KR20070085093A - Ａｍｐ-활성화 단백질 키나아제의 약리학적 저해에 의한신규한 신경 보호 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌졸중을 경험하고 있거나 경험한 환자에게 AMPK 저해제인 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 보호 방법을 제공한다. 이러한 약제를 이용한 치료는 경색부의 크기를 유의하게 감소시키며, 따라서 뇌의 조직 및 뉴런의 손실을 최소화한다. 따라서, 뇌에 있어서 뇌졸중 또는 허혈성 상해 후에 기능이 보존될 수 있다. 이와 유사하게, 뉴런에 있어서 에너지 이용성 및 유용성을 혼란하게 함으로써 뉴런 절충 (neuronal compromise)을 야기하는 퇴행성 질환에서 뉴런의 손실이 최소화될 수 있다.

뇌졸중, 신경 보호 방법, 뉴런 손실, AMP-활성화 단백질 키나아제 저해제

Description

ＡＭＰ-활성화 단백질 키나아제의 약리학적 저해에 의한 신규한 신경 보호 방법{NOVEL METHOD OF NEUROPROTECTION BY PHARMACOLOGICAL INHIBITION OF AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE}

뇌순환 장애로 생기는 뇌기능 이상으로 정의되는 뇌졸중은 미국에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 심지어 뇌졸중이 사망으로 이어지지 않을 경우에도, 희생자에게 부과되는 비용은 심각한 육체적 감정적 손상을 포함할 수 있으며, 상기 손상은 생산성의 손실로 이어질 수 있다. 이러한 비용은 뇌졸중에 의해 희생자의 뇌에 행해지는 엄청난 손상에서 기인한다. 산소 및 글루코스가 감소되면, 세포는 단백질 합성의 신속한 중단, 세포내 에너지 저장체의 고갈, 세포막의 불안정화, 및 NMDA 수용체의 활성화를 나타내어 뇌에서의 흥분 독성 및 산화적 세포 손상에 이른다. 산화적 손상에서 생존하고 산화적 손상을 복구하며 세포를 항상성으로 되돌리려는 시도에 있어서, 다수의 보상성 에너지 소비 과정이 활성화된다. 그러나, 이러한 경로의 과활성화는 유해하며 세포 에너지를 더 고갈시키고, 추가의 뇌 손상으로 이어질 수 있다. 이러한 뇌 손상은 일반적으로 비가역적이다. 따라서, 뇌졸중 동안 손상으로부터 뇌 조직을 보호 (신경 보호)하는 방법이 엄청나게 중요하다.

대사 산물을 감지하는 단백질 키나아제 패밀리의 구성원인 AMP-활성화 단백질 키나아제 (AMP-activated protein kinase, AMPK)는 말초 에너지 밸런스의 공지 된 센서이다 (문헌[Carling D., "The AMP- activated protein kinase cascade-a unifying system for energy control. "Trends Biochem Sci 6: 314 (2): 580-585, 2004]). AMPK는 촉매 α 서브유닛 (α1 또는 α2), 및 2개의 조절 서브유닛 (β 및 γ)으로 구성된 헤테로삼량체 단백질이다. AMPK는 세포 에너지 수준이 낮을 때 인산화되고 활성화된다. AMPK는 다시 세포 대사 작용을 조절하며 유전자 발현을 장기간에 걸쳐 조절하여 ATP의 수준을 회복한다. AMP/ATP 비의 증가, 세포 pH 및 산화 환원 상태의 변화와, 크레아틴/포스포크레아틴 비의 증가가 AMPK를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Hardie DG, Salt IP, Hawley SA, Davies SP, "AMP-activated protein kinase: an ultrasensitive system for monitoring cellular energycharge,"Biochem J 338 : 717-22, 1999]; 문헌[Hawley SA, Davison M, Woods A, et al. ,"Characterization of the AMP-activated protein kinase kinase from rat liver and identification of threonine 172 as the major site at which it phosphorylates AMP- activated protein kinase, "J Biol Chem 271: 27879-87, 1996]). AMPK는 에너지-고갈 세포에서 APT의 수준을 증대시키려는 시도에서 지방산 합성을 제한하며 지방산의 산화를 증가시킨다. 그러나, 지방산 산화에 대한 역량이 제한된 뉴런에 있어서, 이러한 효과는 유해할 수 있다 (문헌[Almeida A, Moncada S, Bolanos JP, "Nitric oxide switches on glycolysis through the AMP protein kinase and 6-phosphofructo-2- kinasepathway, "Natute Cell Biology 6: 45-51, 2004]).

미국 특허 제5,981,575호 (본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있는 합성 지 방산 신타아제 (fatty acid synthase, FAS) 저해제인 C75를 이용한 팔미테이트의 드 노보 (de novo) 합성에 책임이 있는 효소인 지방산 신타아제 (FAS)의 저해는 뉴런을 비롯한 다수의 세포 유형에서 ATP 수준을 증가시킨다. AMPK는 시상 하부에서 뉴런에서 고도로 발현되며, 여기서, AMPK는 식품 섭취의 조절에서 그 역할을 하는 것으로 나타났다. 시상 하부의 인산화 AMPK (pAMPK)는 기아에서 증가되며, C75 처리는 AMPK를 불활성화시키고 탈인산화시키며, 심한 식욕 부진을 유발한다.

에너지 공급물에 접근하지 않는 뉴런에서의 AMPK 활성화 결과는 알려져 있지 않다. 본 발명까지는, 스트레스 동안의 AMPK 활성화가 보호성인지 손상성인지가 불명확하였다. 뇌졸중에서의 AMPK의 역할을 조사하는 종래의 연구는 전혀 없었다.

발명의 개요

본 출원인은 뇌졸중을 경험하고 있거나 뇌졸중을 경험한 환자에게 AMPK 저해제인 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 보호 방법을 발명하였다.

이러한 약제를 이용한 치료는 경색부의 크기를 유의하게 감소시키며, 따라서 뇌의 조직 및 뉴런의 손실을 최소화한다. 따라서, 뇌에 있어서 뇌졸중 또는 허혈성 상해 후에 기능이 보존될 수 있다. 이와 유사하게, 뉴런에 있어서 에너지 이용성 및 유용성을 혼란하게 함으로써 뉴런 절충 (neuronal compromise)을 야기하는 퇴행성 질환에서 뉴런의 손실이 최소화될 수 있다.

도 1 - 허혈성 생쥐 뇌에서의 AMPK 및 pAMPK의 면역 조직 화학적 위치화.

도 2 - 허혈성 생쥐 피질 및 해마에서의 PAMPK 및 NeuN의 면역 조직 화학적 위치화.

도 3 - 뇌졸중 후의 pAMPK의 상승의 시간 코스.

도 4 - AMPK 인산화가 시험관 내 산소-글루코스 결핍 (oxygen-glucose deprivation, OGD) 후 상승된다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 분석.

도 5 - pAMPK가 허혈성 및 비허혈성 뇌 반구에서 상승된다는 것을 보여주는 TTC 염색 및 웨스턴 블롯 분석.

도 6 - 화합물 C 처리는 국지적이거나 전체적인 뇌졸중 볼륨에서의 유의한 감소를 야기한다.

도 7 - C75의 투여는 유의한 신경 보호에 이른다.

도 8 - AMPK 활성제인 AICAR의 투여는 뇌졸중을 악화시킨다.

도 9 - 야생형 (wild type, WP) 및 뉴런 산화질소 신타아제 결함성 생쥐 (nNOS-/-)에서의 AMPK 및 pAMPK의 수준.

도 10 - 야생형 (WT) 및 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제 (PARP-1) 결함성 생쥐에서의 AMPK 및 pAMPK의 수준

"신경 보호"는 뇌 세포, 바람직하게는 뉴런을 뇌졸중 동안 및 뇌졸중 후에 뇌졸중에 의해 야기되는 영구적 손상으로부터 보호하는 것을 의미한다.

"뇌졸중"은 뇌순환 장애로부터 생기는 뇌 기능 이상을 의미한다.

"AMPK 저해제"는 문헌[Witters, etal., Journal of Biological Chemistry, 267, pp. 2864-2867 (1992)]에 기술되어 있는 방법으로 측정할 경우 AMPK를 저해하는 화합물을 의미한다.

바람직하게는, AMPK 저해제는 펩티드 또는 기타 생물학적 (또는 생물학적으로 유래된) 물질 이외의 화합물로부터 선택되며, 작은 분자이다.

본 발명의 조성물은 인간 및 기타 동물에게의 투여를 위하여 단위 투여 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 살균 비경구 용액 또는 현탁액, 경구 용액 또는 현탁액, 적당량의 화합물을 함유하는 수중유 및 유중수 에멀젼, 좌약제 및 유체 현탁액 또는 용액 형태로 제시될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적 희석제" 및 "약학적 담체"라는 용어는 동일한 의미를 갖는다. 경구 투여에 있어서, 고체 또는 유체 단위 투여 형태가 제조될 수 있다. 고체 조성물, 예를 들어 정제의 제조에 있어서, 화합물은 약학적 희석제 또는 담체로서 통상적인 성분, 예를 들어, 활석, 스테아르산마그네슘, 인산제2칼슘, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 황산칼슘, 전분, 락토스, 아라비아 고무, 메틸셀룰로오스 및 기능적 유사 물질과 혼합될 수 있다. 캡슐은 화합물을 불활성 약학적 담체와 혼합하고 이 혼합물을 적절한 크기의 경질 젤라틴 캡슐 내로 충전시킴으로써 제조된다. 연질 젤라틴 캡슐은 화합물의 슬러리를 허용가능한 식물유, 경 액체 바셀린 또는 기타 불활성 오일을 이용하여 기계적 캡슐화함으로써 제조한다.

유체 단위 투여 형태 또는 경구 투여 형태, 예를 들어, 시럽, 엘릭시르제 및 현탁액이 제조될 수 있다. 상기 형태는 수성 비히클 중에 당, 방향족 착향제 및 보존제와 함께 용해되어 시럽을 형성할 수 있다. 현탁액은 현탁제, 예를 들어 아라비아 고무, 트래거캔쓰, 메틸셀룰로오스 등의 도움으로 수성 비히클을 이용하여 제조할 수 있다.

비경구 투여에 있어서, 유체 단위 투여 형태는 화합물 및 살균 비히클을 이용하여 제조될 수 있다. 용액의 제조에 있어서 화합물은 주사용 물에 용해되며 여과 살균된 후 적합한 바이알 또는 앰퓰 내로 충전되고 밀봉될 수 있다. 아쥬반트, 예를 들어 국소 마취제, 보존제 및 완충제가 비히클에 용해될 수 있다. 조성물은 바이알 내로의 충전 후 냉동되고 진공 하에 물이 제거될 수 있다. 이어서 냉동 건조 분말은 바이알에서 스케일링하고 (scale) 사용 이전에 재구성될 수 있다.

대상은 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간이다.

치료법의 용량 및 지속 기간은 (1) 대상의 연령, 체중 및 기관의 기능 (예를 들어, 간 및 신장의 기능); (2) 치료할 질환의 진행 과정의 성질 및 정도와, 취해지는 임의의 기존의 상당한 동반 이환율 (co-morbidity) 및 수반되는 투약, 및 (3) 약물 관련 파라미터, 예를 들어, 투여 경로, 치유를 초래하는 데 필요한 투여의 빈도 및 지속 기간, 및 약물의 치료 지수를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 용량은 표적 부위에서 대략 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml의 유효 농도를 달성하는 목적에서 1 ng/ml 내지 100 ng/ml의 혈청 중 수준을 성취하도록 선택된다.

이상적으로는, 본 화합물은 가능한 한 뇌졸중의 발병 이후에 투여된다.

본 발명 이전에는, 뇌 상해에 응답하는 뉴런 대사 작용의 역할이 알려져 있지 않았다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 지금에 와서야 본 발명에서 pAMPK가 생쥐에 있어서 국소적 재관류 모델에서 허혈성 뇌졸중 후에 상승된다는 것이 알려졌다. AMPK는 허혈성 외상 90분 이내에 상승되며, 초기 재관류 동안 4배 증가한다. 또한 본 발명에서는, AMPK 저해제의 투여가 AMPK의 활성화를 감소시킬 뿐만 아니라 (AMPK의 인산화 감소로 보여지는 바와 같음), 유의한 신경 보호도 제공한다는 것이 지금에 와서야 알려졌다. 또한, AMPK 활성제의 투여가 뇌졸중 손상을 악화시킬 수 있다는 것도 밝혀졌다.

이론에 구애되고자 함이 없이, AMPK는 생리학적 에너지 조절에서 주요한 역할을 하는 것 외에도, 허혈성 스트레스 후의 세포 생존에 광범위한 영향을 미치는 것으로 생각된다. 허혈성 스트레스 동안 에너지 수요가 높지만, 에너지 공급은 기질 (산소 및 글루코스)의 결여로 인하여 낮다. 세포의 에너지 지각 및 AMPK 활성화를 간섭함으로써 세포의 허혈 역치 (threshold)는 증대되어, 세포는 에너지 결핍 상태에서 생존하지만 에너지 생산이 회복될 때까지 휴지 상태로 생존할 수 있다. 합성 FAS 저해제/CPT-1 자극제, 예를 들어 C75를 이용한 대사 경로의 조정은 뉴런의 대사 작용을 변경하고 양의 에너지 밸런스를 생성할 수 있다. C75는 피질 배양물과 시상 하부에서 생체 내에서 AMPK를 저해하는데, 이는 AMPK가 뉴런 에너지 밸런스에 응답성임을 나타내는 것이다. C75 투여는 배양된 뉴런에서 뉴런의 ATP 수준을 지속적으로 증가시킨다. 허혈 상태 하에서 계속된 ATP의 고갈은 에너지 복구 경로를 능가하여, 아폽토시스 (apoptosis)의 에너지 소비 과정에 의해 세포가 사망할 수 없게 되어, 세포가 괴사성 세포사로 방향을 돌리게 된다. 따라서, ATP 수준의 감지는 허혈에의 뉴런 응답에서 중요할 수 있으며 AMPK 저해제는 ATP 및 뉴런일 수도 있다.

AMPK 활성화는 대뇌 허혈 후 일어나며, 이러한 환경 (setting)에서 그의 활성화는 뉴런 생존에 유해하다. AMPK는 뉴런에 국소화되며, 허혈 후 뇌에서 (신경교 국소화와는 대조적으로) 이러한 패턴의 분포가 유지되었다. AMPK는 생체 내에서 혈관을 폐쇄한 지 90분 이내에, 그리고 시험관 내에서 산소 글루코스 결핍 (oxygen glucose deprivation, OGD) 후 2시간 이내에 급속하게 활성화되었다. AMPK의 수준 증가는 뇌 전반에 걸쳐, 반영 (penumbral) 부위와, 허혈성 상해와 동떨어진 부위 둘 모두에서 보였다. 처음에, 이 증가는 뇌가 에너지 수요 증가 시점에서 ATP 생성을 증가시킬 수 있는 기작으로서, 뉴런의 스트레스에 대한 적응성 응답을 나타내는 것으로 생각되었다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들의 약리학적 연구에 의하면, 뉴런 허혈의 상태 하에서 AMPK 활성화를 저해하면 뇌졸중 손상이 감소된다는 것이 명백하게 입증되었다. AMPK 저해제 화합물 C, 또는 FAS 저해제 C75의 투여는 본 발명자들의 모델에서 유의한 신경 보호를 제공하였다. 이와는 대조적으로, AMPK 활성제 AICAR의 투여는 뇌졸중 손상을 악화시켰다. 마지막으로, nNOS 결함성 생쥐는 뇌졸중 후에 보다 적은 경색 및 보다 낮은 pAMPK 수준을 가졌으며, 반면, PARP-1에 있어서 결함성인 생쥐는 보다 적은 경색에도 불구하고 AMPK 수준이 WT와 유사하였다. 이는 nNOS 및 ONOO 경로가 뉴런 스트레스 상태 하에서 생체 내에서 AMPK의 중요한 활성자라는 것을 시사한다. 뉴런 AMPK의 활성화는 허혈 및 재관류 상해의 생체 내 모델에서 유해하며 AMPK의 뇌졸중-유도된 인산화의 방지는 신경 보호 효과를 갖는다.

허혈 세포에서 형성되는 하나의 잘 특성화된 세포 독소는 퍼옥시니트라이트 (ONOO)이며, ONOO는 수퍼옥사이드 및 NO가 거의 등몰량으로 생성될 경우 형성되는 강력한 산화 부산물이다. 미토콘드리아 호흡 사슬로부터 수퍼옥사이드가 일정하게 누출되는데, 이는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (SOD)와 같은, 내인성 산화방지제에 의해 불활성화된다. NO 생성 증가 조건 하에서, NO는 수퍼옥사이드에 대하여 SOD와 더 많이 경쟁 (out-compete)하여 ONOO 형성으로 이어질 수 있다. ONOO는 효소를 비가역적으로 저해하며, DNA를 손상시키며, 에너지 소비적인 NAD-고갈 DNA 복구 효소 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제 (PARP-1)을 활성화시킨다. 솟과 내피 세포의 화학적 합성 ONOO에의 노출은 AMP 농도의 변화 없이 AMPK를 활성화시켰으며, 이 효과는 저산소/재산소화에서 반복된다. 이러한 효과는 아데노바이러스의 SOD 과발현 또는 NOS 저해제의 투여에 의해 개선되었는데, 이는 ONOO 매개 AMPK 활성화가 NO에 의해 매개된다는 것을 시사하는 것이다. 최근에는, 당뇨병 치료제인 메트포르민 (Metformin)도 유사한 기작에 의해 AMP 수준과 독립적으로 AMPK를 활성화시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이는 NO/ONOO 경로가 AMPK 활성화에 있어서 중요한 자극일 수 있음을 시사한다. nNOS-/- 생쥐에 있어서의 본 발명자들의 연구는 상기 가설을 지지하는데, 이는 상기 동물에서 보여지는 NO 및 ONOO 형성의 감소가 뇌졸중-유발된 AMPK 활성화의 극적인 감소에 이르렀기 때문이다. 그러나, 수컷 nNOS 생쥐는 그의 WT 상대물보다 유의하게 더 적은 뇌졸중을 갖는다. 허혈성 손상을 감소시키는 임의의 조작이 뇌에 두어지는 "보다 온화한" 허혈성 스트레스로 인한 pAMPK 활성화의 감소로 이어지는 것이 가능하다. AMPK의 상승은 허혈성 손상 증가의 마커를 단순히 나타낼 수 있다. 본 발명자들은 PARP-1의 표적화된 결실을 갖는 수컷 생쥐에서 pAMPK 수준을 조사함으로써 이러한 의문점에 대처하였다. 놀랍게도, PARP-1 무효(null) 생쥐는 유의하게 더 적은 (>50%) 경색에도 불구하고 그의 WT에 비하여 뇌졸중-유도된 pAMPK가 등가로 상승하였다. 이는, pAMPK 상승이 단순히 허혈성 손상 증가의 마커가 아니라 ONOO 및 nNOS와 역학적으로 관련될 수 있음을 시사하는 것이다.

생체 내에서의 허혈성 외상 후의 세포 생존에 대한 AMPK 활성화의 중대함은 이전에는 알려져 있지 않았었다. 대부분의 연구는 흔히 형질 전환 세포주를 이용하여 시험관 내에서 행해졌다. AICAR을 이용한 AMPK의 활성화는 배양된 해마회 뉴런에 있어서 에너지 이용도 감소 조건 (글루코스 결핍 및 글루타메이트 흥분 독성) 하에서 생존성을 증강시켰다. 그러나, 다수의 연구자들은, c-jun-N-말단 키나아제 (JNK), c-myc 및 캅사아제 (capsase) 3의 자극을 통한 간세포, 신경아세포종 세포, 및 생쥐 MMIN 세포를 비롯한 다수의 세포주에 대한 AICAR의 프로-아폽토시스 효과를 지금에 와서야 증거로 입증하였다. 이와는 대조적으로, AICAR은 허혈성 심근 세포에서 보호성을 가지며 세라마이드-유도된 성상 세포 아폽토시스를 방지하는데, 이는 AICAR의 효과가 사용되는 모델 시스템과 세포 유형 둘 모두에 의존적임을 시사하는 것이다. AICAR은 세포 내로 흡수되며 일인산화 뉴클레오티드, ZMP로서 세포질에 축적되는데, 상기 ZMP는 AMP의 효과를 모방하며 세포의 ATP 수준을 변경함이 없이 AMPK를 활성화시킨다. 그러나, AICAR은 비특이적이며, 뉴클레오시드 수송에 대한 경쟁을 통하여 공지된 혈관 확장제인 아데노신의 유도를 비롯하여 세포에서 다수의 다른 영향을 미친다. AICAR은 저빌쥐에서 전뇌 허혈 후 해마에서 지연된 세포사를 감소시켰지만, 이 경우 아데노신 활성제인 AICAR이 이용되었다. 또한, 허혈성 외상 모델은 본 발명자들의 허혈-재관류 상해와는 매우 다르다.

본 발명자들의 데이터에 의하면, AMPK의 활성화가 뇌졸중에서 일어나며, 이 응답은, AICAR에 의해 증대될 때 조직 손상을 악화시킨다는 것이 입증되었다. 생체 내 연구에서의 AICAR의 사용에 대한 제한은 본 발명자들의 생리학적 데이터에 의해 입증되었는데, 상기 데이터는 AICAR-처리 생쥐에서 MAP의 일시적인, 그러나 유의한 강하를 나타내었다. MAP의 감소는 경색 주변 부위의 관류의 감소에 의해 AMPK에 대한 영향과는 독립적으로 경색을 증가시킬 수 있다. 순간적인 강하, CBF의 유지 (LDF (laser doppler flow)를 통하여), 및 AMPK의 생리학적 저해에서 보여지는 극적인 신경 보호를 감안할 때, 이는 일차적인 설명이 될 것 같지 않다. 또한, 최근의 데이터는 AMPK 활성화는 허혈성 심장에도 유해한 것임을 시사하고 있는데, 이는 H₂O₂에 의해 유발되는 심장 상해가 CNS에서의 본 발명자들의 발견과 유사하게 화합물 C를 이용한 치료에 의해 부분적으로 개선되었기 때문이다.

AMPK의 활성화가 저산소증에 응답하여 몇몇 주변 조직에서 유익할 수 있는 반면, CNS에서의 상황은 다를 수도 있다. 예를 들어, 저산소증 내피 세포에 있어서, eNOS는 AMPK에 의한 직접적 인산화에 의해 활성화되어 혈관 긴장도를 아마도 변경시켜 혈류량을 증강시킨다. 그러나, 뇌졸중에서, AMPK의 아마도 이러한 유익한 효과는 제한되게 유용할 수 있는데, 이는 뇌혈류량 (cerebral blood flow, CBF)이 급성 폐쇄 동안 (필라멘트에 의한 것임) 심하게 감소되어, eNOS-유발되는 혈관 확장이 무익한 에너지 소비 과정이 되게 하기 때문이다. 또한, 저산소 상태 하에서는 (eNOS를 통한) NO 생성 증강이 ONOO의 수준 증가에 이르러 자유 라디칼 상해를 유포시킬 수 있다.

생체 내 및 시험관 내 시스템 둘 모두의 조사는 AMPK 활성화의 생리학적 결과의 측정에 결정적이다. 시험관 내에서 뉴런에서의 과도한 NO 노출의 심한 ATP-고갈 효과는 미토콘드리아 호흡에 대한 저해 효과와, 당 분해 저해 둘 모두에 의해 매개되는데, 이는 산화에 의한, 그리고 당 분해에 의한 에너지 생성 둘 모두의 감소에 이른다. 그러나, 성상 세포에 있어서, 호흡의 NO-유도된 저해는 성상 세포의 당 분해의 증가에 이르며 아폽토시스는 감소된다. 성상 세포의 당 분해의 이러한 신속한 NO-의존성 활성화는 후속적인 포스포프룩토-2-키나아제 (PFK-2)의 활성화와 함께 AMPK 활성화에 의해 매개된다. 따라서 성상 세포는 당 분해에 있어서의 보상 증가로 스트레스 및 저산소증에 응답하여, 에너지를 제공하고 세포사를 방지한다. 성상 세포를 AMPK siRNA로 트랜스펙션시키면 성상 세포는 NO, 및 증가된 수준의 아폽토시스에 응답하여 당 분해를 증가시킬 수 없게 된다. 성상 세포와는 달리 뉴런은 당 분해를 증강시키는 효소 기구가 결여되어 있는데, 이는 뉴런이 매우 낮은 수준의 PFK2와, 지방산 산화에 대한 제한된 역량을 갖기 때문이다. 따라서 뇌졸중과 같은 병리학적 상태 하에서의 AMPK의 활성화는 뉴런의 생존성을 증강시킬 수 없다.

국소 뇌졸중이 뇌의 별개의 영역을 포함하지만, 뇌혈류량 (CBF) 및 대사적 수요에서의 변화를 비롯한 보상 기작이 허혈 "중심 부위 (core)"와는 동떨어진 영역에서 일어난다. 예를 들어, 뇌 부종이 큰 일측성 초점성 병변 후에 반대쪽의 "영향을 받지 않은" 반구에서 보여지는데, 이는 뇌 수분 함량이 원래의 상해로부터 먼 영역에서 달라질 수 있음을 시시하는 것이다. 비-허혈성 뇌와의 통신이 경뇌량 또는 뇌반구내 "해리 현상"을 통하여 일어나, CBF, 전기 생리학적 활성, 및 대사 작용에서의 장애에 이를 수 있다. AMPK 활성화에 있어서의 신호는 pAMPK 수준에서의 왕성한 반대쪽 상승에 의해 시사되는 바와 같이 뇌 전반에 걸쳐 전체적으로 전해지는 것 같다.

AMPK의 활성화는 이미 절충된 뉴런에서 스트레스를 증가시킨다. 세포의 에너지 지각을 간섭하는 것은 허혈 역치를 증대시켜, 세포가 에너지 결핍 상태에서 생존은 하지만 에너지 생산이 복구될 때까지는 휴지 상태로 생존하게 할 수 있다. AMPK 활성화의 감소는 허혈 캐스케이드 (cascade) 초기에 "뉴런 동면"을 장려하여, 완전한 뉴런의 에너지 상실 (failure)을 방지하고, 뉴런의 생육성을 혈액 및 영양소 공급이 복구될 때까지 연장시킬 수 있다. 허혈성 뉴런에서의 에너지 상의 동력학적 특성을 개선시켜 임상적 뇌졸중에서 "치료 창"의 연장 가능성을 허용한다. 뉴런의 대사 경로가 신경 보호에 있어서의 중요하면서도 신규한 표적을 나타낼 수 있다는 제안은 본 발명자들의 발견에 의해 입증된다.

본 발명을 하기 비제한적 실시예로 추가로 설명한다.

실험 동물

하기 실험은 Animal Care and Use Committee of the Johns Hopkins University에 의해 승인된 프로토콜 하에서 그리고 연구에 있어서 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 지침에 따라 행하였다.

허혈 모델

각각 문헌 [McCullough, et al. , Stroke, 32, 796-802 (2001)] 및 문헌[McCullough, et al., J. Neuroscience, 24, pp. 257-268 (2004)]에 기술되어 있는 바와 같이, 수컷 C57B6 생쥐 (Charles River) 또는 수컷 쥐에 있어서 할로탄 마취제 하에서 120분간의 가역성의 우측 중대뇌 동맥의 폐쇄 (middle cerebral artery occlusion, MCAO), 이어서 다양한 시간 동안의 재관류에 의해 대뇌 허혈을 유발하였다. 허혈중 (intra-ischemic) 및 재관류 22시간 후의 신경학적 결손 (neurological deficit, NDS)은 하기와 같이 스코어링하였다: 0: 결손이 전혀 없음; 1: 꼬리를 잡을 때 동측으로 도는 몸통 및 앞다리의 허약함; 2: 영향을 받은 쪽으로 돔; 3: 영향을 받은 쪽에의 웨이트 (weight)를 견딜 수 없음; 및 4: 자발적인 운동 활동 또는 통 (barrel) 굴림이 전혀 없음. 결손이 없는 모든 동물은 본 연구로부터 제외하였다. 말기 허혈에서, 동물은 간단하게 재마취하고 재관류는 필라멘트 인발 (withdrawl)에 의해 개시하였다. 샴 (sham) 동물은 등가의 외과적 준비에 처하였지만, 봉합은 내부 경동맥 내로는 전진하지 않았다. 약리학적 신경 보호 연구에 있어서, 생쥐는 재관류한지 22시간 후에 생존하였으며, 이 시점에서 행동 스코어링을 행하였다. 이어서 TTC 조직학을 이용하여 병리학적으로 조사하기 위하여 뇌를 수확하였다 (조직 병리학적 특성 절을 참조). 개별적인 동물 코호트 (cohort)에 있어서, 생리학적 측정, 대퇴골 동맥 혈압 및 피질 관류 (레이저 도플러 (Doppler) 혈류 측정법)를 상기에 참조된 2001년의 McCullough의 논문에 기술되어 있는 바와 같이 초기 재관류 및 MCAO 전반에 걸쳐 평가하였다. 추가의 동물을 약리학적 또는 비히클 처리 후 허혈 또는 샴 수술에 노출시키고 웨스턴 블롯 분석을 위하여 4시간 또는 24시간에 희생시켰다. 수컷 nNOS 및 PARP-1 결함성 생쥐 (문헌[Huang, et al. , Science, 265,1883-1885 (1994)]; 문헌[Eliasson, et al., Nat. Med, 3, 1089-1095 (1997)] 참조)를 2시간의 우측 MCAO 또는 샴 수술에 처하고 추가의 WT 코호트와 비교하였다 (nNOS-/-의 경우 C57-BL6, 및 PARP-/-의 경우 SVEV).

말단의 조직 병리학적 특성

경색의 볼륨은 5개의 2 mm 슬라이스 (slice)에서의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염색으로 분석하였다. 경색의 볼륨은, 이전에 문헌[McCullough, et al., J. Neuroscience 23, pp. 8701-8705 (2003)]에 기술되어 있는 바와 같이, 비디오 현미경 검사 및 이미지 분석 (Inquiry 3, Loats Associates)으로 측정하였다.

웨스턴 블롯 분석

생쥐 및 쥐의 뇌졸중 및 샴의 뇌의 샘플은 두개골로부터의 뇌의 신속한 제거, 소뇌의 절제, 이어서 우측 (R) 및 좌측 (L) 반구로의 즉각적인 해부에 의해 수득하였다. 샘플을 액체 질소에서 순간 (flash) 냉동시켰다. 쥐로부터의 샘플을 반구 둘 모두에 있어서 중심 부위 및 주변 부위 (core and penumbral regions)로 추가로 서브-해부하였다. 샘플을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 각각의 샘플을 200 ㎕의 용해 완충제 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 250 mM의 수크로스, 5 mM의 파이로인산나트륨, 50 mM NaF, 1 mM EDTA,1mM EGTA, 1mM DTT, 0.5 mM PMSF, 0.1 mM의 벤즈아미딘, 50 ㎍/ml의 류펩틴 (leupeptin), 50 ㎍/ml의 대두 트립신 저 해제)에서 균질화하였다. SDS 세제를 0.2%의 최종 농도로 첨가하고, 용해물을 5분 동안 비등시켰다. 상청액을 수확한 후, 단백질 농도를 BCA 키트 (BioRad)를 사용하여 측정하였다. 4-15%의 구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 레인 당 40 ㎍의 단백질을 로딩하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼다. 항원 탐지에 있어서 블롯을 연속적으로 프로빙하고, 스트리핑하고 재프로빙하였다.

AMPKα의 인산화는 항-포스포-AMPKa (α1 및 α2 Thr) 항체 (1:1000, Cell Signaling)를 사용하여 측정하였다. ACC (1:500), p-ACC (1:1000), pAkt (1:500), 및 Akt (1:500) 항체는 Upstate (미국 뉴욕주 레이크 플라시드 소재)로부터 획득하였다. 항-AMPKα 항체 (항-α1 및 α2, 1:1000; Cell Signaling), hsp-70 (1:1000; Santa Cruz), 및 β-액틴 (1:5000; Sigma)을 로딩 대조로 사용하였다. 모든 블롯을 4℃에서 5% BSA 및 0.1%의 트리톤-X-100을 포함하는 TBS 완충제 중 일차 항체에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이차 항체 (염소 항-토끼 IgG, Chemicon)를 1:5,000으로 희석시키고, ECL (피코 (pico)) 검출 키트를 신호 검출에 사용하였다.

면역 조직 화학적 특성

부유 뇌 박편을 문헌[Kim, et al., J. Biol. Chem., 279, 19970-19976 (2004)]에 기술되어 있는 것을 변형시켜 제조하였다. 자유 부유 박편을 5%의 염소 혈청, 1 mg/ml BSA, 0.05%의 트리톤-X100, 및 1 mM NaF를 포함하는 PBS에서 실온에서 1시간 동안 차단시키고, 이어서 1%의 염소 혈청, 1 mg/ml BSA, 0.05%의 트리톤-X-100, 1 mM NaF를 함유하는 PBS 중 항-포스포-AMPKα 항체 (1:100), GFAP (1:1000, DAKO; 성상 세포의 경우), NeuN (Chemicon 1:100; 성숙 뉴런에 있어서의 마커) 또는 VWF (Santa Cruz; 내피 세포의 경우 1:400)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 1% 염소 혈청을 함유하는 PBS (Texas Red, FITC)에서 이차 항체 (1:200; Vector Laboratories; 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)를 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 신호는 Zeiss 이미지 획득 소프트웨어 (Zeiss LSM 510)를 사용하여 면역형광 공초점 현미경을 이용하여 가시화하였다.

해마회 슬라이스 배양 및 OGD

해마회 오르가노타이픽 (organotypic) 슬라이스 배양물은 문헌[McCullough, et al., Stroke, 32, 796-802 (2001)]에 기술된 바와 같이 제조하였다. 350 미크론의 관상 (coronal) 반구 슬라이스를 조직 초퍼 (chopper) (McILwain 조직 초퍼; Vibratome Company, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 사용하여 생후 7일의 쥐 새끼로부터 얻었다. 해마회 슬라이스를 6웰 플레이트 중 30 mm의 Millicell 투과 막 인서트 (0.4 ㎛; Millipore, 미국 매사추세츠주 베드포스 소재) 상으로 옮겼는데, 각각의 웰은 1 ml의 배지 (50% MEM, 25% HBSS, 25%의 가열 불활성화 말 혈청, 6.5 mg/ml의 D-글루코스, 5 U/ml의 페니실린 G, 및 5 ㎍/ml의 스트렙토마이신 술페이트)를 포함한다. 배양물을 가습 인큐베이터에서 5% CO₂ 하에 37℃에서 13일 동안 유지하였다. 완전 배지 교환을 주 2회 수행하였다. 시험관 내에서 13일에 산소 결핍 유도를 수행하였다. 슬라이스 배양물을 가온 BSS (mM 단위로 125 NaCl, 5 KCl, 1.2 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 1.8 CaCl₂, 0.9 MgCl₂, 10 HEPES, 및 10 글루코스)로 2회 헹구고, 인큐베이터로 도로 넣어 30분 동안 평형화하였다. 슬라이스 배양물을 가온 탈산소화 무-글루코스 BSS로 2회 헹구고, 기밀 챔버로 옮기고, 산소 결핍 가스 (5% C0₂, 85% N₂, 및 10% H₂)로 플러시하고 (flushed), 37℃에서 60분 동안 유지하였다. 대조를 BSS로 헹구고 정상적 통기 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 두었다. 산소 결핍 기간은 배양물을 신선 배지 (50% MEM, 25% HBSS, 25%의 가열 불활성화 말 혈청, 6.5 mg/ml의 D-글루코스, 5 U/ml의 페니실린 G, 및 5 ㎍/ml의 스트렙토마이신 술페이트)로 되돌림으로써 종결시키고, 샘플을 (상기와 같이) 2, 4, 6 및 24시간에서의 웨스턴 분석을 위하여 제조하였다. 대조 및 OGD-처리 슬라이스를 각각의 실험에 포함시켰는데, 각각의 실험 군에 있어서 각각의 실험은 조건 당 삼중체의 웰 또는 15개의 슬라이스를 포함한다.

통계학적 분석

모든 데이터는 평균±SEM으로 표현한다. 생리학적 변수 및 조직학적 특성을 사후 검정 뉴만-켈스법 (post-hoc Newman-Keuls)을 이용하여 일방 (1-way) ANOVA로 분석하여 다수의 비교에 대하여 보정하였다. 허혈 후의 신경학적 스코어는 만-휘트니 U-검정 (Mann-Whitney U test)으로 분석하였다. 값들은 *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

AMPK 는 허혈 후 뉴런에서 발현된다

2시간의 MCAO, 이어서 2시간의 재관류에 처한 생쥐로부터 수득되는 뇌 조직 박편은 AMPK 및 pAMPK 둘 모두에 대하여 두드러진 뉴런 염색을 나타내었다 (도 1, n=5마리/군). 이들은 또한 NeuN (성숙 뉴런의 경우), GFAP (성상 세포의 경우)로 염색되었다. 공초점 현미경 검사에 의하면 NeuN 및 AMPK/pAMPK의 공동-국소화 (co-localization)가 입증되었으며, 성상 세포에서는 공동-국소화가 존재하지 않았다.

공초점 현미경 검사에 의하면 AMPK (도 1A-C) 및 pAMPK (도 D-F)는, 성숙 뉴런의 마커인 NeuN을 사용한 이중 표지화 면역 형광법에 의해 나타나는 바와 같이, 중뇌 동맥 (MCA) 분포에서 피질 뉴런에 국소화된다는 것이 입증되었다. NeuN 및 pAMPK에 대하여 면역 염색되는 보다 높은 배율의 피질 뉴런 (도 1 G-I)은 α-이소폼 (isoform)에 대하여 핵 및 세포질 면역 염색을 나타낸다. AMPK는 온전한 뇌의 비자극 성상 세포에서 단지 최소로 발현될 수 있지만, 이전의 연구에 의하면 배양된 성상 세포에서 AMPK 면역반응성인 것으로 밝혀졌다. 생체 내에서 AMPK 및 pAMPK의 국소화를 명백하게 하기 위하여, 본 발명자들은 정상적인 비-허혈 조직과, 경색 후 4시간 및 24시간에서 (재관류 2시간 또는 22시간에서) 수확한 뇌 둘 모두를 조사하여 AMPK가 뇌졸중 후 성상 세포에서 발현되는지를 결정하였다. MCAO 4시간 후 GFAP와 AMPK 또는 pAMPK와의 공동-국소화는 단지 최소였다 (각각 도 1 J-L 및 도 1 M-O). 4시간 조직과 유사하게, AMPK 또는 pAMPK의 GFAP와의 공동-국소화는 뇌졸중 24시간 후 피질에서 전혀 보이지 않았다 (도 1 P-R). 또한, 내피 마커인 VWF (von Willebrand factor)와의 AMPK 또는 pAMPK의 공동-표지화는 온전하거나 허혈성인 뇌에서 전혀 보이지 않았다 (데이터는 예시되어 있지 않음). 이러한 패 턴의 pAMPK 면역국소화법 (immunolocalization)이 국지적으로 유지되는지를 결정하기 위하여, pAMPK 및 NeuN의 이중 표지의 저전력 이미지를 경색 후 24시간에서 (재관류 22시간) 얻었다 (도 2). 피질 (도 2A-C) 및 해마 (도 2D-F) 둘 모두에서 유사한 수준의 염색이 보였으며, 상기 부위 둘 모두에서 pAMPK가 NeuN과 두드러지게 공동 표지되었다. 일차 항체의 첨가 없이는 대조 박편에서 신호가 전혀 보이지 않았다 (데이터는 예시되어 있지 않음). 이러한 결과는 AMPK가 허혈성 및 비허혈성 뇌 둘 모두에서 뉴런에서 주로 발현된다는 것을 나타내는데, 여기서, AMPK는 세포-자율적 방식으로 뉴런 에너지 밸런스에 영향을 미치는 기능을 할 수 있다.

AMPK 는 MCAO 후에 증가된다

수컷 야생형 (WT) C57B16 생쥐를 다양한 재관류 시간으로 2시간의 우측 MCAO 또는 샴 수술에 처하였다. 생리학적 파라미터, 예를 들어 온도는 일정하게 유지하였다. C75 및 화합물 C (Cpd C) 처리 동물에서 개개의 비히클과 비교한 각각의 처리 군 사이의 생리학적 측정치에서 유의한 차이는 전혀 없었다. MAP 및 LDF는 2시간의 허혈에 걸쳐 평균하여 나타낸 것이다. AICAR 처리 동물은 15분에서 MAP가 유의하게 감소되었으며 (p < 0.05), 2시간의 모니터링에 걸쳐 전체적인 차이는 없었다. 허혈중 LDF의 감소는 비히클 및 AICAR 동물에서 등가였지만, 재관류 (n=4/군) 30분에서 LDF가 유의하게 감소하였다 (p < 0.05)

각각의 실험 군에서의 허혈중 생리학적 변수 및 레이저 도플러 혈류량 (LDF) 값

파라 미터	비히클	화합물 C	비히클	C75	비히클	AICAR
Ph	7.37±0.05	7.36±0.07	7.30±0.10	7.34±0.08	7.37±0.05	7.33±0.11
PCO2	45.2±2.8	42.1±3.1	47.2±4.7	47±7.1	42±3.6	39.7±4.9
PO2	140±9.8	144.6±14.3	144.7±11.6	135±14.2	147±15.9	128±15.2
MAP	80.7±4.8	82.2±5.9	81.5±3.9	79.1±6.5	84±7.1@15 81.6±4.4 (모두)	69±12.4@15 77.7±7.3 (모두)
Hg	13.6±1.9	12.7±1.3	13.8±1.8	12.9±0.5	13.8±2.3	13.4±0.9
HCO3	23.5±1.1	23.1±0.08	22.6±2.4	22.8±1.2	23.6±2.6	22.9±2.3
LDF (%BL)	9.8±1	10.6±0.9	10±1.3	10.6±0.88	11.3±.8 RP 98±5.3	11.1±1.2 RP 83±10.8

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, pAMPK (Thr 인산화 부위에 대한 panα 서브유닛 항체에 의해 검출되는 바와 같음 (문헌[Hawley, et al.,J Biol Chem 271, 27879-27887 (1996)] 참조)를 허혈 이후 90분만큼 초기에 허혈성 뇌 (뇌졸중)에서 평가하고 이를 샴 수술 (Sham)을 받은 동물과 비교하였다 (허혈 동물의 경우 시점 당 n=6마리; 샴 수술된 대조의 경우 시점 당 4마리). pAMPK 수준은 우측 허혈 반구 (R) 내에서 그리고 좌측의 비허혈 반구 (L) 상에서 상승하였으며, 허혈성 우측 반구 및 비허혈성 좌측 반구 둘 모두에서 24시간 동안 (재관류 22시간) 상승된 채 남아있었다. 이와는 대조적으로, 샴 뇌에서의 pAMPK의 수준은 24시간의 기간에 걸쳐 안정한 채 남아있었다. 총 AMPK 수준은 최소의 변화를 나타내었다. hsp-70의 적절한 상승은, 이것이 보다 나중의 시점 (즉, 6시간, 12시간 및 24시간)에서 가장 주목할 만하였지만, 허혈 반구에서 보였다. β-액틴이 로딩 대조로서 역할을 하였다. pAMPK 수준에서의 전체적인 증가는 AMPK가 허혈 부위에서뿐만 아니라 반대쪽의 비허혈면에서도 대사적 혼란 및 보상 응답에 대하여 이차적으로 활성화된다는 것을 시사하고 있다.

AMPK 는 시험관 내에서 OGD 후 활성화된다

생체 내 발견 외에도, 본 발명자들은 AMPK가 시험관 내 뇌졸중 모델인 산소-글루코스 결핍 (OGD) 후에 해마회 슬라이스 배양물에서 시험관 내에서 활성화되는지를 또한 측정하였다. 본 발명자들은 정상 산소성 (normoxic) 정상 혈당성 (normoglycemic) 대조 배양물에 비하여 OGD 2시간 후에 pAMPK 수준이 강력하게 증가한다는 것을 밝혀내었다 (도 4A). 본 발명자들의 생체 내 연구에서 보여지는 바와 같이, pAMPK에 있어서의 이러한 증가는 6시간에서 지속되었지만 24시간까지는 정상화되었다. AMPK 활성화의 하류 표적은 아세틸-CoA 카르복실라아제 (ACC)인데, 이는 지방산의 드 노보 합성에서 속도 결정 (pace-setting) 효소이며; AMPK는, 활성화될 경우 ACC의 인산화를 매개하며, 따라서 ACC를 불활성화시키고 에너지 결핍 시점에서 지방산 합성의 동화 작용 과정을 한정한다. OGD 이후 4시간에서의 슬라이스 샘플의 평가에 의하면 인산화 또는 불활성화 아세틸-CoA 카르복실라아제 (pACC)의 수준이 증가됨이 입증되었는데, 이는 관찰된 pAMPK의 증가가 생리학적으로 관련있다는 생각을 지지하는 것이다. AMPK 및 ACC의 총 수준은 OGD 또는 대조 슬라이스 둘 모두에서 모든 조사된 시점에서 최소로 변화하였다.

AMPK 상승이 허혈성 반영에서 보여진다

뇌졸중에서의 대사 혼란이 경색의 괴사 중심 부위에서 보다 심할 수 있으며, 반면, 프로-생존 (pro-survival) 경로는 가장자리에서 기능하는 뇌를 구하기 위한 시도로 반영에서 활성화될 수 있다고 가정하여, 본 발명자들은 뇌졸중 6시간 후에 쥐 뇌로부터 (n=6마리/군) 웨스턴 블롯 분석을 위하여 허혈성 우측 반구 (IH, 허혈성 반구) 또는 비허혈성 좌측 반구 (NIH; 비허혈성 반구) 둘 모두로부터 중심 부위 (CC) 및 반영 (PC) 조직을 절개해 냈다 (도 5). 쥐를 이 실험에 사용하였는데, 이는 중심 부위 및 반영의 절개가 보다 큰 쥐의 뇌를 사용하여 보다 신속하고 신뢰할 수 있게 행해지기 때문이며; 이는 또한 다른 종에서의 본 발명자들의 발견의 확인을 허용하였다. 허혈 부위 및 절개 부위는 24시간에서 TTC 염색법을 이용하여 가시화하였다 (도 5A). pAMPK 수준은, 샴 뇌의 어느 하나의 반구 (PC 및 CC)에서의 pAMPK 수준에 비하여, 피질 반영 비허혈성 반구 및 반대쪽의 비허혈성 반구 (각각 PC NIH 및 CC NIH)에서 극적으로 상승하였다 (도 5B). 허혈 중심 부위 (허혈성 반구의 CC)에서의 pAMPK의 수준은 다른 뇌 부위에서보다 낮았지만, 수술 샴 (샴 CC 및 PC)에 비해서는 상승하였다.

중심 부위에서의 AMPK의 보다 낮은 수준은 경색의 허혈 중심 부위에서 단백질 합성 및 에너지-의존성 인산화의 실패를 나타낸다는 것이 가능하다. 그러나, 열 충격 단백질 70 (문헌[Kury, et al. , Eur J Neurosci 19, 1708-1720 (2004)] 참조)에서의 기대되는 증가가 보였다. 대안적으로는, AMPK 활성화는 반영에서 보상 보호 경로를 나타낼 수 있다. pAMPK는, 이용가능한 에너지 공급을 증가시키는 전략으로서, 손상되었지만 생육가능하게 남아있는 뉴런에서 상향 조절될 수 있다. 반대쪽 AMPK에서의 상승은 상해 부위와 동떨어진 뉴런이 또한 신호를 받아 에너지 이용도를 증가시킬 수 있음을 시사한다. 따라서, AMPK 수준의 증가 및 그에 따른 활성의 증가는 적응성 내인성 신경 보호 경로를 나타낼 수 있다. 이러한 쟁점에 대처하기 위하여, 본 발명자들은 계속하여 AMPK 수준을 약리학적으로 조작하여 뇌졸중 결과에 대한 pAMPK 수준의 변화의 효과를 측정하였다.

화합물 C는 pAMPK 수준을 감소시키며 신경 보호성이다

본 허혈 모델에서의 AMPK 활성화의 기능적 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 문헌[J. Clin Invest 108, pp. 1167-1174 (2001)]에 기술되어 있는 약리학적 AMPK 저해제인 화합물 C로 처리한 생쥐에서 뇌졸중 결과의 영향을 탐구하였다. 뇌졸중 발병 (2시간의 MCAO를 22시간의 재관류와 함께) 시점에서 화합물 C (20 mg/kg, 복강내로 전달됨; n=14마리) 또는 비히클 (n=8마리)로 처리한 동물에서 뇌졸중 결과에 대한 영향을 측정하였다 (도 6). 화합물 C는 비히클 처리 동물에 비하여 총 경색 볼륨 (비허혈성 반구의 %로 측정하고, TTC를 사용한 부종에 대하여 보정)와, 선조 (striatal) (CP; 64±5.7 대 21±3.9; p>0.001) 및 피질 (CTX; 63±3.4 대 19.4±3.3; p<0.001) 경색 볼륨을 유의하게 감소시켰다 (도 6A). 24시간에서의 행동 장애의 중증도의 가소는 이러한 차이를 반영하는 것이었다 (비히클 3.3±0.3 대 화합물 C 1.9±2, p< 0.01). 허혈중 기간 동안 (비히클=9.8±0.54 대 화합물 C=10.6±0.9; 기준선의 %; p=n.s.), 또는 재관류 후 30분 동안 레이저 도플러에 의해 측정되는 바와 같이 상대적인 뇌혈류량 (CBF)에서는 차이가 전혀 없었는데, 이는 혈류량에서의 차이가 허혈성 손상에서의 차이를 설명할 수 없음을 시사하는 것이다. 생리학적 측정치에서는 처리 군 사이에서 전혀 보이지 않았는데 (표 1) 이는 뇌졸중 결과에 대한 상기 요인들의 등가의 기여를 입증하는 것이다.

2시간의 MCAO (n=6마리/군) 또는 샴 수술 (n=4마리/군)에 처해진 비히클 또는 화합물 C 처리 생쥐의 추가의 군을, AMPK 및 pAMPK의 수준의 측정을 위하여 경색 4시간 후 (도 6B) 또는 24시간 후 (도 6C)에 희생시켰다. 허혈성 (우측, R) 또는 비허혈성 (좌측, L) 반구 유래의 용해물을 뇌졸중 및 샴 수술 동물 둘 모두에서 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 경색 4시간 후 (재관류 2시간) 예기되는 pAMPK의 증가가 샴 동물 (레인 3 및 4)에 대하여 비히클 처리 동물 (도 6B, 레인 1 및 2)DPTJ 보였지만, pAMPK의 수준은 화합물 C 처리 동물 (레인 5 및 6)에서는 감소되었으며; 총 AMPK 수준은 변화하지 않았다. 화합물 C의 영향은 일시적이었으며; pAMPK 수준은 24시간까지는 비히클 처리 생쥐에서 보여지는 것과 유사하였다 (도 6C, 레인 1 및 2를 레인 5 및 6과 비교). 이러한 결과는 화합물 C를 이용한 AMPK의 저해가 신경 보호성이며, 이러한 신경 보호 효과는 pAMPK 수준의 감소와 상관 관계가 있음을 시사하는 것이다.

FAX 저해제 C75 에 의한 pAMPK 수준의 감소는 뇌졸중에서 신경 보호성이다.

본 발명자들은 FAS 저해제 C75 (20 mg/kg i. p. ) 또는 비히클 (RPMI)을 허혈 발병 직전에 투여하였다 (n=9마리/군). 이 용량은 시상 하부에서 C75 활성의 저해 및 섭식 행위에 대한 영향을 입증한 이전의 생체 내 데이터에 기초한 것이었다. 총 경색 볼륨 및 국부적 경색 볼륨의 유의한 감소가 C75-처리 군에서 보였다 (p<0.001). 행동에 대한 스코어에서의 개선이 나타났다 (비히클 3.2±0.05 대 C75 2.0±0.03, p<0.01). 화합물 C에서와 같이, LDF 또는 생리학적 변수에서의 차이는 전혀 보이지 않았다 (n=4마리). 2시간의 MCAO 및 재관류 (n=6마리/군) 또는 샴 수술 (n=4마리/군)에 처한 비히클 또는 C75 처리 생쥐의 추가의 군을 AMPK 및 pAMPK 수준의 분석을 위하여 뇌졸중 이후 4시간 (도 7B) 또는 24시간 (도 7C)에 희생시켰다. 재관류 2시간에서의 예기되는 pAMPK 증가는, pAMPK 수준의 증가가 C75 처리에 의해 둔화되기는 하지만, C75 처리 및 비히클 처리 생쥐 둘 모두에서 보였다 (각각 도 7B의 레인 1 및 2 대 레인 5 및 6). 화합물 C에서와 같이, pAMPK 수준 증가의 감소는 비허혈성 좌측 반구 (L)에 비하여 허혈성 우측 반구 (R)에서 보다 두드러졌다. 비히클 처리 생쥐에 비하여, C75는 뇌졸중 이후 24시간에 샴 및 뇌졸중 생쥐 둘 모두에서 현저하게 pAMPK 수준을 감소시켰는데 (각각 도 7C의 레인 1-4 대 레인 5-8), 이는 pAMPK 수준의 감소에 있어서의 (화합물 C에 비하여) C75의 보다 지속되는 중추적 영향을 나타내는 것이다.

도 5A에 도시되어 있는 바와 같이, C-75 처리군에서 총 경색 볼륨 및 국부적 경색 볼륨이 유의하게 감소됨이 나타났다 (P<0.001). 레이저 도플러에 의해 측정되는 바와 같이 허혈중 또는 재관류 혈류량에서는 유의한 차이가 전혀 없었으며, 비생존성 코호트 (n=4, 데이터는 예시되어 있지 않음)에서 MAP, pH 또는 혈액의 가스 측정치에서 차이가 전혀 보이지 않았다. 2시간의 MCAO (n=6마리/군) 또는 샴 수술 (n=4마리/군)에 처한 비히클 또는 C75 처리 생쥐의 추가의 군을 AMPK 및 pAMPK 수준의 분석을 위하여 뇌졸중 후 4시간 (도 5B) 또는 24시간 (도 5C)에 희생시켰다. 재관류 2시간에서의 예기되는 pAMPK 증가가 비히클 및 C75 처리 생쥐 둘 모두에서 보였다. pAMPK 수준의 감소는 샴 및 뇌졸중 생쥐 둘 모두에서 24시간에서 C75 처리 동물에서 보이는데, 이는 pAMPK 감소에 있어서 (화합물 C에 비하여) C75의 보다 지속되는 중추적인 영향을 증거로 입증하는 것이다.

AMPK 활성제 5- 아미노이미다졸 -4- 카르복스아미드 리보뉴클레오시드 (AICAR)를 이용한 AMPK 활성화는 뇌졸중을 악화시킨다.

널리 사용되는 AMPK 활성제, 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보뉴클레오시드 (AICAR) (문헌[Corton, et al., Eur J Biochem, 229, 558-565 (1995)] 참조)를 뇌졸중 발병 시점에서 투여하였다 (500 mg/kg i. p.; n=11/군). AICAR는 세포 내로 흡수되며 인산화되어 ZMP를 형성하는데, 이는 AMPK 활성화에 대한 AMP의 영향을 모방한다. AICAR-처리 동물에서 총 뇌졸중 볼륨 및 피질 (CTX) 뇌졸중 볼륨이 유의하게 악화되었다 (도 8A). 생리학적 모니터링에 의하면 주사 후 15분까지 자가 보정된 AICAR 처리 동물에서의 평균 동맥 압력 (mean arterial pressure, MAP)에서의 유의한 강하가 입증되었다 (MAP 비히클 84 대 AICAR 69 mmHg, p<0.05). 허혈중 CBF에서는 차이가 전혀 없었지만, 재관류 후 30분에서 대조에 비하여 AICAR-처리 생쥐에서 CBF의 감소가 보였다 (기준선의 82.7%에 대하여 98%, p<0.05). 이는, AMPK에 대한 영향 외에도, AICAR의 유해한 영향의 일부가 관류 압력 감소에 이차적일 수도 있음을 시사하는 것이다. 웨스턴 블롯 분석에 의하면 비히클 처리 동물에 대하여 AICAR 처리 동물에서 뇌졸중 이후 4시간에 (재관류 2시간) pAMPK가 상승됨이 나타났는데 (각각 도 8B의 레인 5-8 대 레인 1-4), 이는 24시간까지는 기준선으로 되돌아갔다 (데이터는 예시되어 있지 않음).

nNOS 의 손실은 pAMPK 에 있어서의 뇌졸중-유도된 상승을 방지한다

ONOO (퍼옥시니트라이트)는 뇌졸중-유발성 뉴런 손상에 대하여 상당한 기여자이며, AMPK는 시험관 내에서 저산소증 뿐만 아니라 ONOO에 의해 활성화되기 때문에, 본 발명자들은 뇌졸중 후 AMPK 활성화에 있어서의 뉴런 NOS (nNOS)의 역할을 평가하였다. nNOS 넉아웃 (knockout) 동물은 주로 ONOO 생성에 있어서의 감소로 인하여, 그의 야생형 상대물보다 경색이 유의하게 더 적다. 본 발명자들은 본 발명자들의 MCAO 모델에서 nNOS 결실의 신경 보호 효과를 확인하였다 (총 경색 볼륨: WT에서 55.8±4.9%; nNOS-/-에서 31.94%; p<0.01). 수컷 nNOS-/- 및 야생형 (WT) 생쥐를 우측 MCAO에 처하고, 경색 이후 (재관류 22시간) 4시간 (도 9A) 또는 24시간 (도 9B)에 뇌를 수확하였다. 4시간에서, WT 생쥐는 허혈성 (우측, R) 및 비허혈성 (좌측, L) 반구 둘 모두에서 WT 샴에 비하여 pAMPK의 상승을 나타내었다. 그러나, nNOS-/- 생쥐에 있어서, pAMPK 수준의 뇌졸중-유도된 상승은 저지되었으며, pAMPK 수준은 샴과 유사하였다. 유사한 결과가 24시간에서 발견되었다 (도 9B). 인산화 Akt의 수준이 경색 후 24시간에서 (재관류 22시간) WT에 비하여 nNOS-/- 생쥐에서 또한 감소하였는데, 이는 Akt, AMPK, 및 NOS간의 가능한 관계를 시사하는 것이다 (도 9C).

nNOS-/- 생쥐에서의 AMPK 활성화의 감소가 단순히 이 주 (strain)에서 보여지는 허혈성 손상 감소를 반영하는 것일 수도 있기 때문에, 본 발명자들은 DNA ㅂ복구 효소인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제-1 결함성 수컷 생쥐 (PARP-1 넉아웃 생쥐)를 또한 조사하였는데, 이는 뇌졸중 볼륨 감소가 nNOS-/- 수컷 생쥐와 유사하였다 (도 10). 놀랍게도, PARP-1 결함성 생쥐는 보다 적은 경색에도 불구하고 그의 개개의 WT에 비하여 허혈성 반구에서의 pAMPK 활성화 수준이 유사하였다 (도 10, 허혈성 반구만이 도시되어 있음). 이는 nNOS 결함성 생쥐에서 보여지는 NO 또는 ONOO 생성에 있어서의 감소가 AMPK 활성화의 선택적인 개선에 이른다는 것을 시사하는 것이다.

Claims (9)

1. 신경 보호 방법으로서, 뇌졸중, 또는 다른 병인에 의한 기타 뇌혈류 차단을 경험하고 있거나 경험한 대상에게 AMP-활성화 단백질 키나아제 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 저해제인 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 화합물이 펩티드 또는 기타 생물학적 또는 생물학적 유래 물질 이외의 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 화합물이 C75인 방법.
4. 제2항에 있어서, 화합물이 화합물 C인 방법.
5. 제2항에 있어서, 화합물이 C75 또는 화합물 C 이외의 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 화합물이 작은 분자인 방법.
7. AMPK 저해제를 함유하는 뇌졸중 치료용 약학 조성물.
8. 제7항에 있어서, AMPK 저해제가 직접적 저해제인 약학 조성물.
9. 제7항에 있어서, AMPK 저해제가 간접적 저해제인 약학 조성물.

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