4、R5或R6还可为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R2可为氢。
在任一上述实施方案中，R3可为-NR11R12，包含其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基，且特别地其中R12或R13为环丙基。
所述方法还可使用式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
其中G为S，R4、R5或R6可特别地为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R11可为氢。
在任一上述实施方案中，R12可为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
所述化合物的特别实例是：
或其可药用盐。
在任一上述实施方案中，所述细胞位于动物对象中。
在任一上述实施方案中，离体进行所述细胞的接触。
治疗对象中糖尿病的方法，其包括(a)使胰岛β细胞离体与式(I)化合物相接触，以及(b)将所述胰岛β细胞施用于所述对象，其中式(I)是：
或其可药用盐，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、芳基(C≤12)或芳烷基(C≤15)；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
在特别的组合中，R1为式(A)的取代基，G还可为S，且R4、R5或R6还可为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R2可为氢。
在任一上述实施方案中，R3可为-NR11R12，包含其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基，且特别地其中R12或R13为环丙基。
所述方法还可使用式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
其中G为S，R4、R5或R6可特别地为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R11可为氢。
在任一上述实施方案中，R12可为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
所述化合物的特别实例是：
或其可药用盐。
在另一个实施方案中，提供了使胰岛β细胞再活化的方法，其包括使所述细胞与式(I)化合物：
或其可药用盐相接触，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、芳基(C≤12)或芳烷基(C≤15)；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
在特别的组合中，R1为式(A)的取代基，G还可为S，且R4、R5或R6还可为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R2可为氢。
在任一上述实施方案中，R3可为-NR11R12，包括其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基，且特别地其中R12或R13为环丙基。
所述方法还可使用式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
其中G为S，R4、R5或R6可特别地为氢，包括其中R4、R5和R6每一个均为氢。
在任一上述实施方案中，R11可为氢。
在任一上述实施方案中，R12可为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
所述化合物的特别实例是：
或其可药用盐。
在任一上述实施方案中，所述细胞位于动物对象中。在任一上述实施方案中，离体进行所述细胞的接触。
还提供了具有下式的化合物：
其任选地配制为包含分散于可药用缓冲剂、载体、稀释剂或赋形剂中之化合物的组合物。
当应用于细胞时，本文使用术语“接触”或“暴露”以描述通过其将本发明的化合物递送至靶细胞或与靶细胞直接并置的过程。
术语“有效”，当所述术语用于说明书和/或权利要求书中(例如“有效量”，意指足够达到希望的、期望的或预期的结果。
如本文使用的“治疗”是指为了获得疾病或健康相关状况的治疗益处的目的而向对象施用或应用治疗剂或者对对象执行过程或方式(modality)。
整个本申请使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”指相对于病症的医药治疗促进或增强对象健康的任何事件。这包括但不限于疾病体征或症状之频率或严重性的降低。
具体地预期关于本发明一个实施方案讨论的任何限制可应用到本发明任何其他的实施方案。此外，本发明的任何组合物可以用于本发明的任何方法，并且可使用本发明的任何方法来产生或利用本发明的任何组合物。
在权利要求书中术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确地说明仅指替代方案或者替代方案互相排斥，尽管本公开内容支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。
整个本申请中，术语“约”用来表明值包含对于用于进行测定所述值之装置和/或方法的误差标准差。
如本文说明书所使用的，无量词修饰的名词可意指一个或更多个，除非另有清楚的说明。如本文权利要求中所使用的，当与词“包含”联合使用时，无量词修饰的名词可意指一个或多于一个。如本文使用的“其他(another)”可意指至少第二个或更多个。
本发明的另一些目的、特征和优点将从下面详细的描述中变得明显。然而，应理解，详细的描述和特定的实例虽然说明了本发明优选的实施方案，但是仅通过举例说明的方式给出，因为各种在本发明精神和范围内的变化和修饰将从所述详细的描述中对本领域技术人员来说变得明显。
附图说明
下面的图构成本说明书的部分，并被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参考这些图的一幅或更多幅并结合本文呈现的一些具体实施方案的详细描述来更好地理解。
图1A-E.Isx(LSH-1)诱导胰岛素和转录因子在原代培养的人胰岛中 的表达。(图1A)用载剂或40μM Isx处理已经在RPMI160中培养6个月的原代人胰岛1或2天。通过Taqman定量RT-PCR评估人胰岛素和胰高血糖素基因的表达。(图1B)通过ELISA经24小时测量从用Isx或载剂处理1或2天之胰岛的胰岛素分泌。(图1C)培养3mo的胰岛和新鲜胰岛的总胰岛素含量，各自用Isx或DMSO处理48小时。(图1D)在用DMSO(8天)或40μM Isx处理2、4或8天之培养1年的胰岛中胰腺基因诱导的时间进程。(图1E)使用针对培养2个月并用Isx或载剂处理48小时之胰岛的胰岛素、BETA2、神经元素3(Ngn3)和MafA的抗体进行的免疫组织化学染色。核用DAPI染色。
图2A-E.在 MIN6细胞中Isx(LSH-1)活化胰岛素表达并改善β细 胞功能。(图2A)用5-80μM Isx处理24小时或DMSO(0.08％-类似于Isx的最高浓度)处理之MIN6细胞的剂量响应关系。使用针对BETA2/NeuroD1、MafA、PDX-1、pERK1/2(pT183/pY185)、乙酰化的组蛋白AcH4-K5K8K12K16和AcH3K9以及总组蛋白H3的抗体对全细胞裂解物(40μg)进行免疫印迹。(图2B)如图2A中用Isx处理24小时之MIN6细胞中的鼠胰岛素1和胰岛素2基因表达的定量RT-PCR。(图2C)在MEK1/2抑制剂U0126存在或不存在24小时的情况下，来自用Isx或载剂预处理48小时的MIN6细胞15分钟的GSIS。(图2D)在用Isx处理24或48小时的MIN6细胞中通过ELISA测量的胰岛素含量。(图2E)在用Isx预处理48小时的MIN6细胞中通过葡萄糖、氨基酸(AA)和毒蜥外泌肽-4(Exendin-4，Ex-4)单独或组合地诱导GSIS。
图3A-E.Isx(LSH-1)活化调节胰岛素基因表达和胰岛素产生的转录 因子。(图3A)用BETA2、MafA、PDX-1或者(图3B)WT MafA或突变体MafA转染，用Isx或载剂处理24小时的HEK293细胞中胰岛素启动子报道子(insulin promoter reporter)的活性。(图3C)使用来自过表达myc-BETA2细胞之抗乙酰基赖氨酸(Ac-K)和抗BETA2对抗myc免疫沉淀物(immunoprecipate)的免疫印迹。(图3D)与响应于10分钟葡萄糖刺激之MIN6细胞中胰岛素启动子缔合的MafA和BETA2的染色质免疫沉淀(ChIP)分析(图3E)。
图4A-G.Isx(LSH-1)是HAT活化剂。(图4A)在用指定的抑制剂预处理16小时然后用载剂或Isx处理之MIN6细胞中乙酰化组蛋白的免疫印迹。(图4B-C)在来自用Isx或DMSO处理24小时之MIN6细胞的50μg核提取蛋白中的HDAC(图4B)和HAT(图4C)活性。添加曲古菌素A(Trichostatin A，TSA；2μM)作为阳性对照。HeLa核提取物也作为阳性对照。(图4D-E)来自不存在(图4D)或存在(图4E)p300表达48小时、用Isx或10μM U0126预处理24小时之MIN6细胞核提取物的HAT活性。(图4F)在用Isx和/或U0126预处理24小时后，在MIN6细胞中于葡萄糖(Gluc)刺激下p300与胰岛素基因启动子缔合的ChIP分析。使用如图1A-E的t检验进行统计分析。*P≤0.05；**P≤0.01。(图4G)Isx作用的简化视图。
图5A-E.在人胰岛培养物中通过Isx(LSH-1)诱导的基因表达。(图5A)在本研究中使用的先导化合物N-环丙基-5-(噻吩-2-基)异唑-3-甲酰胺(Isx)的结构。(图5B)从如图1D培养1年的人胰岛中通过Sybr-GreenqPCR分析相关胰岛因子的表达谱。(图5C)在培养2个月之人胰岛中的胰岛素免疫组织化学染色。核用DAPI染色。(图5D)从培养6个月用载剂(DMSO)或Isx处理24小时之人胰岛的全细胞提取物的免疫印迹。(图5E)用DMSO(载剂)或Isx处理培养6个月的人胰岛48小时。为了表明异唑驱动的β细胞功能增加所需要的信号传导途径(以GSIS度量)，为了持续异唑处理还用载剂(Veh)、10μM U0126(U)、10μM硝苯吡啶-BAPTA(N-B)或0.1μM渥曼青霉素(wortmannin)(W)处理经异唑处理的胰岛。
图6.在MIN6细胞中Isx(LSH-1)处理的时间进程。来自在含有4.5mM葡萄糖的完全DMEM中生长24小时并用20μM Isx处理15分钟至24小时之MIN6细胞全细胞提取物的免疫印迹。用DMSO处理对照(0分钟)24小时。
图7A-C.在HEK293细胞中的瞬时转染和胰岛素报道子测定。(图7A)在HEK293细胞中，Beta2：myc、Pdx-1：myc和MafA：myc单独地或组合地与大鼠胰岛素1启动子(-410，+1)荧光素酶报道子(pGL3-rIns)一起转染。通过仅用空pcDNA载体(vector)的转染评估启动子的基础活性。用载剂或20μM异唑处理经转染的细胞24小时。使用sv40-海肾荧光素酶(Renilla luciferase)作为内部对照。(图7B)如(图7A)通过使用NeuroD1、PDX-1和cMaf抗体的免疫印迹测定在HEK293细胞中转染的重组因子Beta2：myc、Pdx-1：myc和MafA：myc的表达。(图7C)在用载剂或异唑处理24小时之HEK293细胞中经转染的WT和突变体MafA：myc的表达谱。
图8A-D.Isx(LSH-1)刺激的HAT活性。(图8A)Isx处理24小时以及WT ERK2(W)或激酶失活(dead)的K52R ERK2(R)对在HEK293细胞中转染的p300以及(图8B)其他HAT(CBP、PCAF和GCN5-L2)的HAT活性的组合作用。在预处理48小时后，与HDAC抑制剂(如曲古菌素A(TSA)或丙戊酸(VPA))相比，Isx对MIN6细胞中的GSIS(图8C)以及P19祖细胞中的Nkx2.5启动子活性(图8D)的特定作用。
图9.异 唑化合物结构。
图10.在MIN6(β细胞系)中使用大鼠胰岛素报道子活性的报道子 测定。
图11.在MIN6中使用大鼠胰岛素报道子活性的剂量-响应测定。
图12.在具有Isx化合物的MIN6细胞中内源胰岛素表达的诱导。
图13.胰岛素启动子报道子测定。将胰岛素启动子荧光素酶报道子转染至用多种异唑分子或DMSO(载剂)处理24小时的MIN6细胞中。
图14A-B.(图14A)与仅用DMSO相比，用20μM Isx衍生物对MIN6细胞的急性处理诱导了迅速的细胞内钙内流。(图14B)在用20μMIsx衍生物且在4或20mM葡萄糖存在下或者用20mM葡萄糖加1×氨基酸急性刺激后，通过ELISA测量胰岛素分泌。
图15A-B.响应于用1μM LSH-097预处理48小时的MIN6细胞中数种促分泌素的信号传导(图15A)和30分钟后的胰岛素分泌(图15B)。
图16A-B.通过比率计量Fura-2荧光(ratiometric Fura-2fluorescence)在用DMSO(载剂)或5μM Isx衍生物LSH-001、LSH-018和LSH-097预处理30小时之MIN6细胞中的细胞内钙内流(图16A)。在用各促分泌素刺激后钙内流的峰(图16B)。
图17A-B.(图17A)使用经BSA对照或1mM FFA(油酸盐∶棕榈酸盐2∶1)处理3天，随后用5μM LSH-18在最后一天处理之MIN6细胞的实验设计。通过(图17A)葡萄糖诱导的ERK1/2活化以及(图17B)葡萄糖诱导的胰岛素分泌来评估β细胞功能。
图18A-B.基因表达谱。(图18A)通过培养2个月并用10μM Isx衍生物(LSH-1、LSH-18、LSH-18、LSH-20、LSH-49)处理7天之人胰岛的qPCR测定基因表达谱。(图18B)通过葡萄糖诱导胰岛素分泌1小时测定β细胞功能。
图19.异 唑分子的结构。
举例性实施方案的描述
本发明通过提供诱导胰岛素表达和分泌以及治疗糖尿病的化合物克服了现有技术的缺陷。本发明者之前通过在小鼠多能干细胞中为编码同源结构域转录因子Nkx2.5基因的活化剂筛选化学文库鉴定了3，5-二取代的异唑小分子家族(Isx)(Sadek等，2008)。他们在并行研究(collateralstudy)中发现虽然最初寻求作为心源性小分子，但是Isx在多种类型的神经祖细胞中具有强神经元性活性(Schneider等，2008)。所述活性部分通过BETA2/NeuroD1表达的化学诱导介导。由于BETA2在胰腺发育和胰腺β细胞的胰岛素产生中的重要性，所以在本研究中本发明者调查了Isx对β细胞性质的作用。他们发现所述分子提高了胰岛素的产生和β细胞的功能，并通过人胰岛遵循长期离体培养恢复了胰岛素产生。他们还提供了由Isx引起改善β细胞本质行为之变化的初始特征。本发明的这些和其他方面在下面详细陈述。
A.本发明的化合物
可认为本发明的化合物衍生自异唑。下列化合物是本发明某些化合物的代表：
式(I)化合物：
或其立体异构体、溶剂化物、水合物或可药用盐，其中X为O或NH，Y为S或O且R为H、取代的或未取代的烷基(例如C1-C6烷基或C3-C6环烷基)、或者取代的或未取代的烯基(例如C2-C6烯基)、或者取代的或未取代的炔基(例如C2-C6炔基)。在某些实施方案中对于式(I)的化合物，存在前提条件，使得前提是如果X为O，则R必须是取代的或未取代的C3-C6环烷基；和/或如果X为NH，则R不能是吡嗪基取代的C1-C6烷基；
式(Ia)、(Ib)或(Ic)化合物：
其中R1为取代的或未取代的苯基、未取代的吡咯基、未取代的吡啶基、未取代的呋喃基、未取代的噻吩基、未取代的苯并呋喃基、未取代的苯并[b]苯硫基或未取代的噻唑基。任何这些R1取代基也可以被取代；
式(II)化合物：
其中：R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：RA、RB和RC各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、氰基、硝基和羰基基团；并且G为O、-NH或S；R2为：氢、羟基、卤素、硝基、芳基、烷基、烷氧基、烯基、烯基氧基、炔基、炔基氧基、芳烷基、-CHO、-C(O)R9、-OC(O)R9、-OC(O)OR9、-O(CN)OR9、-C(O)NR9R10、-OC(O)NR9R10、-NR9OR5或-SO3R9；其中R9和R10各自独立地为氢、烷基、芳基或芳烷基；R3为-NH-O-烷基、-NH-OH、-OR11或-NR11R12，其中R11和R12各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基或者芳烷基；或者R11和R12一起形成环状基团；或者R11和R12与它们所连接的氮一起形成环状基团；X为O或-NR13，其中R13为氢、烷基、芳基或芳烷基；或者其立体异构体、溶剂化物、水合物或可药用盐；
以及具有式(V)的化合物
其中：ABD环包含两个不邻接的双键；A、B和D各自独立地为S、N、O、C、-NR14、-CR15或-CR15R16，其中R14为氢、卤素、烷基、芳基或芳烷基；且R15和R16各自独立地为氢、羟基、卤素、硝基、芳基、烷基、烷氧基、烯基、烯基氧基、炔基、炔基氧基、芳烷基、-CHO、-C(O)R9、-OC(O)R9、-OC(O)OR9、-O(CN)OR9、-C(O)NR9R10、-OC(O)NR9R10、-NR9OR5或-SO3R9；其中R9和R10各自独立地为氢、烷基、芳基或芳烷基，前提是A、B和D的至少两个包含S、N或O；R1为烷基、-CH＝CH-芳基或芳基；且R3为烷基、芳基、芳烷基、-OR4或-NR4R5，其中：R4和R5各自独立地为氢、烷基、芳基或芳烷基；或者R4和R5一起形成环状基团；或者R4和R5与它们所连接的氮一起形成环状基团。在某些实施方案中关于式(V)化合物，存在前提条件，使得将式(Va)化合物被排除：
其中R18为烷基(例如低级烷基或环戊基)，或者烯基(例如低级烯基或烯丙基)，且G为O或S。
B.化学定义
当在上下文中使用化学基团时，“氢”意指-H；“羟基”意指-OH；“氧代”意指＝O；“卤素”独立地意指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”意指-NH2(对于含有术语氨基之基团(例如烷基氨基)的定义参见下文)；“羟基氨基”意指-NHOH；“硝基”意指-NO2；亚氨基意指＝NH(对于含有术语亚氨基之基团(例如烷基亚氨基)的定义参见下文)；“氰基”意指-CN；“异氰酸酯”意指-N＝C＝O；“叠氮基”意指-N3；在单价环境中“磷酸盐/酯”意指-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价环境中“磷酸盐/酯”意指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”意指-SH；且“硫代(thio)”意指＝S。
在上下文的化学式中，符号“-”意指单键，“＝”意指双键，且“≡”意指三键。符号“____”代表任选的键，如果存在，其为单键或双键。符号代表单价或双键。因此，例如，结构包括结构和如本领域技术人员将理解的，没有一个这样的环原子形成多于一个双键的部分。当符号与键垂直交叉画出时，其表示基团的连接点。注意连接点通常仅对较大基团以这种方式鉴定，从而帮助读者迅速并明白地鉴定连接点。符号意指单键，其中连接至楔形厚端的基团在“页外(out of the page)”。符号意指单键，其中连接至楔形厚端的基团在“页内(into the page)”。符号意指单键，其中构型(例如，R或S)或者几何形状未定义(例如，E或Z)。
本申请显示的在结构原子上任何未定义的价(valency)隐含地表示结合到该原子的氢原子。当基团“R”在环系统上描述为“浮动基团(floatinggroup)”时，例如在下式中：
则R可代替连接到任何环原子的任何氢原子，包括描绘、隐含或清楚定义的氢，只要形成了稳定的结构。当基团“R”在稠环系统上描述为“浮动基团”时，例如在下式中：
则R可代替连接到任一稠环之任何环原子的任何氢原子，除非另有指定。可代替的氢包括描绘的氢(例如上式中连接N的氢)、隐含的氢(例如上式中未示出但理解为存在的氢)、清楚定义的氢和任选的氢，其存在依赖于环原子的鉴定(例如连接到基团X的氢，当X等于-CH-时)，只要形成了稳定的结构。在描述的实例中，R可以位于稠环系统的5元环或6元环上。在上式中，紧接在附有括号之基团“R”的下标字母“y”代表数字变量。除非另有指定，否则该变量可以为0、1、2或大于2的任何整数，仅被环或环系统之可代替氢原子的最大数限制。
对于下面的基团和类别，之后附加的下标还如下定义基团/类别：“(Cn)”定义了在基团/类别中碳原子的准确数(n)。“(C≤n)”定义了可存在于基团/类别中碳原子的最大数(n)，对于所述基团最小数尽可能地小，例如，应理解在基团“烯基(C≤8)”或类别“烯(C≤8)”中之碳原子的最小数为2。例如，“烷氧基(C≤10)”指明那些烷氧基基团具有1至10个碳原子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或者可由其衍生的任何范围(例如3至10个碳原子))。(Cn-n′)定义了基团中碳原子的最小数(n)和最大数(n′)。类似地，“烷基(C2-10)”指明那些烷基基团具有2至10个碳原子(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10，或者可由其衍生的任何范围(例如3至10个碳原子))。
本文使用的术语“饱和”意指如此修饰的化合物或基团，其不具有碳-碳双键和碳-碳三键，除了如下所记载的。该术语不排除碳-杂原子多重键，例如碳氧双键或碳氮双键。此外，其不排除可以作为酮基-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构部分发生的碳-碳双键。
当术语“脂肪族”不与修饰语“取代”一起使用时，表示如此修饰的化合物/基团，其为无环的或环状的，但是为非芳香性的烃化合物或基团。在脂肪族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳香性环(脂环)连接在一起。脂肪族化合物/基团可以为饱和的，其通过单键连接(烷/烷基)；或者不饱和的，具有一个或更多个双键(烯/烯基)或者具有一个或更多个三键(炔/炔基)。当术语“脂肪族”不与修饰语“取代”一起使用时，仅有碳和氢原子存在。当该术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。
当术语“烷基”不与修饰语“取代”一起使用时指单价饱和的脂肪族基团，碳原子作为连接点，线性或分支、环、环状或无环结构并且无除了碳和氢外的原子。因此，本文使用的环烷基为烷基的子集。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr)、-CH(CH3)2(异-Pr)、-CH(CH2)2(环丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基)、-CH2C(CH3)3(新戊基)、环丁基、环戊基、环己基和环己基甲基为烷基基团的非限制性实例。当术语“烷二基”不与修饰语“取代”一起使用时指二价饱和脂肪族基团，其具有一个或两个饱和碳原子作为连接点，线性或分支、环、环状或无环结构，无碳-碳双键或三键并且无除了碳和氢外的原子。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2CH2-和为烷二基基团非限制性的实例。当术语“亚烷基”不与修饰语“取代”一起使用时指二价基团＝CRR′，其中R和R′独立地为氢、烷基或者R和R′合在一起表示具有至少两个碳原子的烷二基。亚烷基基团的非限制性实例包括：＝CH2、＝CH(CH2CH3)和＝C(CH3)2。当任何这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。以下的基团为取代的烷基基团的非限制性实例：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“卤代烷基”是取代的烷基的子集，其中一个或更多个氢已经被卤素基团取代并且除了碳、氢和卤素外没有其他原子存在。基团-CH2Cl为卤代烷基的一个非限制性实例。“烷”指化合物H-R，其中R为烷基。术语“氟烷基”是取代的烷基的子集，其中一个或更多个氢已经被氟代基团取代并且除了碳、氢和氟外没有其他原子存在。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3为氟烷基基团的非限制性实例。“烷”指化合物H-R，其中R为烷基。
当术语“烯基”不与修饰语“取代”一起使用时指单价不饱和的脂肪族基团，碳原子作为连接点，线性或分支、环、环状或无环结构，至少一个非芳香性的碳-碳双键，无碳-碳三键并且无除了碳和氢外的原子。烯基基团的非限制性实例包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CH-C6H5。当术语“烯二基”不与修饰语“取代”一起使用时指二价不饱和的脂肪族基团，其具有两个碳原子作为连接点，线性或分支、环、环状或无环结构，至少一个非芳香性的碳-碳双键，无碳-碳三键并且无除了碳和氢外的原子。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和为烯二基基团的非限制性实例。当这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr为取代的烯基基团的非限制性实例。“烯”指化合物H-R，其中R为烯基。
当术语“炔基”不与修饰语“取代”一起使用时指单价不饱和的脂肪族基团，碳原子作为连接点，线性或分支、环、环状或无环结构，至少一个碳-碳三键并且无除了碳和氢外的原子。如本文使用的，术语炔基不排除一个或更多个非芳香性碳-碳双键的存在。基团-C≡CH、-C≡CCH3、和-CH2C≡CCH3为炔基基团非限制性的实例。当术语“炔二基”不与修饰语“取代”一起使用时指二价不饱和的脂肪族基团，两个碳原子作为连接点，线性或分支、环、环状或无环结构，至少一个碳-碳三键并且无除了碳和氢外的原子。当这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或-S(O)2NH2代替。“炔”指化合物H-R，其中R为炔基。
当术语“芳基”不与修饰语“取代”一起使用时指单价不饱和的芳族基团，芳香碳原子作为连接点，所述碳原子形成一个或更多个6元芳香性环结构的部分，其中环原子都为碳并且其中基团不由除了碳和氢外的原子组成。如果存在多于1个环，则所述环可以是稠合的或非稠合的。如本文使用的，该术语不排除一个或更多个连接到第一芳香环或任何存在的其他芳香环的烷基基团(碳数量限制允许)的存在。芳基基团的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和衍生自联苯基的单价基团。当术语“芳二基(arenediyl)”不与修饰语“取代”一起使用时指二价芳族基团，两个芳香碳原子作为连接点，所述碳原子形成一个或更多个6元芳香性环结构的部分，其中环原子都为碳并且其中单价基团不由除了碳和氢外的原子组成。如本文使用的，该术语不排除一个或更多个连接到第一芳香环或任何存在之其他芳香环的烷基基团(碳数量限制允许)的存在。如果存在多于1个环，则所述环可以是稠合的或非稠合的。芳二基基团的非限制性实例包括：
当这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。“芳烃”指化合物H-R，其中R为芳基。
当术语“芳烷基”不与修饰语“取代”一起使用时指单价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上面提供之定义一致的方式使用。芳烷基的非限制性实例为：苯基甲基(苄基、Bn)和2-苯基-乙基。当该术语与修饰语“取代”一起使用时，来自烷二基和/或芳基的一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。取代的芳烷基的非限制性实例为：(3-氯苯基)-甲基和2-氯代-2-苯基-乙-1-基。
当术语“杂芳基”不与修饰语“取代”一起使用时指单价芳香性基团，芳香碳原子或氮原子作为连接点，所述碳原子或氮原子形成芳香性环结构的部分，其中至少1个环原子为氮、氧或硫并且其中所述基团不由除了碳、氢、芳香氮、芳香氧和芳香硫外的原子组成。如本文使用的，该术语不排除一个或更多个连接至芳香环或任何存在之其他芳香环的烷基基团(碳数量限制允许)的存在。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、甲基吡啶基、唑基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基和三嗪基。当术语“杂芳二基”不与修饰语“取代”一起使用时指二价芳香性基团，两个芳香碳原子、两个芳香氮原子或一个芳香碳原子和一个芳香氮原子作为两个连接点，所述原子形成一个或更多个芳香性环结构的部分，其中至少1个环原子为氮、氧或硫并且其中二价基团不由除了碳、氢、芳香氮、芳香氧和芳香硫外的原子组成。如本文使用的，该术语不排除一个或更多个连接至第一芳香环或存在之任何其他芳香环的烷基基团(碳数量限制允许)的存在。如果存在多于1个环，则所述环可以是稠合的或非稠合的。杂芳二基基团的非限制性实例包括：
当这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。
当术语“酰基”不与修饰语“取代”一起使用时指基团-C(O)R，其中R为氢、烷基、芳基、芳烷基或杂芳基，这些术语如上定义。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基，Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)为酰基基团的非限制性实例。“硫代酰基”以类似方式定义，除了基团-C(O)R的氧原子已经被硫原子代替(-C(S)R)。当这些术语任一与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨基甲酰基)和-CON(CH3)2为取代的酰基基团的非限制性实例。
当术语“烷氧基”不与修饰语“取代”一起使用时指基团-OR，其中R为烷基，该术语如上定义。烷氧基基团非限制性的实例包括：-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。当术语“烯基氧基”、“炔基氧基”、“芳基氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳基氧基”和“酰基氧基”不与修饰语“取代”一起使用时，指定义为-OR的基团，其中R分别为烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和酰基。类似地，当术语“烷基硫基”不与修饰语“取代”一起使用时指基团-SR，其中R为烷基，该术语如上定义。当任何这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。术语醇对应如上定义的烷，其中至少一个氢原子已经用羟基基团代替。
当术语“烷基氨基”不与修饰语“取代”一起使用时指基团-NHR，其中R为烷基，该术语如上定义。烷基氨基基团的非限制性实例包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。当术语“二烷基氨基”不与修饰语“取代”烷氨基使用时指基团-NRR′，其中R和R可以为相同或不同的烷基基团，或者R和R′可以合在一起表示烷二基。二烷基氨基基团的非限制性实例包括：-N(CH3)2、-N(CH3)(CH2CH3)和N-吡咯烷基。当术语“烷氧基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”和“烷基磺酰基氨基”不与修饰语“取代”一起使用时，指定义为-NHR的基团，其中R分别为烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和烷基磺酰基。芳基氨基基团的一个非限制性实例为-NHC6H5。当术语“酰胺基”(酰基氨基)不与修饰语“取代”一起使用时，指基团-NHR，其中R为酰基，该术语如上定义。酰胺基基团的一个非限制性实例为-NHC(O)CH3。当术语“烷基亚氨基”不与修饰语“取代”一起使用时，指二价基团＝NR，其中R为烷基，该术语如上定义。当任何这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3为取代的酰胺基基团的非限制性实例。
当术语“烷基磷酸酯”不与修饰语“取代”一起使用时指基团-OP(O)(OH)(OR)，其中R为烷基，该术语如上定义。烷基磷酸酯基团的非限制性实例包括：-OP(O)(OH)(OMe)和-OP(O)(OH)(OEt)。当术语“二烷基磷酸酯”不与修饰语“取代”一起使用时指基团-OP(O)(OR)(OR′)，其中R和R′可以为相同或不同的烷基基团，或者R和R′可以合在一起表示烷二基。二烷基磷酸酯基团的非限制性实例包括：-OP(O)(OMe)2、-OP(O)(OEt)(OMe)和-OP(O)(OEt)2。当任何这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。
当术语“烷基磺酰基”和“烷基亚磺酰基”不与修饰语“取代”一起使用时分别指基团-S(O)2R和-S(O)R，其中R为烷基，该术语如上定义。术语“烯基磺酰基”、“炔基磺酰基”、“芳基磺酰基”、“芳烷基磺酰基”和“杂芳基磺酰基”以类似的方式定义。当任何这些术语与修饰语“取代”一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3或者-S(O)2NH2代替。
如本文使用的，“手性助剂(chiral auxiliary)”指能够影响反应之立体选择性的可去除的手性基团。本领域技术人员熟悉这种化合物，且多数为商业可获得的。
“可药用盐”意指如上定义的本发明化合物的盐，其为可药用的并且其具有期望的药理学活性。这样的盐包括与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或者与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸例如1，2-乙烷二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4，4’-亚甲基二(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对-氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。可药用盐还包括碱加成盐，其可以在存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应时形成。可用的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可用的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷(tromethamine)、N-甲基葡糖胺等。应认识到形成本发明任何盐部分的特别的阴离子或阳离子不是严格的，只要该盐作为整体是可药用的。可药用盐的另一些实例及其制备方法和用途在Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(2002)中呈现。
在整个本发明书中公开的化合物、试剂和活性成分的修饰或衍生物预期可用于本发明的方法和化合物。可以制备衍生物并且这样的衍生物的性质可通过本领域技术人员已知的任何方法测定其期望的性质。
在某些方面，“衍生物”指化学修饰的化合物，其仍然保持着化合物在化学修饰前期望的作用。因此，“异唑衍生物”指仍然保持着母体(parent)异唑在其化学修饰前期望作用的化学修饰化合物。这样的作用可以相对于母体异唑增强(例如，稍更有效、两倍有效等)或减弱(例如，稍更无效、效果低两倍)，但是仍然可认为是异唑衍生物。这样的衍生物可以在母体分子上添加、移除或取代一个或更多个化学部分。可以对本文公开的化合物和结构进行的修饰类型的非限制性实例包括添加或移除低级未取代的烷基(例如甲基、乙基、丙基)或者取代的低级烷基(例如羟甲基或氨基甲基基团；羧基基团和羰基基团；羟基；硝基、氨基、酰胺和偶氮基团；硫酸盐/酯、磺酸盐/酯、磺酰(sulfono)、巯基(sulfhydryl)、磺酰基、亚磺酰基(sulfoxido)、磷酸盐/酯、膦酰基(phosphono)、磷酰基基团和卤化物取代基)。另一些修饰可以包括添加或删除一个或更多个该原子框架的原子，例如由丙基取代乙基；由更大或更小的芳香性基团取代苯基。或者，在环状或双环状结构中，杂原子(例如N、S或O)可以取代入所述结构中代替碳原子。
本发明化合物的前药和溶剂化物也在本文中考虑。本文使用的术语“前药”理解为在施用于对象(例如哺乳动物)后，通过代谢或化学过程经历化学转化以产生本文任何式之化合物或者其盐和/或溶剂化物的化合物(Bundgaard，1991；Bundgaard，1985)。本发明化合物的溶剂化物优选为水合物。
可用来制备可药用盐之无机酸的非限制性实例包括：盐酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等。可用来制备可药用盐之有机酸的实例包括：脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸，例如草酸、碳酸、柠檬酸、琥珀酸、苯基杂原子取代的链烷酸、脂肪族硫酸和芳香族硫酸等。因此，由无机或有机酸制备的可药用盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐等。
合适的可药用盐还可以通过使本发明的试剂与有机碱(例如甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等)反应形成。
可药用盐包括基于本发明一些化合物的羧酸或磺酸基团与无机阳离子(例如钠、钾、铵或钙)或者有机阳离子(例如异丙基铵、三甲基铵、四甲基铵和咪唑盐)之间形成的盐。
应认识到形成本发明任何盐部分之特别的阴离子或阳离子不是严格的，只要该盐作为整体是可药用的。可药用盐的另一些实例及其制备方法和用途在Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(2002)中呈现，其通过引用并入本文。
如本文使用的，术语“环状基团”指碳环基团(例如环丙基、环己基)、杂环基团(吡咯烷基)、芳基基团或其任意组合(例如稠合的双环基团)。
如本文使用的，“保护基团”指连接至功能基团以防止该功能基团之其他不期望反应的部分。保护基团对于本领域技术人员来说是公知的。非限制性示例保护基团落入例如羟基保护基团、氨基保护基团、巯基保护基团和羰基保护基团的种类中。这样的保护基团可以在Greene和Wuts(1999)中找到。特别地考虑本发明的化合物其中的一个或更多个功能基团通过保护基团而被保护。
本发明的化合物可包含一个或更多个不对称中心，因此可作为外消旋物和外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体混合物以及单个非对映异构体出现。在某些实施方案中，存在单一非对映异构体。本发明化合物所有可能的立体异构体预期在本发明的范围内。然而，在某些方面，预期特别的非对映异构体。本发明化合物的手性中心可具有如通过IUPAC 1974推荐(Recommendation)定义的S-或R-构型。在某些方面，本发明的某些化合物可在特定的碳中心包含S-或R-构型。例如，下面具体的化合物包含不对称中心，并因此要求保护外消旋混合物(+/-)、R(+)和S(-)形式：
用于本发明化合物之合成制备的溶剂选择对本领域技术人员来说是已知的。溶剂选择可依赖于例如哪些将促进所有试剂的溶解，或者例如哪些将最好地促进期望的反应(特别当反应的机理是已知的时候)。溶剂可包括例如极性溶剂和非极性溶剂。溶剂选择包括但不限于四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氧六环、甲醇、乙醇、己烷、二氯甲烷和乙腈。对于任何特定反应或纯化过程可以选择多于一种溶剂。还可以将水混合至任何溶剂选择。此外，水(例如蒸馏水)可替代溶剂构成反应介质。
本领域普通技术人员会熟悉本发明化合物的纯化方法。本领域普通技术人员将理解本发明的化合物一般可在任何步骤纯化，包括中间体的纯化以及最终产物的纯化。在一些特定实施方案中，纯化通过硅胶柱色谱法或HPIC进行。
鉴于上面的定义，本领域技术人员可以容易地理解在整个申请中使用的其他化学术语。术语可以单独或者以其任何组合来使用。基团之优选和更优选的链长适用于所有这样的组合。
C.糖尿病和胰岛素缺乏
糖尿病(Diabetes mellitus)经常简单地称作糖尿病(diebetes)，是一组代谢疾病，其中人具有高血糖，因为身体不产生足够的胰岛素或者因为细胞不响应于所产生的胰岛素。该高血糖产生多尿(尿频)、烦渴(口渴增加)和多食(饥饿增加)的典型症状。
存在三种主要的糖尿病类型：
●1型糖尿病：由身体不能产生胰岛素造成，并且目前需要人注射胰岛素。(也称为胰岛素依赖型糖尿病，简称为IDDM，和幼年型糖尿病。)
●2型糖尿病：由胰岛素耐受造成，为其中细胞不能适当地使用胰岛的病症，并且最后与绝对的胰岛素缺乏相结合。(以前称作非胰岛素依赖型糖尿病，简称为NIDDM，和成年型糖尿病)。
●妊娠糖尿病：为从前从来没有糖尿病的孕妇在妊娠期间具有高血葡萄糖水平。其可先于2型糖尿病的形成。
另一些形式的糖尿病包括先天性糖尿病(其是由于胰岛素分泌的遗传缺陷)、囊性纤维化相关的糖尿病、由高剂量糖皮质激素诱发的类固醇性糖尿病和多种形式的单基因糖尿病。
自从胰岛素在1921年变得可得，所有形式的糖尿病已经可以治疗，且可用药物控制2型糖尿病。1型和2型二者都是慢性病症，通常不能治愈。在1型糖尿病中已经尝试了胰腺移植，成功有限；胃旁路手术(gastricbypass surgery)已经在许多有病态肥胖症(morbid obesity)和2型糖尿病的人中成功。在分娩后，妊娠糖尿病通常得到解决。未合适治疗的糖尿病可引起许多并发症。急性并发症包括低血糖、糖尿病酮症酸中毒或非酮症高渗性昏迷(nonketotic hyperosmolar coma)。严重的长期并发症包括心血管疾病、慢性肾衰竭、视网膜损伤。因此糖尿病适当的治疗以及血压控制和生活方式因素(例如停止吸烟和保持健康的体重)是重要的。
糖尿病是巨大的健康负担，在2007年估计耗费了1740亿美元。仅在美国就多于2300万人，～8％的人群为糖尿病患者；另外32％的成人有前驱糖尿病的风险，受损的口服葡萄糖耐受或者异常的高空腹葡萄糖(NIDDK，ADA统计)。这合计达到具有异常葡萄糖代谢之美国成年人群的惊人的大比例。世界范围内，2亿3千万人受到糖尿病影响，并且预计该数字将在下个20年翻倍。目前，1型糖尿病仅占总共的～5％。由于肥胖症已经变得流行，2型糖尿病以令人担忧的速率增长。尽管有这些令人生畏的数字，统计还揭示了改善血糖控制的干预减少了负面健康结果。
糖尿病的大多数情况落入以下3种广泛的类别：1型、2型和妊娠糖尿病。描述了少数其他类型。没有限定的术语糖尿病(disbetes)，通常指糖尿病(diabetes mellitus)。罕见疾病尿崩症具有与糖尿病相似的症状，但是没有糖代谢的干扰。
术语“1型糖尿病”已经代替了一些之前的术语，包括儿童期发作糖尿病、幼年型糖尿病和胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetesmellitus，IDDM)。同样地，术语“2型糖尿病”已经代替了一些之前的术语，包括成年型糖尿病、肥胖症相关的糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)。这两种类型之外，没有意见一致的标准命名。多种来源已经定义“3型糖尿病”为妊娠糖尿病、胰岛素抵抗的1型糖尿病(或“双重糖尿病”)、已经发展到需要注射的胰岛素的2型糖尿病以及成人的潜在自免疫糖尿病(或者LADA或“1.5型”糖尿病)。
1型糖尿病的特征为胰腺中朗格汉斯(Langerhans)胰岛的产生胰岛素之β细胞的丧失导致胰岛素缺乏。这种类型的糖尿病还可分为免疫介导的或先天的。多数1型糖尿病为免疫介导性的，其中β细胞丧失是T细胞介导的自身免疫攻击。针对1型糖尿病没有已知的预防措施，其在北美和欧洲引起大约10％的糖尿病病例。当发作时，多数受影响的人不健康且无健康的重量。对胰岛素的敏感性和响应性通常是正常的，尤其是在早期。1型糖尿病可影响儿童或成人，但是传统上称为“幼年型糖尿病”，因为其表现为主要的糖尿病病例在儿童中。
2型糖尿病的特征为胰岛素抵抗力，其可以与相对减少的胰岛素分泌组合。身体组织对胰岛素的缺陷响应具有以肥胖症为主要因素的许多可能的原因。与单个基因突变相关联的糖尿病发生被认为是年轻的成年发病型糖尿病或MODY且被分别分类。2型糖尿病为最普遍的类型。
在2型糖尿病早期，突出的异常为降低的胰岛素敏感性。在此阶段，可以通过提高胰岛素敏感性或减少由肝的葡萄糖产生的多种措施和药物来使高血糖症逆转。
妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)在一些方面类似2型糖尿病，包括相对不足胰岛素分泌和响应性的组合。其在所有妊娠的约2％-5％中发生，并且在分娩后可以改善或消失。妊娠糖尿病可以完全治疗，但是在整个妊娠期间需要仔细的医疗监督。约20％-50％受影响的妇女在稍后的生活中发生2型糖尿病。
即使是短暂的，未治疗的妊娠糖尿病可以损害胎儿或母亲的健康。对于婴儿的风险包括巨大症(macrosomia)(高出生重量)、先天心脏和中枢神经系统异常，以及骨骼肌畸形。增加的胎儿胰岛素可以抑制胎儿表面活性物质的产生并引起呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)。可由红细胞的破坏产生高胆红素血症。在严重的情况下，可能发生围产期死亡，最普遍的为血管损害引起之胎盘灌注不良(poor placentalperfusion)的结果。引产可能表示胎盘功能的下降。如果存在明显的胎儿窘迫(fetal distress)或与巨大症相关之损伤风险的增加(例如肩难产)，可以进行剖腹产术。
糖尿病的一些病例由身体组织受体不响应胰岛素(即使当胰岛素水平正常时，这是与2型糖尿病分开的)引起；这种形式非常不常见。遗传突变(常染色体或线粒体)可以导致β细胞功能的缺陷。在一些情况中，还可以遗传地测定异常胰岛素的作用。引起对胰腺大范围损伤的任何疾病可导致糖尿病(例如，慢性胰腺炎和囊性纤维化)。与胰岛素拮抗激素过度分泌相关的疾病可引起糖尿病(一旦除去过度的激素，其通常被解决)。许多药削弱了胰岛素的分泌并且一些毒素损伤了胰腺β细胞。当在1999年引入现在的分类法时，世界卫生组织废弃了ICD-10(1992)诊断实体、营养不良相关的糖尿病(MRDM或MMDM，ICD-10代码E12)。
D.药物组合物和治疗方法
1.组合物
预想对于向主体(host)施用，本发明的化合物和细胞将悬浮在适合于施用于主体的制剂中。本发明的水性组合物包含在可药用制剂和/或水性介质中分散的有效量的化合物和/或细胞。短语“可药用和/或药理可接受的”指当适当施用于动物(特别是人)时，不产生相反的、过敏的和/或其他不良反应的组合物。
如本文使用的，“可药用载剂”包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等张剂和/或吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这些介质或试剂的用途是本领域公知的。除非任何传统的介质或试剂与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的用途是预期的。还可将补充活性成分合并入所述组合物。为了施用于人，制剂应当满足如FDA生物制品标准办公室(FDA Office of Biologics standards)要求的无菌、致热性、一般安全和/或纯度标准。
2.施用
用于施用的化合物和/或细胞一般将配制用于胃肠外施用，例如，配制用于通过静脉内、肌内、皮下、病灶内或者甚至腹膜内途径注射。按照本公开内容，包含细胞作为活组分或成分之水性组合物的制剂会对本领域技术人员来说是已知的。在所有情况下，所述形式应当是无菌的并且必须为以容易的可注射性(syringability)存在且维持细胞生存力之程度的流体。一般预期在施用前将多数培养基从细胞除去。
特别考虑胰岛移植为本发明的部分。一旦移植，胰岛就开始产生胰岛素，积极地调节血液中的葡萄糖水平。胰岛通常输注至患者的肝。如果细胞不来自遗传相同的捐献者，则患者的身体将识别它们为外来物，并且免疫系统将开始攻击它们，如同任何移植排斥。为了避免这种情况，使用免疫抑制药。最近的研究已经显示胰岛移植已经发展到这样的程度：在一项研究中，58％的患者在手术后一年不依赖胰岛素。
胰岛移植的目标是输注足够的胰岛以控制血葡萄糖水平，消除胰岛素注射的需求。对于平均身材的人(70kg)，典型的移植需要从两个捐献者胰腺分离约一百万胰岛(islet)。因为血葡萄糖的良好控制可以减缓或预防与糖尿病相关之并发症(例如神经或眼损伤)的进展，所以成功的移植可以降低这些并发症的风险。但是移植的接受者将需要采用停止免疫系统排斥移植之胰岛的免疫抑制药。
研究者使用称为胶原酶的高度纯化酶之混合物来从已故捐献者的胰腺中分离胰岛。将胶原酶溶液注射入贯穿胰腺头、体和尾的胰管。以这种方式递送，所述酶溶液引起胰腺的膨胀，接着将其切成小块并转移至所谓的Ricordi室(Ricordi's chamber)，在那里发生消化直至胰岛从溶液中释出和移出。然后，将分离的胰岛从外分泌组织和碎片在称为纯化的过程中分离。
在移植期间，放射学家使用超声和射线照相术来引导导管通过上腹部并进入肝之门静脉的放置。然后通过导管将胰岛输注入肝。患者将接受局部麻醉。如果患者不能忍受局部麻醉，则外科医生可使用全身麻醉并通过小切口进行移植。所述过程的可能风险包括出血或血液凝块。
胰岛连接至新的血管并开始释放胰岛素需要时间。在移植后，医生将进行许多测试来检查血葡萄糖水平，并且可能需要胰岛素直至达到控制。
特别地，考虑埃德蒙顿方案(Edmonton Protocol)或其变体。埃德蒙顿方案是用于治疗1型糖尿病的胰岛植入的方法。该方案涉及使用称为(Roche)酶的混合物从尸体捐献者的胰腺分离胰岛。每个接受者接受来自1个至多达3个捐献者的胰岛。胰岛输注入患者的门静脉，随后使用两种免疫抑制剂(西罗莫司和他可莫司)以及单克隆抗体达利珠(daclizumab)以预防被接受者免疫系统攻击。西罗莫司和他可莫司，这两种阻止免疫系统破坏移植之胰岛的主要药物必须终身使用。
两个最重要的限制为目前用来预防胰岛排斥不适当手段以及对于移植来说有限的胰岛供应。目前的免疫抑制方案能够预防胰岛衰竭数月至数年，但是在这些治疗中使用的药剂是昂贵的，并且可能增加特定恶性和机会性感染的风险。此外，有点讽刺的是，最通常使用的药剂(如钙调磷酸酶抑制剂和雷帕霉素)也已知削弱正常胰岛功能和/或胰岛素作用。此外，如同所有药物，所述药剂具有其他相关的毒性，副作用例如口溃疡、外周性水肿、贫血、重量减轻、高血压、高脂血症、腹泻和疲劳。可能对于患者和医师最关心的是某些广泛使用的免疫抑制剂对肾功能的有害作用。对于患有糖尿病的患者，肾功能在决定长期结局中是至关重要的因素，钙调磷酸酶抑制剂(他可莫司和环孢素)是显著肾毒性的。因此，虽然一些具有胰腺移植的患者很好地耐受免疫抑制剂，并且对于这样的患者糖尿病肾病可以逐渐改善，但是在另一些患者中的净作用(由于改善的血葡萄糖控制降低的风险，来自免疫抑制剂的提高的风险)可恶化肾功能。确实，Ojo等人已发表了分析，表明在接受非肾同种异体移植物的患者中，7％-21％由于移植和/或随后的免疫抑制以肾衰竭告终。
如同所有的移植治疗，胰岛移植也被有限的捐献者储库所阻碍。数字是惊人的；至少一百万美国人患有1型糖尿病，每年仅仅可得几千个捐献者胰腺。为了避免这个器官短缺问题，研究者持续寻找体外“生长”胰岛(或者至少细胞能够生理上调节胰岛素分泌)的方式，但是目前仅来自尸体捐献者的胰岛可以用于恢复血糖正常。进一步加剧该问题(并且与肾、肝和心脏移植不同，其中对于每个接受者仅需要一个捐献者)，多数胰岛移植患者需要来自两个或更多个捐献者以达到血糖正常。最后，目前的胰岛分离方法需要改善，因为仅有约一半尝试的分离产生移植就绪的胰岛。因此，本发明提供了用于治疗和刺激β细胞的改进方法，包括已减少胰岛素产品或已完全失去能力的那些。本发明的组合物在这些细胞中增加胰岛素产生/使胰岛素产生再活化，并且还可诱导β细胞增殖。治疗可在从尸体或治疗的患者中取回的情况下离体发生，或者在移植的情况下体内发生。
通常，通过将化合物或细胞合并入含有碱性分散介质的无菌载剂制备分散体，并需要另一些成分用于维持细胞生存力以及潜在的其他组分来实现体内增殖、分化或替代/移植。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式或以治疗有效的这种量施用。根据治疗对象的状况，一些剂量的变化将必须发生。负责施用的人将在任何情况下确定个体对象的合适剂量。
3.辅助治疗和过程
根据本发明，其可证明将本文公开的方法与辅助治疗或过程组合以增强全部抗糖尿病作用的优点。下文大体上阐明这种治疗和过程。熟练的医师将了解可以采用这些治疗和过程的最适当方式。
虽然设计来消除其他治疗的需要，但是本发明考虑提供具有传统胰岛素补充的有利用途，但是在更低的水平上，例如胰岛素正常日剂量的90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下、10-15％、10％以下、5-10％、5％以下、4％、3％、2％或1％。TD1的正常日剂量为每天30-60单位。这样的治疗应考虑个体患者目前的临床情况而对其具体地调整，并且在开始异唑提供后考虑对象可以“减少(wean down)”或“解除”(wean off)胰岛素治疗。以下是通过注射使用胰岛素补充的典型“单一治疗”的一般指南，并且可以在本文应用，即使在上述总日剂量降低的情形下。
胰岛素可以在大腿、腹部、上臂或臀区域注射。在儿童中，优选大腿或腹部。这些提供了用于频繁部位轮换的大范围并且易于自己注射。在腹部注射的胰岛素迅速吸收，而从大腿注射的吸收较慢。因此，患者不应随意地从一个区域转换到其他区域。腹部应当用于当期望注射和进餐之间间隔短时的白天时间(通常当儿童可能着急去学校时在早餐前)，且大腿用于当患者可以在注射后等待30分钟进餐时(通常在晚餐前)。在选择的区域内，全身的部位轮换必须实行以使一个月施加在任何单一点的注射不多于一次或两次。如果不实行部位轮换，则称为脂肪增生的脂肪肿块可能在经常注射的部位形成。这些肿块是在美观上(cosmetically)不可接受的，并且更重要的是，从这些区域的胰岛素吸收是高度不稳定的。
在注射胰岛素前，选择的部位应当用酒精清洁。在酒精蒸发前注射可证实是非常疼的。像拿笔一样在一只手中拿着注射器，在另一只手的拇指和食指间捏起皮肤，并以相对表面45-90°的角度通过皮肤插入针头。向下推活塞以将胰岛素注射入皮下空间(皮肤和肌肉间的空间)，然后在放开捏起的皮肤后抽出针头前等待几秒。不应按摩注射部位。
对于糖尿病的日常管理，使用短效和中效胰岛素的组合。一些儿童在糖尿病发作后第一年每天单次注射胰岛素可保持很好的控制。然而，为了良好的控制，大多数糖尿病儿童会需要2、3或甚至4次胰岛素注射。医生应当决定哪种方案最合适。
一次注射方案：包含短效和中效胰岛素以1∶3或1∶4比例混合(在同一注射器中混合)的单次注射在早餐前20至30分钟进行。通常的总开始剂量为每天0.5至1.0单位/kg体重。这个方案具有3个缺点：(1)所有的膳食在固定的时间消耗；(2)因为全部量的胰岛素一次给予，所以在晚间时间的晚期和早期可看到胰岛素作用的单个大峰，使得患者在此时倾向于低血糖；(3)由于中效胰岛素的作用很少持续超过16-18小时，因此病人的身体在清晨保持在缺乏胰岛素的情况下，在此期间身体中胰岛素的需求实际上是最高的。
两次注射方案：这个方案非常普遍。两次注射胰岛素，一次在早餐前(总剂量的2/3)且一次在晚餐前(总剂量的1/3)。每次都为短效和中效胰岛素的组合，早晨剂量为1∶2或1∶3的比率，晚上剂量为1∶2或1∶1的比率。用这个方案部分矫正了单次注射方案的缺点。对于晚餐可能有一些灵活性。此外，由于分开了整日的胰岛素，胰岛素作用的单个大峰不出现，因此低血糖的风险降低并且患者在整日中保持或多或少均匀的胰岛素治疗(insulinize)。对于这个方案，如果早餐前血葡萄糖高，而在上午3点的水平低，则晚上的剂量可能需要分开使得在晚餐前提供短效胰岛素并在就寝时间提供中效胰岛素。
多剂量胰岛素方案：身体通常以基础-餐时(basal-bolus)的方式产生胰岛素，即存在与膳食摄取无关的持续基础分泌且在此上存在响应每餐的餐时胰岛素释放。作出多剂量胰岛素方案以模拟该胰岛素产生的生理模式。短效胰岛素在每次正餐(早餐、午餐和晚餐)之前进行以提供“餐时胰岛素”并且中效胰岛素一天使用1次或2次作为“基础胰岛素”。通常餐时胰岛素包含60％的总剂量，基础胰岛素补足剩下的40％。在这个方案中你有许多灵活性。时间以及每餐的量都可以根据需要通过进行餐时胰岛素剂量适当的改变而改变。为了最大化地利用这个方案，应学会“碳水化合物计算(carbohydrate counting)”并计算出碳水化合物：胰岛素比率(身体需要1单位胰岛素所对应的碳水化合物克数)。
4.监测葡萄糖水平
任何患有糖尿病的人会非常熟悉有规律地测量血葡萄糖水平的需要。血葡萄糖水平为葡萄糖或糖在血液中的量。其也称为“血清葡萄糖水平”。通常，在整天中血葡萄糖水平停留在非常窄的界限内(4至8mmol/l)，但是经常在餐后更高且通常在早晨最低。不幸的是，当人具有糖尿病时，他们的血葡萄糖水平有时超出这些界限。因此，糖尿病的挑战大多是当患上糖尿病时，使葡萄糖水平尽可能地接近正常是重要的。稳定的血葡萄糖显著地降低了形成晚期糖尿病并发症的风险，其在诊断有1型糖尿病后10至15年开始出现，并且经常在诊断有2型糖尿病后少于10年开始出现。
血葡萄糖水平可以非常简单和快速地用家庭血葡萄糖水平检验试剂盒测量，所述试剂盒由自身的测量装置和测试条组成。为了检查血葡萄糖水平，将少量的血液放在测试条上，然后将其放入装置中。约30秒后，该装置显示血葡萄糖水平。采血液样品的最佳方式是通过用刺血针(lancet)刺手指。理想值为(a)餐前4至7mmol/l，(b)餐后1个半小时小于10mmol/l；以及(c)在就寝时间大约8mmol/l。
患有1型糖尿病的人应当一天测量一次其血葡萄糖水平，在早晨早餐前或在就寝时。此外，应一周数次地完成24小时谱(profile)(在每餐前和就寝前测量血葡萄糖水平)。患有2型糖尿病并正在用胰岛素治疗的人也应当遵循上述时间表。患有2型糖尿病并正在用片剂或特殊饮食治疗的人应当一周测量一次或两次其血葡萄糖水平，在餐前或餐后1个半小时。他们还应当一个月一次或两次地进行24小时谱。
在早晨测量胰岛素治疗之糖尿病患者的血葡萄糖水平的主要优点在于如果血葡萄糖水平高或低，则可以进行胰岛素量的调整，因此降低形成晚期糖尿病并发症的风险。类似地，在就寝时间的血葡萄糖水平应当在7至10mmol/l。如果在就寝时间血葡萄糖非常低或非常高，则可能需要调整食物摄取或胰岛素剂量。任何患者感觉不好或者患者认为血葡萄糖太高或太低的时候也应当测量血葡萄糖。患有1型糖尿病在其血液中有高水平葡萄糖(大于20mmol/1)的人，除了尿中的糖迹(sugar trace)，还应当使用尿带(urine strip)检查其尿中的酮体。如果酮体存在，则这就是他们具有或可能形成糖尿病酸中毒的警报信号。
E.实施例
以下实施例被包括以证明本发明某些优选的实施方案。本领域技术人员应理解实施例中公开的技术遵循本发明者发现的代表性技术以在本发明的实践中很好地运行，并且因此可认为构成对其实践优选的模式。然而，按照本公开内容，本领域技术人员应理解在具体公开的实施方案中可以进行许多变化，且在不偏离本发明的精神和范围下仍然获得相似或类似的结果。
实施例1-材料和方法
材料。针对ERK1/2和pERK1/2的抗体如所述(Lawrence等，2008)。BETA2(N-19)、cMaf(M-153)、PDX-1(N-18)和D300(C-20)抗体来自Santa Cruz Biotechnology。识别染色质修饰的抗体pan-AcH4K5K8K12K16(06-866)、AcH3K9(07-352)、AcH3K14(07-353)、AcH3K9K14(07-353)来自Upstate/Millipore。抑制剂从以下来源获得：U0126和FK506-LC实验室；PD0325901-Stemgent；硝苯吡啶和BAPTA-Calbiochem；渥曼青霉素和曲古菌素A-Sigma。小分子3，5二取代的Isx在之前描述并在图5A中示出(Sadek等，2008；Schneider等，2008)。
细胞培养和处理。MIN6细胞于37℃、10％CO2下在含有25mM葡萄糖、10％胎牛血清、10mM Hepes pH7.4、10.2mM L-谷氨酰胺、50mM丙酮酸钠、2.5mMβ-巯基乙醇、100U/mi青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(Gibco)中培养。人胰岛从ICR基础科学胰岛分配(ICR BasicScience Islet Distribution)以及阿拉巴马大学伯明翰胰岛资源设施(University of Alabama，Birmingham Islet Resource Facility)获得，并在具有11mM葡萄糖的RPMI1640中培养至1年。培养基每周更换两次，且当胰岛到达90％汇合时，将其继代培养。对于Isx处理，细胞在含有Isx或等体积DMSO载剂(0.04％)的培养基中孵育。为了测量GSIS，将细胞置于含有0.1％牛血清白蛋白和2mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐/Hepes中2小时，并用20mM葡萄糖、1x氨基酸混合物(浓度如在DMEM中)或50nM毒蜥外泌肽-4刺激15分钟。如所示添加U0126(10μM)、硝苯吡啶(3μM)、BAPTA(10μM)、渥曼青霉素(0.5μM)或FK506(0.1μM)1-24小时。
DNA构建体。大鼠胰岛素1启动子-荧光素酶报道子构建体(pGL3-rIns-410，+1)在之前描述(Lawrence等，2005)。编码MafA：myc、PDX-1：myc和BETA2：myc的表达载体来自Michael German(UCSF)。p300为来自Joseph Garcia(Southwestern)的赠品。通过Quik-Change突变形成(Agilent Technologies)产生Mafa：myc点突变体。
ChIP和Q-PCR分析。ChIP如描述(Lawrence等，2008)并具有以下改变。染色质与1％甲醛交联并用Bioruptor200(Diagenode)在冰水浴中超声处理。固定在蛋白A-琼脂糖珠上的抗体用于免疫沉淀。如之前对实时PCR分析的描述(Lawrence等，2008)通过实时Q-PCR分析ChIP产物，使用以下引物(5’-CAGACCTAGCACCAGGG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GGACTTTGCTGTTTGTCCC-3’(SEQ ID NO：2))以扩增涵盖C1(MafA)、E1(BETA2)和A1(PDX-1)结合位点的小鼠胰岛素启动子的-157/-50片段。结果相对于输入表示并以三次重复的至少两次独立实验的平均值+/-SEM呈现。
HAT和HDAC测定。在50μg核内蛋白中使用来自BiovisionBiotechnology的HAT和HDAC活性比色测定试剂盒根据生产厂商的建议测量组蛋白乙酰转移酶和脱乙酰酶的活性。
基因表达分析。用TRI试剂根据生产厂商的方案(Ambion)从人胰岛制备物中提取总RNA。通过随机六聚体和寡-dT引物反转录混合物(iScript Biorad)从总RNA制备cDNA。通过TaqMan测定(AppliedBiosystems)评价胰岛素和胰高血糖素相对于18S RNA的表达。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Bio systems)确定胰腺因子的相对表达。qRT-PCR的引物序列在S表1(STable1)中。在以下的标准荧光化学和生产厂家说明的热循环条件下使用ABI7500DNA序列检测系统进行基于SYBR Green和TaqMan探针的PCR：50℃2分钟，95℃10分钟进行一个循环，并且另外40循环在95℃进行15秒，然后58℃进行1分钟。
荧光素酶报道子基因测定。HEK293细胞(0.15×106细胞)重复三次地用pGL3-rIns报道子构建体(0.1μg/孔)(Stratagene)转染，并使用Lipofectamine2000(Invitrogen)与0.5μg/孔的空载体(pcDNA3.1)或编码BETA2：myc、MafA：myc或PDX-1：myc的载体共转染。24小时后，用20μM Isx或DMSO再刺激细胞24小时。使用双荧光素酶报道子系统(Promega)并用海肾荧光素酶作为内部对照测量荧光素酶活性。
统计。使用不对称双侧t检验分析两组实验的统计显著性。误差条表示标准偏差(s.d.)，除非另有说明。认为p＜0.05的值为统计显著的。
实施例2-结果
在人胰岛中Isx提高了葡萄糖诱导的胰岛素分泌并增强了对胰岛素基因转录重要之因子的表达。本发明者检测了Isx对维持培养长达1年的人胰岛中β细胞功能的作用。基于下述的培养细胞中的浓度作用和在另一些细胞类型中的早期研究(Sadek等，2008；Schneider等，2008)，多数研究使用20或40μM Isx。除了β细胞，胰岛还包含两种另外的主要细胞类型，分泌胰高血糖素和生长激素抑制素(somatostatin)的α和δ细胞，以及分泌胰多肽的γ或pp细胞(Steiner等，2010)。这些细胞类型表达介导其独特营养物调节之激素分泌的共享的和细胞特异性的转录因子二者，并且它们之间的相互作用对于胰岛功能是重要的。在培养数月后，胰岛表现出β细胞限制之转录因子表达的减少，并且变得更少能够响应葡萄糖激发而分泌胰岛素(Buitrago等，1975；Hollande等，1976)。
已经培养6个月的人胰岛用Isx处理1-2天，诱导了前胰岛素原mRNA的大量增加，而在相同的环境下胰高血糖素mRNA几乎减少了80％(图1A)。从这些胰岛经24小时时期分泌的胰岛素也明显地增加(图1B)。为测定由化合物引起的这些变化的相对显著性，我们比较了Isx对培养了3个月的人胰岛的作用以及对新获得的人胰岛的作用。3个月大之胰岛中的胰岛素含量通过Isx增加了～10倍，达到仅1周前分离之胰岛的胰岛素含量值的近75％(图1C)。此外，暴露于Isx两天使新鲜胰岛的胰岛素含量增加了接近25％。在Ngn3、BETA2和胰岛素免疫染色中揭示了培养2个月并用Isx处理2天的胰岛的明显增加(图1E)。
本发明者检测了Isx作用于维持培养1年之胰岛中一系列mRNA的时间进程。前胰岛素原mRNA在24小时增加了10倍并在Isx暴露数天后增加了50倍或更多(图1D)。因为Isx还提高了葡萄糖响应性，所以本发明者评估了其对葡糖激酶和Glut2(对β细胞葡萄糖敏感特征必要的蛋白质)表达的影响，并发现二者都明显地增加，在暴露4天后达到峰值。连同BETA2，本发明者检测了与胰岛素基因转录以及β细胞分化和分化功能相关之转录因子的表达。检测的那些大多数暂时表现两种表达方式之一。一些在整个时间进程中增加或增加直至达到平台；除了胰岛素自身，这些还包括BETA2、MafA、PDX-1、Pax6、Nkx6.1、Nkx2.2、Foxa2、Hnf6、Hnf1α、Hnf1β、Hnf4α和Isl1(Wilson等，2003；Lyttle等，2008；Oliver-Krasinski和Stoffers，2008；Scearce等，2002；White等，2008)(图1D和图5B)。迅速增加然后更长时间暴露下减少的另一些包括Ngn3和Pax4。PDX-1、Hnfs和Isl1的增加相对小，而其他因子的增加通常大于10倍。PCNA(增殖的指示剂)和Oct4(与干细胞相关的因子)都未显示在mRNA表达中一致或大幅变化。
Isx增加了来自MIN6β细胞的BETA2表达以及胰岛素分泌。为了检测在分离的MIN6β细胞中由Isx诱导的变化，本发明者首先显示了在这个培养的β细胞系中Isx增强BETA2和其他因子的表达。在暴露24小时后，在检测的Isx的所有浓度下免疫活性的BETA2增加(图2A)。MafA表达也大幅增加，而检测到极少的PDX-1变化(如果存在)。然后本发明者检测了ERK1/2的活性，其对于葡萄糖刺激的胰岛素基因转录是必要的。在24小时暴露后，可检测到Isx增强的ERK1/2磷酸化。用20μM Isx处理的时间进程表明对ERK1/2两阶段的影响，在最初的几分钟内有小初始活化，随后在Isx暴露大约2小时开始更缓慢、更明显和持续的活化(图6)。组蛋白H3和H4的乙酰化作用(基因诱导的指标)也通过Isx在β细胞中增加，如之前在用这种化合物处理的其他细胞类型中所发现的(Sadek等，2008)。所有这些变化伴随前胰岛素原mRNA多达4倍的增加(图2B)。
为了检测胰岛素分泌，在用Isx处理前，MIN6β细胞在完全培养基中与4.5mM葡萄糖孵育24小时。葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)通过Isx预处理增加了近4倍(图2C)，尽管胰岛素含量相对少的增加(图2D)。通过使用MEK抑制剂抑制ERK1/2活化部分阻断了GSIS的增加。后续实验显示Isx将通过葡萄糖、氨基酸和毒蜥外泌肽-4(长效胰高血糖素样肽1激动剂)各自或组合刺激的胰岛素分泌提高2至5倍(图2E)。还探究了另一些抑制剂对Isx增强的GSIS的作用。同样抑制ERK1/2的钙调磷酸酶抑制剂FK506(Lawrence等，2005)、PI3-激酶抑制剂渥曼青霉素和硝苯吡啶(L-型电压依赖钙通道抑制剂)与螯合剂BAPTA一起都降低由Isx引起的GSIS增加(图5E)。
表观遗传机理对Isx作用的贡献。为探究由Isx引起的功能变化，我们使用MIN6和293细胞中的过表达和重构测定来测定诱导的因子活性是否还被该化合物影响。在Isx存在下，通过BETA2或MafA将胰岛素基因报道子活性提高了4倍或更多(图3A，图7)。相反地，PDX-1的活性通过Isx提高了两倍或更少。由Isx造成BETA2和MafA与胰岛素基因启动子的相当或更大的染色质的结合；通过阻断ERK1/2的活化抑制Isx诱导的结合(图3D-E)，如之前这些因子的葡萄糖刺激结合所示(Lawrence等，2005)。Isx还比HDAC抑制剂丁酸钠引起更强的BETA2乙酰化作用(图3C)。虽然BETA2是ERK1/2底物(Khoo等，2003)，但我们没能示出MafA是ERK1/2底物。已经报道了MafA在丝氨酸-脯氨酸位点通过其他酶调节磷酸化(Benkhelifa等，2001；Hah等，2007)。与对丝氨酸修饰的作用一致，丝氨酸65和较低程度丝氨酸14的突变限制了Isx增强MafA转录活性的能力(图3B)。
Isx通过增强HAT活性调节组蛋白乙酰化作用。之前我们示出Isx降低了HDAC5的磷酸化并增强了其核输出，可能导致Nkx2.5转录的变化(Schneider等，2008)。本文中我们发现除了对BETA2乙酰化的作用，Isx还对组蛋白的乙酰化有明显的作用(图4A)。钙通道阻断剂硝苯吡啶与螯合剂BAPTA组合减少了由Isx诱导的H3在赖氨酸9和14的乙酰化，但是对H4的乙酰化有很小的作用。MEK/ERK途径抑制剂U0126和PD325901抑制了Isx诱导的H4乙酰化，与钙调磷酸酶抑制剂FK506相同，但是对H3乙酰化有很小的作用。相反地，PI-3激酶抑制剂渥曼青霉素对这些结果(readout)都没有影响。
为测定在β细胞中增加之组蛋白乙酰化的基础，在用载剂或Isx处理24小时的MIN6或HeLa细胞的核提取物中测量HDAC和HAT的活性(图4B-C)。该化合物没有影响MIN6细胞中的HDAC活性，尽管其被HDAC抑制剂曲古菌素A抑制(Bieliauskas和Pflum，2008)。在MIN6和HeLa核提取物中的活性单位类似。另一方面，在Isx处理之MIN6细胞的核提取物中的HAT活性通过Isx提高了～2倍。在Isx处理的细胞中的HAT活性部分依赖于ERK1/2，如由MEK抑制剂敏感性所示(图4D)。Isx对在293细胞中表达的HAT的作用表明p300和CBP(而非PCAF或GCN5)活性通过ERK2表达和Isx的组合提高，但是被激酶失活ERK2(K52R)的表达阻断(图8)。为验证通过Isx对p300的明显调节，在MIN6细胞中表达p300。Isx将核提取物中的HAT活性提高至表达之p300的HAT活性之上；U0126抑制了Isx诱导的HAT活性的提高。Isx预处理以ERK1/2依赖方式提高了葡萄糖刺激后p300至胰岛素启动子的染色质募集(图4E)。这些发现与以下结论一致：Isx刺激p300活性以及Isx诱导的组蛋白和转录因子乙酰化变化至少部分由p300的调节引起。
使用MIN6(β细胞系)中大鼠胰岛素报道子活性的报道子测定。另一些异唑化合物在图9中示出(Isx-9I与上面讨论的Isx相同)。在第一个实验中，将Isx-9处理(10μM)与HA-104-94(10μM和2μM)相比较。即使在2μM下，HA-104-94分子也具有与10μM Isx-9相当的活性(图10)。接下来，本发明者发现低至0.625μM浓度的HA-104-94可以两倍活化胰岛素基因报道子(图11)。
MIN6细胞中内源胰岛素的表达。Isx-9最佳地在20μM浓度下活化内源胰岛素基因的表达。与相关的2μM和20μM小分子比较，2μMIsx-OH(HA-104-94)具有更大的能力来开启胰岛素基因，类似于20μM的Isx-9(图12)。
新的异唑化合物的鉴定。基于结构活性关系(structure activityrelationship，SAR)筛选，本发明者表征了一些异唑相关化合物的性质(图19)。选择两种(LSH-18和LSH-97)进行更详细地分析，因为它们比本发明的母体异唑分子LSH1在亚微摩尔浓度下增强β细胞功能和胰岛素分泌方面表现得更好。如图13所示，LSH-97在62.5nM下仍然有效。
2-Isx化合物增强响应于葡萄糖和受体活化之促分泌素的胰岛素分泌。重要的是认识到本文讨论的异唑衍生物不是胰岛素促分泌素，因为它们在处理后不诱导胰岛素分泌。反而是，Isx分子增强了胰腺β细胞功能。预处理的β细胞显示响应于葡萄糖、氨基酸(AA)或GLP1-受体激动剂毒蜥外泌肽-4(Ex-4)刺激的显著更高的胰岛素分泌(图14)。
用1μM LSH-097预处理增强β细胞功能。Isx分子具有诱导活化基因表达之表观遗传变化(组蛋白乙酰化作用)的能力。Isx分子可能改善β细胞的终末分化，因此增强其功能。例如，图15A示出在有或无1μMLSH-97预处理48小时的情况下，在氨基酸(AA)、毒蜥外泌肽-4(Ex-4)、葡萄糖或GPR40(脂肪酸受体1)激动剂GW9508刺激后的信号。图15B示出在用1μM Isx LSH-97预处理48小时的MIN6细胞中的胰岛素分泌。
Isx衍生物LSH-097(和LSH-18，数据未示出)改善了β细胞功能，并可用于加强葡萄糖依赖的胰岛素分泌，尽管其不单独诱导大幅分泌。在葡萄糖、氨基酸和GLP1(以及可能另一些)的刺激浓度存在下，LSH-097选择性地增强胰岛素分泌，但是通过GPR40的配体并不如此。
钙内流作为测量β细胞功能的方法。细胞内钙的上升触发了β细胞中调节的胰岛素分泌。在MIN6细胞中，胰岛素分泌的改善伴随着促分泌素诱导的细胞内钙内流的显著刺激(图16A-B)。
异唑保护胰腺β细胞免于自由脂肪酸(free fatty acid，FFA)诱导的功能障碍。LSH-018和LSH-097显著改善了响应于多种促分泌素(除了GW9508)的胰岛素分泌。事实上，LSH-018(图17A-B)和LSH-097(数据未示出)显著减少了由自由脂肪酸受体GPR40激动剂诱导的MAP激酶ERK1/2信号传导，而没有对其在胰岛素分泌上的扩增效应有任何作用。
GPR40和GPR120对于脂肪酸(FFA)诱导的ER胁迫和作为II型糖尿病中β细胞丧失之主要原因的糖-脂毒性(gluco-lipotoxicity)来说是必要的。FFA可短期加强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，然而长期暴露于FFA具有有害影响并削弱β细胞功能，联想到(reminiscent)II型糖尿病的进展。因此，本发明者假设异唑小分子可以预防脂毒性损伤(lipotoxicinsult)期间的β细胞功能丧失和凋亡。
在培养的人胰岛中Isx的作用。当培养足够久时，人胰岛失去了胰岛因子的表达，其将与葡萄糖诱导之胰岛素分泌的丧失相关。为了测定新Isx化合物是否可以比母体LSH-1表现得更好，用多种LSH化合物处理已培养2个月的人胰岛7天，结果可在培养的人胰岛中重复。一些Isx分子显著提高了胰岛素合成，如通过提高的转录水平(图18A)和蛋白质水平(图18B)所测量的。
实施例3-讨论
Isx增加了增强β细胞分化和控制营养物响应胰岛素基因转录之转录因子(包括MafA和BETA2)的表达，导致前胰岛素原mRNA和细胞内胰岛素含量的增加。在细胞内胰岛素含量增加前，Isx加强了由营养物和激素促分泌素诱导的胰岛素分泌，表明其还调节分泌机构(secretorymachinery)的效率。最终结果是对于成熟β细胞功能、胰岛素生物合成和响应于分泌激发之释放必不可少的特性大幅增加。
为在长时间培养的胰岛(culture-aged islet)中建立这些变化，Isx诱导了介导β细胞分化的若干因子。这些转录因子经常在β细胞发育中具有重叠的功能并且一些也在成熟β细胞中具有重叠的功能(Oliver-Krasinski和Stoffers，2008)。Ngn3在胰腺前体中诱导BETA2表达并通过诱导细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂来抑制细胞分裂(Miyatsuka等，2011)。Ngn3在α和β细胞区分之前于胰岛分化早期出现，并且与一些其他因子相反，Ngn3在成体胰腺中变得不可检测(Huang等，2000；Schwitzgebel等，2000)。虽然功能上不冗余，但是BETA2和Ngn3都可以驱动胰岛分化并诱导同源结构域蛋白Nkx2.2(White等，2008；Gasa等，2008；Gu等，2010)；Ngn3还诱导Pax4。β细胞谱系的发育需要Nkx2.2和Pax4(Habener和Stoffers，1998；Smith等，2000；Smith等，2003；Brun和Gauthier，2008)。
连同Foxa2和PDX-1，Nkx2.2直接调节MafA表达(Anderson等，2009；Doyle和Sussel，2007；Raum等，2006；Lynn等，2007)。也为Nkx2.2下游的Nkx6.1是β细胞前体发育需要的，特别在β细胞发育的第二波(secondary wave)期间(Sander等，2000)。Nkx6.1还抑制胰高血糖素表达，可能导致通过Isx的胰高血糖素抑制。除了其发育的作用，Foxa2在葡萄糖代谢和胰岛素分泌、调节基因(包括ATP敏感的K+通道亚单位，Kir6.2和Sur-1)中也是重要的(Wang等，2002；Lee等，2002；Lantz等，2004；Gao等，2007)。年轻的成年发病型糖尿病(MODY)可由Hnf4α、Hnf1α和Hnf1β的突变引起，其还调节对于葡萄糖感应和其他β细胞功能重要的许多分子(Eeckhoute等，2001；Gupta等，2005)。MafA的靶标中有葡糖激酶、Glut2、胰高血糖素样肽1受体和加工胰岛素原的激素原转化酶(Pcsk1)(Wang等，2007)。与通过MafA控制这些基因一致，其过表达引起胰岛素分泌的葡萄糖敏感性左移(Wang等，2007)。通过MafA诱导的这些蛋白可能有助于增强的胰岛素产生以及改善的暴露于Isx之β细胞和胰岛的分泌响应性。
Isx通过对乙酰转移酶(包括p300)的作用刺激核蛋白的乙酰化作用。p300具有对β细胞分化和分化功能(包括胰岛素基因转录)的主要影响(Sharma等，1999；Qiu等，1998)。除了修饰组蛋白，p300还可对支持β细胞功能的其他蛋白质乙酰化，例如BETA2(Qiu等，2004)。对突变体的研究表明BETA2的乙酰化作用影响DNA结合和活化功能二者。最近，Kruppel样因子KLF11(MODY7)的突变揭示了与2型糖尿病早期发作的联系(Neve等，2005)。KLF11由p300活化，因为其是其他MODY基因的大片段(Fernandez-Zapico等，2009)。
因此，p300的活化可能是Isx作用重要的机理之一。通过Isx调节的信号传导事件包括ERK1/2两阶段的活化，其暂时地与通过营养物诱导的不同。一些葡萄糖敏感的胰岛素基因转录因子由ERK1/2调节。虽然MafA似乎不是生理ERK1/2底物，但是MafA连同BETA2和PDX-1的染色质结合是ERK1/2依赖的(Lawrence等，2005；Lawrence等，2008)。ERK1/2还使p300磷酸化并控制其活性和染色质缔合，也许解释了由U0126引起的Isx增强之p300活性的部分抑制或激酶失活ERK2突变体的共表达(Chen等，2007；Foulds等，2004)。从胰岛素基因启动子失去p300伴随失去这三种必不可少的因子，表明ERK1/2调节的事件为乙酰化作用，认为其控制这三种因子接近近端启动子。
已经描述了一些策略来从干细胞、胰管和其他分化的细胞类型产生β细胞(Borowiak和Melton，2009)。这些中的大多数包含转录因子组或诱导β细胞分化之激素因子的分期组(staged group)的异源表达(Kobinger等，2005；Zhang等，2009；D'Amour等，2006；Zhou等，2008；Kroon等，2008)。鉴定了从胚胎干细胞诱导胰腺祖细胞的小分子(Chen等，2009)。还已经报道了增强β细胞增殖的化合物(Wang等，2009)。在3-6周处理后，植物生物碱conophylline可从大鼠胰腺腺泡细胞和胎儿胰腺组织诱导β细胞分化(Kawakami等，2010)。除了其明显较慢的作用时间进程，conophylline还使PDX-1mRNA的表达提高至比本文对于Isx所记载的高的程度，表明独特的作用机理。
总之，Isx是迄今鉴定的可以显著改善β细胞功能的相对少的单分子。Isx衍生物是研究β细胞功能的新工具，并且引导能够在移植前拯救休眠人胰岛中胰岛素的生物合成以及可能直接用于糖尿病患者的药物。目前可得的化合物不能用于患者，因为它们需要微摩尔级浓度以发挥其作用。然而，它们对于发展改善β细胞功能的非侵入途径是有价值的帮助。
本文讨论的许多异唑小分子诱导有关胰腺β细胞稳态和功能之因子的表达。因此，这些和另一些异唑衍生物可用作用于预防或治疗糖尿病的药剂。异唑化合物的用途应与诱发低血糖的低风险相关联，其可能是与胰岛素促分泌素(例如受体激动剂和磺酰脲)相关的负面结果。可能它们也可具有对高脂肪酸饮食之抑制结果的有益作用。
***********************
本文公开的和要求保护的所有方法和设备可以在按照本公开内容无不合适的实验下实施和执行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选的实施方案描述，但是对本领域技术人员明显的是在不偏离本发明的内容、精神和范围下对于本文描述的方法和设备以及方法的步骤或方法步骤的顺序可以施加变化。更具体地，明显的是化学和生理二者相关的某些试剂可以替代本文描述的试剂，而将达到相同或类似的结果。对本领域技术人员来说，所有这样的替代和修饰明显视为在如所附的权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念中。
参考文献
以下参考文献以其提供对本文阐述的那些作以补充之示例性程序上或其他细节的程度具体地通过引用并入本文。
Anderson et al.，BMC.Dev.Biol.，9：65，2009.
Aramata et al.，Biochim.Biophys.Acta，1730：41-46，2005.
Benkhelifa，et al.，Mol.Cell Biol.，21：4441-4452，2001.
Bieliauskas and Pflum，Chem.Soc.Rev.，37：1402-1413，2008.
Borowiak and Melton，Curr.Opin.Cell Biol.，21：727-732，2009.
Brun and Gauthier，J.Mol.Endocrinol.，40：37-45，2008.
Buitrago et al.，Diabetologia，11：535-540，1975.
Bundgaard，Drugs of the Future，16：443-458，1991.
Bundgaard，In：Design of Prodrugs，7-9；21-24，Elsevier，Amsterdam，1985.
Chae et al.，Mol.Cells，18：271-288，2004.
Chen et al.，J.Biol.Chem.，282：27215-27228，2007.
Chen et al.，Nat.Chem Biol.，5：258-265，2009.
D′Amour et al.，Nat.Biotechnol.，24：1392-1401，2006.
Doyle and Sussel，Diabetes，56：1999-2007，2007.
Eeckhoute et al.，Mol.Endocrinol.，15：1200-1210，2001.
Fernandez-Zapico et al.，J.Biol.Chem.，284：36482-36490，2009.
Foulds et al.，Mol.Cell Biol.，24：10954-10964，2004.
Gao et al.，Cell Metab.，6：267-279，2007.
Gasa et al.，Differentiation，76：381-391，2008.
Gasa et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：13245-13250，2004.
Genuth et al.，Diabetes Care，26：3160-3167，2003.
Goodge and Hutton，Cell Dev.Biol.，11：235-242，2000.
Greene and Wuts，In：Protecting Groups in Organic Synthesis，3rd ed.，John Wiley&Sons，Inc.，1999.
Gu et al.，Cell Metab.，11：298-310，2010.
Gupta et al.，J.Clin.Invest.，115：1006-1015，2005.
Habener and Stoffers，Proc.Assoc.Am.Physicians，110：12-21，1998.
Halban et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.，95：1034-1043，2010.
Han et al.，Mol.Cell Biol.，27：6593-6605，2007.
Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use，Stahl and Wermuth(Eds.)，Verlag Helvetica Chimica Acta，2002.
Hollande et al.，J.Physiol.(Paris)，72：815-832，1976.
Huang et al.，Mol.Cell Biol.，20：3292-3307，2000.
Kageyama et al.，Int.J.Biochem.Cell Biol.，29：1389-1399，1997.
Kawakami et al.，Biomed.Pharmacother.，64：226-231，2010.
Khoo et al.，J.Biol.Chem.，278：32969-32977，2003.
Kobinger et al.，Mol.Ther.，11：105-111，2005.
Kroon et al.，Nat.Biotechnol.，26：443-452，2008.
Lantz et al.，J.Clin.Invest.，114：512-520，2004.
Lawrence et al.，J.Biol.Chem.，280：26751-26759，2005.
Lawrence et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105：13315-13320，2008.
Lee et al.，Diabetes，51：2546-2551，2002.
Lynn et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104：10500-10505，2007.
Lyttle et al.，Diabetologia，51：1169-1180，2008.
Miyatsuka et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108：185-190，2011.
Muoio and Newgard，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，9：193-205，2008.
Neve et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：4807-4812，2005.
Newgard and McGarry，Annu.Rev.Biochem.，64：689-719，1995.
Ohneda et al.，Semin.Cell Dev.Biol.，11：227-233，2000.
Oliver-Krasinski and Stoffers，Genes Dev.，22：1998-2021，2008.
Qiu et al.，J.Biol.Chem.，279：9796-9802，2004.
Qiu et al.，Mol.Cell Biol.，18：2957-2964，1998.
Raum et al.，Mol.Cell Biol.，26：5735-5743，2006.
Redmon et al.，Diabetes，43：546-551，1994.
Rutter and Parton，Front Horm.Res.，36：118-134，2008.
Sadek et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105：6063-6068，2008.
Sander et al.，Development，127：5533-5540，2000.
Scearce et al.，Diabetes，51：1997-2004，2002.
Schneider et al.，Nat.Chem.Biol.，4：408-410，2008.
Schwitzgebel et al.，Development，127：3533-3542，2000.
Sharma et al.，Mol.Cell Biol.，19：704-713，1999.
Smith et al.，J.Biol.Chem.，275：36910-36919，2000.
Smith et al.，J.Biol.Chem.，278：38254-38259，2003.
Sommer et al.，Mol.Cell Neurosci.，8：221-241，1996.
Steiner et al.，Diabetes Obes.Metab.，11(Suppl4)：189-196，2009.
Steiner et al.，Islets.，2：135-145，2010.
Vaxillaire and Froguel，Endocr.Rev.，29：254-264，2008.
Wang et al.，Diabetologia，50：348-358，2007.
Wang et al.，J.Biol.Chem.，277：17564-17570，2002.
Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，106：1427-1432，2009.
White et al.，Diabetes，57：654-668，2008.
Wicksteed et al.，Cell Metab.，5：221-227，2007.
Wilson et al.，Mech.Dev.，120：65-80，2003.
Xu et al.，J.Biol.Chem.，273：4485-4491，1998.
Zhang et al.，Cell Res.，19：429-438，2009.
Zhou et al.，Nature，455：627-632，2008.

Claims (72)

1.诱导从胰岛β细胞产生和/或分泌胰岛素的方法，其包括使所述细胞与式(I)化合物：
或其可药用盐相接触，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者
烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者
-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
2.权利要求1所述的方法，其中R1为式(A)的取代基。
3.权利要求2所述的方法，其中G为S。
4.权利要求3所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
5.权利要求4所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中R2为氢。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中R3为-NR11R12。
8.权利要求7所述的方法，其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
9.权利要求8所述的方法，其中R12或R13为环丙基。
10.权利要求1所述的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者
R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者
R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
11.权利要求10所述的方法，其中G为S。
12.权利要求11所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
13.权利要求12所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中R11为氢。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中R12为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
16.权利要求10所述的方法，其中所述化合物是：
或其可药用盐。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述细胞位于动物对象中。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中离体进行所述细胞的接触。
19.治疗对象中糖尿病的方法，其包括向所述对象施用式(I)化合物：
或其可药用盐，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者
烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者
-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
20.权利要求19所述的方法，其中R1为式(A)的取代基。
21.权利要求20所述的方法，其中G为S。
22.权利要求21所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
23.权利要求22所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中R2为氢。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中R3为-NR11R12。
26.权利要求25所述的方法，其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
27.权利要求26所述的方法，其中R12或R13为环丙基。
28.权利要求19所述的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者
R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者
R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
29.权利要求28所述的方法，其中G为S。
30.权利要求29所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
31.权利要求30所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法，其中R11为氢。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中R12为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
34.权利要求28所述的方法，其中所述化合物是：
或其可药用盐。
35.根据权利要求19至33中任一项所述的方法，其中所述细胞位于动物对象中。
36.根据权利要求19至33中任一项所述的方法，其中离体进行所述细胞的接触。
37.治疗对象中糖尿病的方法，其包括
(a)使胰岛β细胞离体与式(I)化合物：
或其可药用盐相接触，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者
烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者
-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、芳基(C≤12)或芳烷基(C≤15)；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)；以及
(b)将所述胰岛β细胞施用于所述对象。
38.权利要求37所述的方法，其中R1为式(A)的取代基。
39.权利要求38所述的方法，其中G为S。
40.权利要求39所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
41.权利要求40所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其中R2为氢。
43.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中R3为-NR11R12。
44.权利要求43所述的方法，其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
45.权利要求44所述的方法，其中R12或R13为环丙基。
46.权利要求37所述的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者
R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者
R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
47.权利要求46所述的方法，其中G为S。
48.权利要求47所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
49.权利要求48所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
50.根据权利要求37至49中任一项所述的方法，其中R11为氢。
51.根据权利要求37至50中任一项所述的方法，其中R12为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
52.权利要求46所述的方法，其中所述化合物是：
或其可药用盐。
53.使胰岛β细胞再活化的方法，其包括使所述细胞与式(I)化合物：
或其可药用盐相接触，其中：
R1为取代的或未取代的苯基、取代的或未取代的苯硫基或者式(A)的取代基：
其中：
R4、R5和R6各自独立地为氢、羟基、卤素、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、-NH或S；
R2为：
氢、羟基、卤素、或硝基；或者
烷基(C≤10)、烯基(C≤10)、炔基(C≤10)、烷氧基(C≤10)、烯基氧基(C≤10)、炔基氧基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；或者
-C(O)R7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-C(O)NR8R9、-OC(O)NR8R9、-NR8OR9或-SO3R7；其中
R7为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)；
R8和R9各自独立地为氢、烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)或合在一起为烷二基(C≤6)；
R3为-NH-O-烷基(C≤10)、-NHOH、-OR10或-NR11R12，其中
R10为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、取代的或未取代的芳基(C≤12)或者取代的或未取代的芳烷基(C≤15)；
R11和R12各自独立地为氢、取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)、芳基(C≤12)或芳烷基(C≤15)；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；或者
R11和R12合在一起形成烷二基(C≤6)。
54.权利要求53所述的方法，其中R1为式(A)的取代基。
55.权利要求54所述的方法，其中G为S。
56.权利要求55所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
57.权利要求56所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中R2为氢。
59.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，其中R3为-NR11R12。
60.权利要求59所述的方法，其中R12或R13为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
61.权利要求60所述的方法，其中R12或R13为环丙基。
62.权利要求53所述的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(II)化合物：
或其可药用盐，其中：
R11和R12都为氢；或者
R11为氢且R12为取代的或未取代的烷基(C≤10)、取代的或未取代的烯基(C≤10)、取代的或未取代的炔基(C≤10)或者苄基；或者
R11和R12合在一起为-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2-；
R4、R5和R6各自独立地为：
氢、卤素、羟基、氰基、硝基；或者
烷基(C≤10)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤15)、杂芳基(C≤12)、酰基(C≤10)或这些基团的任何取代形式；并且
G为O、NH或S。
63.权利要求62所述的方法，其中G为S。
64.权利要求63所述的方法，其中R4、R5或R6为氢。
65.权利要求64所述的方法，其中R4、R5和R6每一个均为氢。
66.根据权利要求53至65中任一项所述的方法，其中R11为氢。
67.根据权利要求53至66中任一项所述的方法，其中R12为环丙基或者脂肪族(C≤10)醇或脂肪族(C≤10)多醇。
68.权利要求64所述的方法，其中所述化合物是：
或其可药用盐。
69.根据权利要求53至68中任一项所述的方法，其中所述细胞位于动物对象中。
70.根据权利要求53至68中任一项所述的方法，其中离体进行所述细胞的接触。
71.化合物，其具有下式：
72.药物组合物，其包含分散于可药用缓冲剂、载体、稀释剂或赋形剂中的具有下式的化合物：
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023109779A1 (zh) * 2021-12-13 2023-06-22 清华大学 杂环化合物用于减轻化疗药物引起的不良反应的用途
WO2023130675A1 (zh) * 2022-01-04 2023-07-13 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 Isx-9在治疗衰老相关的昼夜节律幅度下降和睡眠障碍方面的应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150297638A1 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 Muhammad Ashraf Chemically induced pluripotent stem cells for safe therapeutic applications
US10443044B2 (en) 2014-04-17 2019-10-15 Ips Heart Generating cardiac progenitor cells from pluripotent stem cells using isoxazole or isoxazole like compounds
EP3411471B1 (en) * 2016-02-04 2021-01-06 Société des Produits Nestlé S.A. In vitro production of pancreatic beta cells
JP6835899B2 (ja) * 2018-03-29 2021-02-24 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ Ｕｃｐ１発現細胞の培養方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5001124A (en) * 1990-02-02 1991-03-19 Syntex (U.S.A.) Inc. 4-isoxazolecarboxamide derivatives
US20060089398A1 (en) * 2003-03-19 2006-04-27 Gang Liu Isoxazole carboxamide derivatives as ghrelin receptor modulators
CN101035536A (zh) * 2004-10-08 2007-09-12 诺瓦提斯公司 有机化合物的组合
US20090036451A1 (en) * 2006-10-13 2009-02-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Chemical inducers of neurogenesis

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3542827B2 (ja) 1994-07-15 2004-07-14 帝国臓器製薬株式会社 新規な５−置換イソキサゾール−３−カルボン酸アミド誘導体
US20060036451A1 (en) 2004-08-10 2006-02-16 Lundberg Steven W Patent mapping
DE102004054666A1 (de) 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte Pyrazol-3-carboxamide, Verfahren zur Herstellung und Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
KR20080026654A (ko) 2005-07-14 2008-03-25 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 헤테로시클릭 야누스 키나제 3 억제제
WO2007075896A2 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Kemia, Inc. Heterocyclic cytokine inhibitors
KR101394245B1 (ko) * 2005-12-30 2014-05-14 에스케이바이오팜 주식회사 아이속사졸 유도체 및 이의 용도
US7638541B2 (en) * 2006-12-28 2009-12-29 Metabolex Inc. 5-ethyl-2-{4-[4-(4-tetrazol-1-yl-phenoxymethyl)-thiazol-2-yl]-piperidin-1-yl}-pyrimidine
AU2009255183A1 (en) * 2008-06-02 2009-12-10 Msd K.K. Novel isoxazole derivative

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5001124A (en) * 1990-02-02 1991-03-19 Syntex (U.S.A.) Inc. 4-isoxazolecarboxamide derivatives
US20060089398A1 (en) * 2003-03-19 2006-04-27 Gang Liu Isoxazole carboxamide derivatives as ghrelin receptor modulators
CN101035536A (zh) * 2004-10-08 2007-09-12 诺瓦提斯公司 有机化合物的组合
US20090036451A1 (en) * 2006-10-13 2009-02-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Chemical inducers of neurogenesis

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023109779A1 (zh) * 2021-12-13 2023-06-22 清华大学 杂环化合物用于减轻化疗药物引起的不良反应的用途
WO2023130675A1 (zh) * 2022-01-04 2023-07-13 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 Isx-9在治疗衰老相关的昼夜节律幅度下降和睡眠障碍方面的应用
CN116421605A (zh) * 2022-01-04 2023-07-14 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 Isx-9在治疗衰老相关的昼夜节律幅度下降和睡眠障碍方面的应用

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