JP2002511876A

JP2002511876A - 心臓におけるインシュリン耐性を治療し、プロテインキナーゼｂ（ｐｋｂ）活性を強化するための組成物における成長ホルモンの使用

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Publication number: JP2002511876A
Application number: JP50702099A
Authority: JP
Inventors: オーリン，トーマス; レウテルダール，クリステイーナ; ストールボム，アクセル; ビールブルフイー，アンテツク; レンホルム，ハリエツト; ジエイムズ，ステイーブン
Original assignee: フアーマシア・アンド・アツプジヨン・アー・ベー
Priority date: 1997-07-04
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2002-04-16
Also published as: AU737065B2; NO20000007D0; NZ501961A; AU8250698A; NO20000007L; EP1007085B1; EP1007085A1; ATE209042T1; ES2168772T3; DK1007085T3; CA2294824A1; DE69803298T2; DE69803298D1; WO1999001151A1; PT1007085E

Abstract

(57)【要約】本発明は、インシュリン耐性により攻撃された心臓の細胞機能を改善するためのヒト成長ホルモンの投与を含み、およびそれによってこの状態から誘導される合併症から心臓を治療しまたは予防する治療法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】心臓におけるインシュリン耐性を治療し、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）活性を強化するための組成物における成長ホルモンの使用発明の分野本発明はインシュリン耐性にかかった心臓の細胞機能を改善し、それによってこの状態から誘導される合併症から心臓を治療しまたは保護するためのヒト成長ホルモンの投与を含む治療法に関する。発明の背景糖尿病にかかる患者は心臓病にかかる危険があることは広く認められる。Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，１９９７，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１−２を参照。しかし、糖尿病患者に加えて、インシュリン耐性もストレスを受けた心臓で明らかであり、急性および慢性心不全の両方にかかる患者に対するインシュリン耐性の治療の必要性を拡大する。インシュリン耐性は無傷のグルコース摂取および代謝、細胞死（例えばアポトーシス）の媒介物質に対する保護および適当な収縮機能に必要である心筋細胞分化により例示される正常細胞機能を保存するために細胞内シグナル支配を弱めるだろう（ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３４（１）ｐｐ．３−５５，１９９７参照）。したがって、心臓のインシュリン耐性はそれ自体で心不全を促進し、またはストレスのかかった心臓の重大な合併症に素因を与え、それは急性冠状動脈事象、うっ血性心不全および冠状動脈手術のような傷害事象の後に起こりうる。正常には、インシュリン耐性はインシュリン作用の強化剤によりまたは食事制限により循環するインシュリンの超生理学的レベル（supra-physiological level）を適用して治療される。このような治療法は一般のインシュリン耐性に関して重大な欠点または有効性の制限を有する。循環するインシュリンの濃度の増加は血管細胞の過増殖を生じ、それによって組織血液供給を乱す。さらに、インシュリン強化剤は心臓病の危険因子である体脂肪量を増加させる傾向があり、食事制限が非合併性２型糖尿病に対して第一に目標とされる。さらに、心臓のインシュリン耐性から生じる合併症の治療に有効であることが証明された治療法はまだない。インシュリンが動物でグルコースの生体内分布を規制する機構的基礎は近年詳細に明らかにされた。相互作用する蛋白質のカスケードは、正常な場合に作用すると、インシュリンから出るシグナルを変換し、血流からグルコースを吸収し、それを貯蔵する異なる起源の細胞を生じる働きをすると記載されている（Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｆ．（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４０：Ｓ２−Ｓ１７）。現在の理解では、インシュリンによるインシュリン受容体の活性化はインシュリン受容体基質（ＩＲＳ）蛋白質のリン酸化および活性化を生じさせる。これらの蛋白質は活性化につながる種々の下流蛋白質に対するドッキング蛋白質として作用するために役立つ。インシュリンシグナリングにおける主要下流蛋白質はホスホイノシチド３−キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）であり、それは第二メッセンジャーホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸の生成を触媒する。これは脂質であり、それはＰＫＢの活性化に対する中心部である（Ｆｒａｎｋｅ，Ｔ．Ｆ．ｅｔａｌ．(１９９５)Ｃｅｌｌ８１：７２７−７３６；Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｒ．ｅｔａｌ．(１９９６)ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ３１５：７０９−７１３；Ｆｒａｎｋｅ，Ｔ．Ｆ．ｅｔａｌ．(１９９７)Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：６６５−６６８；Ｋｌｉｐｐｅｌ，Ａ．ｅｔａｌ．(１９９７)ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１７：３３８−３４４；Ａｌｅｓｓｉ，Ｄ．Ｒ．ｅｔａｌ． (１９９７)ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ７：２６１−２６９；Ｓｔｏｋｏｅ，Ｄ．ｅｔａｌ．(１９９７)Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：５６７−５７０）。それはＰＫＢおよびＰＫＢの活性化に含まれる３−ホスホイノシチド−依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）と呼ばれる上流キナーゼのプレクストリン相同性（ＰＨ）領域により結合される。ＰＫＢはリン酸化によりＢＡＤ（ＢＣＬ２蛋白質同族の一員）を阻害し、それによってＢＡＤのアポトーシス促進効果を防ぐ（ｄｅｌ−Ｐｅｓｏ−Ｌｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７８(５３３８)：６８７−９；Ｄａｔｔａｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，１９９７；９１(２)；２３１−４１）。ＰＫＢはグルコース利用の規制およびインシュリンによる蛋白質合成の制御における主要中間体であると思われる（Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．，ｅｔａｌ．(１９９５)，Ｎａｔｕｒｅ３７８：７８５−７８９；Ｃｏｈｅｎ，Ｐｅｔａｌ．(１９９７)，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４１０：３−１０；Ｐｅａｋ，Ｍ．，Ｊ．ｅｔａｌ．(１９９８)，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４１：１６−２５）Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．−Ｃｅｔａｌ．(１９９８)ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２：５０２−５１３）。このように、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３；グルコースからのグリコーゲンの合成を可能にする）をリン酸化し、不活性化することが示された。さらに、心筋細胞では、ＰＫＢはホスホフラクトキナーゼ−２をリン酸化し、活性化し（Ｄｅｐｒｅｚ，Ｄｅｔａｌ．(１９９７)ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２７２：１７２６９−１７２７５）、その生成物フラクトース２，６− ビスリン酸が解糖のアロステリック活性化剤として作用することが示された。ＰＫＢに対する第三の可能性のある基質は３Ｂ型環状ＡＭＰホスホジエステラーゼであり（ｗｉｊｋａｎｄｅｒ，Ｊ．ｅｔａｌ．(１９９８)．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３９：２１９−２２７）、インシュリン応答性組織ではリン酸化により活性化され、アドレナリン刺激過程の不活性化に導く。ここで、そうでなければインシュリン耐性により損なわれてしまう心臓細胞機能が正常状態に維持され、改善した機能に調節されるような治療法を発見することが非常に望ましい。特に、インシュリンシグナル形質導入経路で耐性に打ち勝つ能力を備えた天然物質を用い、それによって追加の損傷から心臓を守ることが、このような治療法で有利である。このような治療法は心不全の進行する危険性のある糖尿病患者、明らかにインシュリン耐性のある慢性心不全患者およびしばしばインシュリンに応答する能力が無いことを特徴とする急性心臓障害にかかった患者に適用される。ヒト成長ホルモンは心臓治療のいくつかの局面で潜在的に有益であると報告される天然シグナリング物質である。例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ．への国際特許出願ＷＯ９５２８１７３は改善した心臓機能を生じるヒト成長ホルモンによるうっ血性心不全の有望な治療を開示する。対照的に、心不全のヒト成長ホルモン治療に非応答性患者の報告がある、例えば、ＦｒｕｓｔａｃｉＡｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３３５（９）：６７２−４，１９９６。ヒト成長ホルモンも特発性心筋症における心室の膨張後心臓組織の適当な成長を支持して心不全への積極的効果を及ぼすことを示した（ＦａｚｉｏＳｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３３４：８０９−１４，１９９６）。さらに、ヒト成長ホルモンはいくつかの細胞種において細胞死（アポトーシス）を抑制すると報告される、例えば、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１９９５，Ｖｏｌ．５３（１），ｐｐ．１３−２０（ＫＥｉｓｅｎｈａｕｅｒｅｔａｌ．）およびＨｏｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９６，Ｖｏｌ．４６（４−５）、ｐｐ．２１５−２２１（ＳＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄｔ）参照。下垂体切除ラットへの成長ホルモン置換補填は横隔膜筋肉におけるグルコース摂取を改善することを示した、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９６２，Ｖｏｌ．１１（３）．ｐｐ．１７１−１７８参照。対照的に、ホルモンの超生理学的循環レベルを生じる、ＧＨによる薬学的治療は全身グルコース摂取および処分の低下ならびに骨格筋におけるインシュリンへの鈍化した代謝応答（すなわち、インシュリン耐性）を生じることが知られる。ＨｅｔｔｉａｒａｃｈｃｈｉＭｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ４５（４）：４１５−２１、１９９６参照。しかし、脂肪組織のような、代謝的に筋肉と顕著に異なる組織で、ＧＨは、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９６．Ｖｏｌ．１３７（１１），ｐｐ．４６５０−５ＭＲｉｄｄｅｒｓｔｒａｌｅｅｔａｌ．で報告されたように、グルコース摂取を誘起する。したがって、本発明に従って、成長ホルモン治療法が、インシュリンの欠如で、改善したグルコース代謝およびストレスへの耐性を生じる心筋細胞でインシュリン様シグナリングを誘起するために使用されることは予想されない。発明の説明本発明は、ヒト成長ホルモンが心臓細胞にインシュリン様効果を及ぼし、それによってインシュリン耐性中にこのホルモンを置換できるという発見に基づく。一般に、本発明は心臓にインシュリン耐性を受ける危険のある、患者への投与のための薬剤の調製における有効量のヒト成長ホルモンの利用に関する。さらに詳細には、本発明は、適当な代謝およびインシュリン耐性で攻撃された心臓におけるストレスへの耐性を維持し、心臓をインシュリン耐性から誘導される合併症から防ぐために薬剤の調製におけるヒト成長ホルモンの有効用量の使用に関する。典型的には、インシュリン耐性は慢性ストレスまたは手術を含む傷害的事象により誘起されるが、糖尿病に関する状態からも誘導される。本発明の治療法は、具体的には十分な冠状動脈血流を達成し、心臓におけるシグナリングに依存するインシュリン受容体の減少の結果として低下する適当な心臓収縮機能を維持するためにストレス誘起細胞死に対して保護を誘起するために、グルコース輸送、グルコース酸化および脂肪酸酸化を含む、乱された心臓代謝を正常化することを目標とする。さらに、発明の成長ホルモン治療法は、グルコース利用の規制およびインシュリンによる蛋白質合成の制御における主要中間剤である、ＰＫＢ（蛋白質キナーゼＢ）の活性を強化することが分かった。結果的に、成長ホルモン製剤は、例えば、心筋梗塞、高血圧、遺伝障害、ならびにインシュリン耐性から生じ、およびそれによって治療しまたは心臓を保護する合併症で生じた急性不全に共通の危い心臓機能を改善するために使用される。本発明は特にインシュリン耐性を含む糖尿病にかかり、心臓合併症を受ける患者のために適当な治療を構成する。さらに、慢性および急性心不全にかかる患者は、彼らがインシュリン耐性を進展させるストレスまたは傷害のような状態に曝される場合には、本発明に係る治療から利益を受ける。熟練した医師なら、いかなる障害がインシュリン耐性に進展し、それによってこのような心臓患者をさらに攻撃するかを判断できるだろう。さらに、本発明によって、心臓合併症を受ける危険のある、個人が、インシュリン耐性試験、例えば、経口グルコース負荷試験、グルコース／鉗子分析または飢餓血糖レベルの分析を患者に受けさせることによりヒト成長ホルモンによる治療に対して適格であるか否かを決定することもできる。あるいは、心臓におけるインシュリン耐性の特異的決定を可能にする試験も、適用するのに適当なとき、例えばバイパス手術に関連して適用可能である。このような試験は、患者が治療し、又はインシュリン耐性による追加の合併症から心臓を予防するためのヒト成長ホルモン治療法から恩恵を受けるか否かを決定するための簡単で有効な予後診断用具を提供する。したがって、本発明のヒト成長ホルモンの効用は、インシュリンがその全作用（インシュリン耐性）を及ぼすことを予防し、心臓合併症が明らかに進展する病理学的状態で特に強力である。インシュリン耐性に関連する心臓合併症は臨床的に慢性虚血、収縮機能障害またはうっ血として定義される。組織および細胞レベルにおいて、心不全はクレアチンキナーゼおよびトロポニンの心臓イソ型、心臓の不適当な血液潅流、低いグルコース摂取で例示される乱れた代謝および高い乳酸生成、機能不全カルシウム規制または細胞死の増加のような血液への心臓酵素の洩れで確認される。インシュリン耐性およびそれに伴う合併症の治療のための有効組成物の調製に使用される「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」は本発明およびその添付の請求の範囲の文脈で幅広い定義を有することを意図する。それは、打ち切り形、その断片、その特性を調節するための相補剤との接合体を含むｈＧＨの修正または延長アミノ酸配列または誘導体を有する形態のような機能的同族活性のｈＧＨの全変種を含む、ｈＧＨ活性を示す、天然の、組換えまたは合成ポリペプチドまたは蛋白質のいずれの形も指す。この定義はａ）ｈＧＨ受容体への親和性および／またはｈＧＨ受容体を活性化する能力を有するｈＧＨ作用を模倣する分子；またはｂ）ほ乳類組織からｈＧＨを放出する能力を有する分子のような、成長ホルモン活性または成長ホルモン活性を含む能力のある他の化合物も含むだろう。本発明によるｈＧＨからなる薬剤は好適には、直接または生理的液体による再構成後のいずれかで、非経口投与を目的とする、凍結乾燥生成物または水溶液を提供するために、生理的特性の一つまたはいくつかの任意の添加剤（担体、添加剤または安定剤）を含むことにより貯蔵のために調製されたｈＧＨの慣用の治療用製剤である。一つのこのような適当なｈＧＨ製品はＡＢより提供）である。本発明で使用が考えられているｈＧＨの多くの他の製剤は言及した刊行物ＷＯ９５／２８１７３で論じられている。また本発明で使用するための他の投与形態も、それらが有効用量を提供すると考えられるならば、当業者には考えられるだろう。上述の合併症を治療するために投与する必要のあるｈＧＨの有効量は患者および投与形に応じて変わるだろう。臨床の当業者なら、所望の言及した治療効果を知り、それによって慣用の方法および試験によって患者応答を調査するために、用量を調節し、適当な投与経路を選ぶことができるだろう。本発明がヒト成長ホルモンによる人の治療を主として対象するとしても、対応する生物活性を有する成長ホルモンにより他のほ乳類の治療にそれを拡張することが考えられる。説明の以下の例示部分は本発明を例示するためのものであり、結果はインシュリン耐性にかかる人を含むほ乳類に成長ホルモンの適当な投与後に再現可能であると考えられる。発明の詳細な説明第１図は細胞生存度がヒト成長ホルモン補填後心筋細胞で増加することを示す。第２図はヒト成長ホルモンで刺激するとグルコースの輸送が心筋細胞で増加することを示す。第３図は成長ホルモンで刺激された心筋細胞においてグルコース輸送へのウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）の影響を示す。第４図はマイトマイシンおよびＳＮＡＰで誘起されたアポトーシスおよびウオルトマンニンの存在下または不存在下でＧＨおよびＩＧＦ−１により得られた効果を示す。第５図は心筋細胞が成長ホルモンで刺激されるといかにグルコース酸化およびパルミチン酸酸化が影響されるかを示す。第６図は蛋白質キナーゼＢ（ＰＫＢ）が成長ホルモンにより心筋細胞でいかに活性化されるかを示す。実施例１本実施例は、心筋細胞が機能的に組合わせた成長ホルモン受容体およびこれらの細胞におけるホルモンの代謝効果を発現するか否かを研究することを目的とする。本実験で使用された心筋細胞は高度に分化し、ほ乳類から調製された。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）をＧｉｂｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国から購入した。組織培養供給はＣｏｓｔａｒ、米国からであった。ｒｈＧＨ、ゲノトロピンはＰｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎからであった。ＧＨ受容体に対する抗体（Ｍａｂ２６３，Ｄ７．１８．３Ｄ５／１３１，バッチ＃１７４Ａ−００５）をＡｇｅｎ、オーストラリアから購入した。一次培養の調製のために慣用の処理手順により心筋細胞を分離し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）で補足したダルベッコ修飾イーグル培地に保存した。可溶化膜製剤を用いるウェスタンブロッティング法によりまたは流動細胞解析により成長ホルモン受容体を検出した（ＫａｍｅｎｔｓｋｙＬ．Ａ．（１９７３）Ｃｙｔｏｌｏｇｙａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．１４：９３）。アッセイ用キット、ＢｉｏｍｅｄｉｃａによるＥｚ４ｕを用いることにより細胞生存度を測定した。方法は、無傷の細胞が無色テトラゾリウム塩を着色誘導体に還元でき、それは容易に分光測定で測定されるという発見に基づく。この方法は、還元過程が細胞死後不活化される機能性ミトコンドリアを必要とするので、生きている細胞と死んだ細胞を識別する。このように、生きられる細胞の量は直接ＯＤに比例する。Ｈｕｎｄａｌｅｔａｌ（１９９４）により記載されたようにグルコース輸送を測定した。簡単に言えば、特に断りのない限り、細胞を血清のない培地で４時間培養し、その後成長ホルモンとの培養を６０分間行った。ついで細胞単一層をクレブスリンゲル重炭酸塩緩衝液（ＫＲＢ）ｐＨ７．４で洗浄した。ＫＲＢ中の³Ｈ−２−デオキシーグルコースの存在下で８分間細胞を培養してグルコース輸送を定量した。１０μＭサイトカラシンＢの存在下で細胞関連放射能を定量して非特異的摂取を決定した。放射性培地の急速吸引で２−デオキシ−グルコースの摂取を終結し、その後冷たいＰＢＳによる細胞単一層の三回連続洗浄を行った。液体シンチレーション計数の前に０．５ＭＮａＯＨ中で細胞を溶菌した。各ウエル中の蛋白質含量に対してグルコース輸送の速度を規格化した。Ｌａｅｍｍｌｉの方法（１９７０）によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８％アクリルアミド）で膜蛋白質を分離した。Ｔｏｗｂｉｎｅｔａｌ．，（１９７９）によりウエスタンブロッティングを行なった。製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の説明に従ってＥＣＬ法で硝酸セルロースフィルター上の免疫複合体の存在を決定した。ＧＨ受容体の検出接着細胞に対する標準法により心筋細胞を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で試料を分離し、ニトロセルロース膜上に移した。抗ＧＨ受容体の存在下で膜を培養した。化学発光法（ＥＣＬ）により抗体および抗原−抗体複合体を検出した。ａ −ＧＨＲ抗体および二次ＦＩＴＣ接合ウサギ抗マウスＦ（ａｂ）２により細胞を免疫染色した。４８８ｎｍアルゴンレーザおよび５２５ｎｍ帯域フィルターを用いるＥＰＩＣＳＸＬフローサイトメーターにより解析を行なった。結果は、成長ホルモン受容体がＡＴ−１細胞土の表面で入手できることを示した。特異的ヌクレオチド配列への転写因子の結合および以下に示す生物的応答を明らかにするゲルシフト試験を用いて、活性化ＳＴＡＴ５により受容体の機能的結合を確認した。細胞生存度２０、２００または２０００ｎｇ／ｍｌＧＨを補足した無血清培地中で２４時間細胞を培養した。対照として、無血清培地のみまたは１０％ＦＣＳを含む培地中で細胞を培養した。血清飢餓細胞では１０％ＦＣＳ中で培養した細胞と比較して生存度の４０％低下を見た。第１図に示すように、ＧＨは細胞生存の有益な効果を有し、使用した最高用量、２０００ｎｇ／ｍｌは無血清培地のみで培養した細胞と比較して、ＯＤまたは生きられる細胞に有意な差を示した。さらに、生存度評点は、これらの細胞が実験的使用に適当であったことを示す。グルコース輸送心筋細胞を無血清培地で４時間培養し、その後血清飢餓細胞に異なる用量のＧＨの培養を６０分まで続けた。第２図に示したように、グルコース輸送速度の増加が見られた。用量、２００および２０００ｎｇ／ｍｌではそれそれ６８および７８％まで速度を有意に増加した。別のアッセイでは、心筋細胞を無血清培地中１μｍのウォルトマンニン有りまたは無しで４時間培養した。最後の１時間は、細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＧＨまたは対照として１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１で刺激した。グルコース輸送測定を行ない、第３図に示したように、ウォルトマンニン処理細胞はグルコースの輸送増加で応答しない。これは、ウォルトマンニンが、シグナル変換体ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３ −キナーゼ）の特異的不活化によりインシュリン受容体から発生したシグナル変換を有効に阻害するためである。実施例２心筋細胞を発育させ、実施例１に従って処理した。心筋細胞におけるアポトーシスへの成長ホルモンの効果を評価するために、５ｍＭの酸化窒素供与体ＳＮＡＰ（Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン）および３０μＭのＤＮＡ架橋剤およびｐ５３誘発剤、マイトマイシンを次の案によるアポトーシス誘発剤として心筋細胞の試料に加えた：３０μｍのマイトマイシンおよび５ｍＭのＳＮＡＰを無血清培地に加え、そこで瓶をそれそれ６時間および１６時間培養した。試料を採取する前に全細胞を一夜培養し、次の結果でＴＵＮＥＬ分析（プログラム化した細胞死、アポトーシスに特徴的であるフラグメント化ＤＮＡを同定する末端標識法）のために標識化した：表１の結果は、マイトマイシンおよびＳＮＡＰの淵加が心筋細胞にアポトーシスを誘発することおよびＧＨが細胞死（アポトーシス）に対して強力に保護することを明らかに示した。ＳＮＡＰと組合わせたマイトマイシンで攻撃された胎児心筋細胞への０．１μｍウォルトマンニンの添加で実験を繰返し、上記の実験に従ってＧＨおよびＩＧＦ−Ｉで処理した。第４図に示した結果はウォルトマンニンがＧＨおよびＩＧＦ−Ｉにより及ぼされたアポトーシスに対して保護を廃することを示す。ＧＨの保護能力を廃するウォルトマンニンの能力は前記ホルモンの有益な効果がＰ１３Ｋを含むインシュリン様シグナリングで媒介される、という更なる証拠を提供する。実施例３心筋細胞を発育させ、実施例１に従って処理した。１４Ｃ−グルコースまたは１４Ｃ−パルミチン酸の酸化速度をＬｏｐａｓｃｈｕｋｅｔａｌ（１９８９）（ＧａｒｙＤ．Ｌｏｐａｓｃｈｕｋ、ＧｏｒｄｏｎＦ．ＭｃＮｅｉｌおよびＪｅｆｆｅｒｅｙＪ．ＭｃＶｅｉｇｈ、１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８：１７５−１７９）に記載された原理に従って決定した。グルコース酸化心筋細胞を無血清培地で４時間培養し、つづいて¹⁴Ｃ−グルコース（０．２μ Ｃｉ／ｍｌ，５ｍＭグルコース）＋／−インシュリンＧＨを補足された３ｍｌの培地を加えた。ろ紙を含む装置を培養フラスコに設置し、スクリューキャップを締め、細胞を更に１時間３７℃で培養した。ＣＯ₂測定の終了前に、０．４ｍｌのハイアミン溶液をろ紙に加え、その後培地へ０．４ｍｌの４Ｍ硫酸を注入した。ついでフラスコを振とう機上で室温で追加の６０分間培養した。最後に、ろ紙を小片に切り、シンチレーション瓶に移し、シンチレーション溶液（１０ｍｌ）およびメタノール（２００μｌ）を各瓶に加え、試料の放射能を計数した。ブランクとして、培地を含むフラスコ（細胞無し）を上記と全く同様に処理した。第５図はＧＨおよびインシュリンが心筋細胞でグルコース酸化速度を刺激することを示す。パルミチン酸酸化心筋細胞を無血清培地で４時間培養し、続いて¹⁴Ｃパルミチン酸塩（１２０ｕＭ（０．２μＣｉ）／ｍｌ）＋／−インシュリン／ＧＨを補足した３ｍｌ培地を各フラスコに加えた。ろ紙を含む装置を培養フラスコに設置し、スクリューキャップを締め、細胞を３７℃で１時間培養した。ＣＯ₂測定の終了前に、０．４ｍｌのハイアミン溶液をろ紙に加え、その後培地へ０．４ｍｌの４Ｍ硫酸を注入した。ついでフラスコを振とう機上で室温で追加の６０分間培養した。最後にろ紙を小片に切り、シンチレーション瓶に移し、シンチレーション溶液（１０ｍｌ）およびメタノール（２００μｌ）を各瓶に加え、試料の放射能を計測した。ブランクとして、培地を含むフラスコ（細胞無し）を上記と全く同様に処理した。第５図は、ＧＨおよびインシュリンが心筋細胞中のパルミチン酸酸化速度を刺激することを示す。実施例４心筋細胞へＧＨにより及ぼされる効果のシグナリングに関するＰ１３Ｋの関与をさらに明らかにするために、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）の活性をアッセイした。心筋細胞を成育させ、実施例１に従って処理した。その後細胞を飢餓にし、ついで溶菌させ、溶菌液の蛋白質濃度を決定した。溶菌液を蛋白質および体積に整合させ、ＰＫＢのイソ形を蛋白質Ｇビーズに予め結合した特異的抗体を用いて免疫沈澱させた。厳重な洗浄の後、免疫沈澱を先に記載したように特異的ペプチド基質を用いて３０分間ＰＫＧ活性についてアッセイした（Ａｌｅｓｓｉ，Ｄ．ｅｔａｌ（１９９７）ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ７，２６１−２６９）。第６図はＧＨがＰＫＢの急速で顕著な活性化を生じることを示す。考察要約すると、実施例１および２から、心筋細胞が機能的に結合したＧＨ受容体を発現することを示した。実施例はさらに、刺激されたグルコース輸送速度およびストレス誘起細胞死の低下した速度をそれそれ反映して、ＧＨが心筋細胞への代謝的および保護的効果の両方を及ぼすことを示す。ＧＨ処理に応答して心筋グルコースおよび脂肪酸酸化の顕著な増加によって、本発明の範囲は、グルコースおよび脂肪酸のような栄養素がエネルギーに変換される効率を強化する処理にまで拡大される。この増加したエネルギー供給は心臓の収縮機能および効率を改善することが予期される。さらに、ＧＨがシグナル変換体、例えばホスホイノシチド３−キナーゼおよびこの下流の活性体を活性化し、それはストレス誘起細胞死に対する適当な代謝および保護を維持するためにインシュリン作用の重要な媒介物である。この言明はＧＨ処理に続くＰＫＢの急速で顕著な活性化により実証される。ＧＨにより及ぼされたインシュリン様効果はインシュリン非依存性で、ここで糖尿病で現れるインシュリン耐性の場合または急性および慢性心不全のある場合のようにインシュリン作用が阻害される場合に治療的に使用できる。本発明による心臓のＧＨ治療の治療的可能性は、これらの効果が、ＧＨがインシュリンシグナリング経路を経て作用するという原理の証明のみであるように、細胞死に対するグルコース輸送および保護に制限されるべきでない。ここで、心臓へのＧＨ作用はさらに筋肉組織へのインシュリンの追加の効果、例えば酸化能力、細胞分化状態および収縮機能に拡大される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年８月１３日（１９９９．８．１３）【補正内容】インシュリン耐性およびそれに伴う合併症の治療のための有効組成物の調製に使用される「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」は本発明およびその添付の請求の範囲の文脈で幅広い定義を有することを意図する。それは、打ち切り形、その断片、その特性を調節するための相補剤との接合体を含むｈＧＨの修正または延長アミノ酸配列または誘導体による形のような機能的同族活性のｈＧＨの全変種を含む、ｈＧＨ活性を示す、天然の、組換えまたは合成ポリペプチドまたは蛋白質のいずれの形も指す。この定義はｈＧＨ受容体への親和性および／またはｈＧＨ受容体を活性化する能力を有するｈＧＨ作用を模倣する分子のような、成長ホルモン活性を有する他の化合物も含むだろう。本発明によるｈＧＨからなる薬剤は好適には、直接または生理的液体による再構成後のいずれかで、非経口投与を目的とする、凍結乾燥生成物または水溶液を提供するために、生理的特性の一つまたはいくつかの任意の添加剤（担体、添加剤または安定剤）を含むことにより貯蔵のために調製されたｈＧＨの慣用の治療用製剤である。一つのこのような適当なｈＧＨ製品はＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐｊｏｈｎＡＢより提供）である。本発明で使用が考えられているｈＧＨの多くの他の製剤は言及した刊行物ＷＯ９５／２８１７３で論じられている。また本発明で使用するための他の投与形態も、それらが有効用量を提供すると考えられるならば、当業者には考えられるだろう。上述の合併症を治療するために投与する必要のあるｈＧＨの有効量は患者および投与形に応じて変わるだろう。臨床の当業者なら、所望の言及した治療効果を知り、それによって慣用の方法および試験によって患者応答を調査するために、用量を調節し、適当な投与経路を選ぶことができるだろう。本発明がヒト成長ホルモンによる人の治療を主として対象するとしても、対応する生物活性を有する成長ホルモンにより他のほ乳類の治療にそれを拡張することが考えられる。説明の以下の例示部分は本発明を例示するためのものであり、結果はインシュリン耐性にかかる人を含むほ乳類に成長ホルモンの適当な投与後に再現可能であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１１１１Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ストールボム，アクセルスウエーデン国、エス―129 36・ヘーイエンシユテン、セルメダルスベーゲン・30 (72)発明者ビールブルフイー，アンテツクスウエーデン国、エス―127 33・フアールホルメン、タンチエビユツガーバツケン・87 (72)発明者レンホルム，ハリエツトスウエーデン国、エス―142 61・トロングスンド、トーンスリンガン・８ (72)発明者ジエイムズ，ステイーブンスウエーデン国、エス―162 45・ベーリングビユ、ビエーンモツセベーゲン・27

Claims

【特許請求の範囲】１．心臓にインシュリン耐性を有する又はその危険のある患者に投与するための薬剤の調製における有効用量のヒト成長ホルモンの使用。２．適当なグルコース代謝が保持され、ストレスへの耐性がインシュリン耐性により攻撃された心臓で得られる、請求の範囲第１項に記載の使用。３．インシュリン耐性から誘導される合併症から心臓を予防することを特徴とする、請求の範囲第１項または第２項に記載の使用。４．インシュリン耐性が手術を含むストレスまたは傷害事象によって誘起される、請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の使用。５．心臓細胞の乱されたグルコース代謝が正常化されまたは予防される、請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の使用。６．グルコース酸化が改善される、請求の範囲第５項に記載の使用。７．心臓細胞の脂肪酸酸化が改善される、請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載の使用。８．十分な冠状動脈血流が改善される、請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の使用。９．心臓の収縮機能または効率が改善される、請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の使用。１０．治療した患者が糖尿病または慢性若しくは急性心不全にかかる、請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の使用。１１．プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）の活性を強化するための薬剤の製剤における有効用量のヒト成長ホルモンの使用。１２．前記製剤が心臓機能が危険な状態にある患者に投与される請求の範囲第１１項に記載の使用。１３．心臓合併症にかかっている又はその危険がある個人がヒト成長ホルモンによる治療に適しているかどうか判定する方法であって、インシュリン耐性試験を前記個人に受けさせることを特徴とする前記方法。１４．心臓合併症にかかっているまたはかかる危険のある個人がインシュリン耐性から誘導される合併症から心臓を治療しまたは予防するためのヒト成長ホルモン療法に対し感受性があるかどうかを判定する診断手段を提供するためのインシュリン耐性試験の使用。